Name: in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 ו Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (ל- H.P.), מענק מחקר Harf Mechtild מקרן DKMS למתן חיים (ל- H.P.) פרס חוקר צעיר על ידי ברית המחקר מלנומה (ל- S.H.), מלגה על ידי Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (ל- F.S.), מלגה על ידי Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (ל- F.S.), קרן זרעים של האוניברסיטה הטכנית מינכן (ל- S.H.) ומענק מחקר על ידי קרן וילהלם סנדר (2021.041.1, ל- S.H.). H.P. נתמך על ידי תוכנית החוקרים הצעירים של EMBO.
תרומות מחבר:
F.S., H.P., ו S.H. עיצבו את המחקר, ניתחו ופירשו את התוצאות. פ.ס. וס.ה. כתבו את כתב היד. ה.פ. ו-ס.ה. הנחו את המחקר.

בתחילת הניסויים, עכברים היו לפחות 6 שבועות של גיל נשמרו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן. הפרוטוקול הנוכחי עומד בסטנדרטים האתיים המוסדיים ובתקנות המקומיות השוררות. מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הסוכנות הרגולטורית המקומית (Regierung von Oberbayern, מינכן, גרמניה). הטיות אפשריות הקשורות למין לא נחקרו במחקרי...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy.">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li><li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death.">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).</li><li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8++T+cell+responses+through+CD8{alpha}++dendritic+cells.">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li><li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy.">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity.">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li><li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin.">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer:+What+are+the+potential+clinical+ramifications.">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression.">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li><li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming.">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li><li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses.">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li><li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs.">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li><li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity.">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li><li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade.">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).</li><li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity.">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy.">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+storage+stability+of+extracellular+vesicles+for+therapeutic+applications.">Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+extracellular+vesicles+in+fresh+plasma.">Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice.">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li><li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma.">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation.">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li><li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shedding+of+CD62L+(L-selectin)+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes.">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).</li><li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines.">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).</li><li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer.">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li><li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions.">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li></ol>

פרוטוקול זה מספק הערכה אימונולוגית של vivo של כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי מלנומה תחת לחץ הנגרמת על ידי כימותרפיה תוך הסתגלות לרכבים חשמליים הנפלטים מסרטן שונים תחת טיפולים שונים. חיסון עכברים עם רכבים חשמליים המופקים מתאי B16-OVA שטופלו באוקסליפלטין, למשל, מרחיב את תאי CD8+ T המייצרים ...

