Name: in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 e Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (a H.P.), un Mechtild Harf Research Grant dalla DKMS Foundation for