המערכת החיסונית ממלאת תפקיד מרכזי במאבק נגד סרטן, הן כאשר הוא מועלה על ידי עיכוב מחסום חיסוני והן על היעילות של טיפולים קונבנציונליים לסרטן. תאים סרטניים שנכנעים לטיפולים גנוטוקסיים כגון הסוכנים הכימותרפיים אוקסליפלטין ודוקסורוביצין, או טיפול קרינה מייננת יכולים לשחרר אנטיגנים ודפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה (DAMPs) שעשויים ליזום תגובה חיסונית נוגדת גידולים הסתגלות1. ה- DAMPs הבולטים ביותר, בהקשר של מוות תאי אימונוגני, כוללים אותות find-me כגון ATP כימוטקטי, אותות eat-me כגון חשיפת calreticulin, המקדם את ספיגת תאי הגידול על ידי תאים המציגים אנטיגן, ואת שחרורו של HMGB1, המפעיל קולטני זיהוי דפוס, ובכך משפר את ההצגה הצולבת של אנטיגנים גידול2. יתר על כן, סוג I אינטרפרונים (IFN-I), המושרה באמצעות חומצות גרעין אימונוגניות שמקורן בגידול או גירויים אחרים, חשים על ידי תאים דנדריטיים, ומאפשרים להם ביעילות ראשונית תאי T ציטוטוקסיים ספציפיים לגידול3,4. מבחינה קלינית, תאי CD8+ T פעילים ומתרבים החודרים לגידול מספקים גורם פרוגנוסטי עצמאי להישרדות ממושכת בחולי סרטן רבים. שוחרר מתאי T מופעלים כאלה, IFN-γ מתווך השפעות אנטי-פרוליפרטיביות ישירות על תאים סרטניים ומניע את הקיטוב Th1 ובידול תאי T ציטוטוקסיים, ובכך תורם לחיסון יעיל נגד סרטן5,6. Oxaliplatin הוא ממריץ מוות תאי אימונוגני בתום לב, מתווך תגובה חיסונית אדפטיבית כזו נגד סרטן7. עם זאת, שפע של אותות אימונוגניים ראשוניים שפורסמו על ידי תאים סרטניים תחת לחץ המושרה על ידי טיפול נשאר להיחשף במלואו. למרות התקדמות משמעותית באימונותרפיה של סרטן, הרחבת היתרונות שלה לחלק גדול יותר של חולים נשאר אתגר. הבנה מפורטת יותר של אותות אימונוגניים היוזמים הפעלת תאי T עשויה להנחות את התפתחותם של טיפולים חדשניים.
קבוצה הטרוגנית של מבנים סגורים ממברנה, המכונה שלפוחיות חוץ תאיות (EVs), נראה לשמש התקני תקשורת בין תאיים. רכבים חשמליים הנפלטים כמעט מכל סוגי התאים נושאים חלבונים פונקציונליים, RNA, DNA ומולקולות אחרות לתא נמען או עשויים לשנות את מצבו התפקודי של התא רק על ידי קשירה לקולטנים על פני התא. המטען הפעיל ביולוגית שלהם משתנה באופן משמעותי לפי סוג ומצבו התפקודי של התא המפיק8. באימונולוגיה של סרטן, רכבים חשמליים המשתחררים מתאי הגידול נחשבו בעיקר כיריבים לאימונותרפיה מכיוון שהם בסופו של דבר מקדמים צמיחה פולשנית, נישות גרורתיות טרום-צורה9 ומדכאים את התגובה החיסונית10. לעומת זאת, מספר מחקרים הראו כי רכבים חשמליים יכולים להעביר אנטיגנים של גידולים לתאים דנדריטיים להצגה צולבת יעילה11,12. רכבים חשמליים עשויים לספק חומצות גרעין אימונוסטימולטוריות אם הם מגיחים תחת לחץ הנגרמת על ידי טיפול, מה שמקל על תגובה חיסונית נגד גידולים13,14. לאחרונה הוכח כי חישה של ליגנדים חיסוניים מולדים מסוג RNA ודנ"א במיקרו-סביבה של הגידול מווסתת את ההיענות למצור נקודת הביקורת באופן משמעותי 15,16,17. לפיכך, התפקיד האימונוגני של רכבים חשמליים ששוחררו על ידי תאים סרטניים תחת לחץ טיפולי שונה צריך להיות מובהר עוד יותר. מכיוון שרכבים חשמליים מהווים תחום מחקר צעיר אך צומח, התקינה של השיטות עדיין נמשכת. לכן, שיתוף ידע חיוני כדי לשפר את רבייה המחקר על אינטראקציות בין כלי רכב חשמליים אימונולוגיה סרטן. לאור זאת, כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט להערכת ההשפעה האימונוגנית של רכבים חשמליים שמקורם בגידול ב- vivo.
הערכה זו מתבצעת על ידי יצירת רכבים חשמליים שמקורם בגידול, חיסון עכברי נמענים עם רכבים חשמליים אלה, וניתוח תאי T טחול באמצעות ציטומטריית זרימה. דור EV מבוצע באופן אידיאלי על ידי זריעת תאי גידול מורין במדיום תרבית תאים ללא EV לרמה גבוהה של טוהר. תאים מטופלים עם גירוי סטרס תאי ספציפי, כגון כימותרפיה, כדי להשוות את ההשפעה של רכבים חשמליים הנגרמים על ידי טיפול נגד אימונוגניות בסיסית של רכבים חשמליים שמקורם בגידול בהתאמה. בידוד של רכבים חשמליים עשוי להתבצע בהחלט על ידי טכניקות שונות שיש לבחור על פי תחולת vivo וזמינות מקומית. הפרוטוקול הבא מתאר בדיקה מבוססת משקעים עם ערכה מסחרית לטיהור EV. עכברים מחוסנים פעמיים עם הרכבים החשמליים האלה. 14 ימים לאחר הזריקה הראשונה, תאי T מופקים מהטחול ומנותחים לייצור IFN-γ באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להעריך תגובה חיסונית מערכתית. עם זאת, הפוטנציאל של רכבים חשמליים שמקורם בגידול, המתעוררים תחת משטרים טיפוליים שונים, כדי לגרום לתגובות תאי T אנטי סרטניים מוערך בקלות יחסית, במהירות, ועם תוקף גבוה13. לכן, שיטה זו מתאימה להקרנה אימונולוגית של רכבים חשמליים שמקורם בתאים סרטניים בתנאים שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100204</td>
			<td>Clone 17A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 PacBlue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100428</td>
			<td>Clone GK1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN&#947; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>RM90022</td>
			<td>Clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420601</td>
			<td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>EASYstrainer 100 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>407952</td>
			<td>From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &#8805; 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>vac-pova</td>
			<td>Ovalbumine with &#60; 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Pharmacy of MRI hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1514-122</td>
			<td>Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate, &#8805; 99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF filter, 0,22 &#181;m, for syringes</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Filter Unit 0.22 &#181;m Durapore PVDF Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 26 G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305501</td>
			<td>1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Exosome Isolation Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478359</td>
			<td>For isolation from cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>31350</td>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells

מוות תאי אימונוגני של גידולים, הנגרם על ידי כימותרפיה או הקרנה, יכול לעורר תגובות תאי T ספציפיים לגידול על ידי שחרור דפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה וגרימת הייצור של סוג I אינטרפרון. אימונותרפיות, כולל עיכוב נקודת ביקורת, מסתמכות בעיקר על תאי T קיימים הספציפיים לגידול כדי לפתח אפקט טיפולי. לפיכך, גישות טיפוליות סינרגטיות המנצלות מוות תאי אימונוגני כחיסון אנטי-סרטני מהותי עשויות לשפר את יכולת התגובה שלהן. עם זאת, הספקטרום של גורמים אימונוגניים ששוחררו על ידי תאים תחת לחץ המושרה על ידי טיפול נשאר מאופיין באופן חלקי, במיוחד לגבי שלפוחיות חוץ תאיות (EVs). רכבים חשמליים, חלקיקים מממברניים בקנה מידה ננומטרי הנפלטים כמעט מכל התאים, נחשבים כמקלים על תקשורת בין-תאית, ובסרטן, הוכחו כמתווכים בין-ראשוניים נגד אנטיגנים של גידולים. כדי להעריך את ההשפעה החיסונית של רכבים חשמליים שמקורם בגידולים בתנאים שונים, שיטות הסתגלות, מדרגיות ותקיפות מבוקשות. לכן, כאן מוצגת גישה קלה וחזקה יחסית להערכת האימונוגניות של רכבים חשמליים . הפרוטוקול מבוסס על ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי T טחול לאחר חיסון vivo של עכברים עם רכבים חשמליים, מבודד על ידי בדיקות מבוססות משקעים מתרביות תאים סרטניים תחת טיפול או מצב יציב. לדוגמה, עבודה זו מראה כי חשיפה oxaliplatin של B16-OVA מורין מלנומה תאים הביא לשחרור של רכבים חשמליים אימונוגניים שיכולים לתווך את ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים תגובתי הגידול. לפיכך, הקרנה של כלי רכב חשמליים באמצעות חיסון vivo וציטומטריית זרימה מזהה תנאים שבהם כלי רכב חשמליים אימונוגניים יכולים לצאת. זיהוי תנאים של שחרור EV אימונוגני מספק תנאי הכרחי לבדיקת היעילות הטיפולית של רכבים חשמליים נגד סרטן ובחינת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים כדי לחשוף בסופו של דבר תובנות חדשות על תפקידם של כלי רכב חשמליים באימונולוגיה של סרטן.

פרוטוקול זה נועד להקל על הערכה פשוטה וקלה לשחזור של האימונוגניות של רכבים חשמליים שמקורם בגידול. בזאת, עכברים מחוסנים עם רכבים חשמליים הנגזרים מתרביות הפריה חוץ גופית של תאים סרטניים המבטאים את המודל אנטיגן עוף ovalbumin (OVA). התגובה החיסונית הבאה מנותחת בתאי T טחול באמצעות ציטומטריי?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

כתב יד זה מתאר כיצד להעריך במערכת החיסונית של vivo של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי הגידול (EVs) באמצעות ציטומטריית זרימה. רכבים חשמליים שמקורם בגידולים העוברים מוות תאי אימונוגני שנגרם כתוצאה מהטיפול נראים רלוונטיים במיוחד במערכון הגידול. פרוטוקול זה מדגים את ההערכה של אוקסליפלטין-induced emunostimulatory גידול EVs אבל יכול להיות מותאם להגדרות שונות.

ב-Vivo הקרנה אימונוגנית של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול על ידי ציטומטריית זרימה של תאי T טחול

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

וידאו זה מראה כיצד להעריך את האימונוגניות in vivo של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול, או רכבים חשמליים, באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטת ההקרנה המתוארת במסמך זה קלה יחסית לביצוע וניתן להתאים אותה להגדרות שונות. בסרטן, זיהוי תנאים של שלפוחית חוץ-תאית אימונוגנית משחרר רלוונטיות תרגומית מסוימת.ככזה, רכבים חשמליים אוטולוגיים עשויים לשמש כטיפולים מותאמים אישית נגד סרטן. מפגינה את החלק הראשון של ההליך תהיה טטיאנה Nedelko, עוזר טכני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל את ההכנה של מדיה תרבית התא הנדרשת עבור שלפוחית חוץ תאית, או EVs, לרוקן את רכבי בקר במדיה FCS על ידי ultracentrifugation ב 100, 000 פעמים g במשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.להשליך את הכדור לאחר צנטריפוגה. לקצור את תאי מלנומה B16 מורין המבטאים אלילבומין, או B16-OVA תאים, מן התרבות ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, זרעו את התאים בריכוז של 400, 000 תאים למיליליטר בתקשורת המרוקנת מרכב חשמלי.לאחר מכן, לטפל בתאי B16-OVA עם 30 מיקרוגרם של oxaliplatin למיליליטר ודגר במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם דגימות בקרה מטופלות. לאחר 24 שעות, לאסוף את supernatant לצנטריפוגה ב 400 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להשליך את הכדור לפני צנטריפוגה שוב ב 2, 000 פעמים g במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.לאחר השלכת הכדור, לסנן את supernatant באמצעות מסנן קרום PVDF 220 ננומטר לתוך צינור טרי. לאחר מכן, לערבב 1 מיליליטר של supernatant עם 0.5 מיליליטר של ריאגנט בידוד exosome זמין מסחרית ספציפית. מערבולת ולהעביר את התערובת לתוך צינורות 1.5 מיליליטר, ואחריו דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.למחרת, צנטריפוגה התערובת ב 10, 000 פעמים g במשך 60 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר השלכת בזהירות את supernatant, להסיר את הטיפות הנותרות על ידי הקשה על צינור 1.5 מיליליטר הפוך על מגבת נייר ועל ידי שאיפה דרך קצה דק של פיפטה מבלי לגעת גלולה EV בתחתית. resuspend את הכדור ב PBS קר על ידי צנרת למעלה ולמטה מבלי לגרד את הכדור עם הקצה.לאחר מכן, בריכה את הרכבים החשמליים מכל הצינורות. אם לא משתמשים באופן מיידי, לאחסן את ההשעיות EV ב 80 מעלות צלזיוס בכלי סיליקון עד 28 ימים עד היישום. כדי לחסן כל עכבר בקבוצת הטיפול עם רכבים חשמליים מבודדים מ 4.0 x 10 לתאי B16-OVA החמישי, לערבב 5 microliters של השעיית EV עם 55 מיקרוליטרים של PBS קר.לאחר מכן, מלא מזרקים רכובים עם מחטים 26 עד 30 מד עם 60 microliters של רכבים חשמליים מדוללים או PBS ולאחר מכן מיד לשים את המזרק על קרח. לחסן את הרכבים החשמליים או PBS תת עורית לתוך ההיבט המדיאלי של הירך של העכברים. חזור על החיסון לאחר שבעה ימים.14 ימים לאחר הטיפול הראשון, להקריב את העכברים לכרות את הטחול. לאחר מכן, מועכים את הטחול החתוך עם מסננת תאים לחה של 100 מיקרומטר ובוכנה מפלסטיק של מזרק. לשטוף את תאי הטחול לתוך צינור 50 מיליליטר עם 5 עד 10 מיליליטר של RPMI מלא מגניב.לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 400 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס לפני השלכת supernatant. כדי להסיר אריתרוציטים מן השעיית התא, resuspend ולדגור את גלולה התא עם 2 מיליליטר של מאגר תמוגת תאי הדם האדומים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להפסיק את התגובה על ידי הוספת חמישה עד 10 מיליליטר של RPMI מלא, ואחריו צנטריפוגה כפי שתואר קודם לכן.לאחר שימוש חוזר בגלולה התא ב- RPMI מלא, ספר את התאים מכל עכבר והנח את המשולשים של 200, 000 טחול עם 200 מיקרוליטרים של cRPMI לתוך כל באר של צלחת 96 באר עם תחתית בצורת U. לאחר מכן, לדגור על הצלחות במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 48 שעות, לטפל בתרבית התא עם 5 ננוגרם למיליליטר ברפלדין A, 20 ננוגרם למיליליטר PMA, ו 1 מיקרוגרם למיליליטר Ionomycin ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.לאחר הדגירה, להעביר את הטחול לצלחת 96-well עם תחתית בצורת V ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לשפץ את הטחול כדורי בתמיסת כתמים טרי מוכן לדגור על השעיית התא במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. לקיבעון וחדירות, לשטוף את הטחול פעמיים במאגר FACS ולאחר מכן resuspend הטחול ב 100 microliters לכל באר של קיבעון ופתרון חדירות, ואחריו דגירה בחושך כפי שהוסבר קודם לכן.להכתמת גמא האינטרפרון התאי, לשטוף את הטחול במאגר הקיבעון או permeabilization לפני שליחה חוזרת של התאים עם נוגדנים פלואורסצנטיים נגד אינטרפרון גמא מדולל 1:200 במאגר. לדגור על הטחול במשך 1 עד 12 שעות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר כביסה יסודית וחידוש ב- FACS-buffer, לנתח את ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים על פי אסטרטגיית gating המוסברת בכתב היד.בתמונה הייצוגית, מוצגת אסטרטגיית ההצטברות לניתוח ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים. התאים היו מגודרים כתאים בודדים, תת-קבוצה לימפוציטים, תאי T CD3-חיוביים קיימא, ותאי T ציטוטוקסיים CD8-חיובי CD8 שלילי CD4. הצטברות תאית של גמא אינטרפרון הוערך כסמן חלופי להפעלה.לאחר החיסון עם רכבים חשמליים הנגזרים מתאי הגידול, נחקר האינדוקציה של תגובות תאי T ספציפיים לאנטיגן בעכברים המטופלים. הרכבים החשמליים שמקורם בגידול מתורבתים בתנאי לחץ גנוטוקסיים, כגון טיפול באוקסליפלטין, גרמו להפעלה חזקה של תאי T ציטוטוקסיים הטחול בניגוד לרכבים חשמליים לא מטופלים. קבוצת בעלי החיים שטופלו ברכב הראתה את התגובה הנמוכה ביותר.ההפעלה של תאי T טחול נקבעה לאחר reimulation ex vivo או בנוכחות או היעדר אובלבומין. הייצור של גמא אינטרפרון הוגדל כאשר הטחול של בעלי חיים שטופלו בגידול EV הוחזרו עם מודל גידול אנטיגן סגלגל לפני הניתוח. שים לב כי תוצאות לשחזור מסתמכות על יעילות הבידוד המתמיד של כלי רכב חשמליים.לכן, ודא כי כדורי EV הם resuspended לחלוטין ומיד כדי למנוע ייבוש. עם פרוטוקול זה, הצלחנו לנתח מסלולים ספציפיים בתוך תאים סרטניים הקובעים את האימונוגניות של רכבים חשמליים שמקורם בתאי הגידול. זה עשוי לסלול את הדרך לרתום רכבים חשמליים אימונוגניים כאלה בטיפול בסרטן.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

סמים מבוססי Cytometry זרימה מערכת הסינון לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים התמיינות של תאי גזע גליובלסטומה

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום הנושאות גרנולוציט-מקרופאג' גורם מעורר מושבה מתאי גזע עובריים

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...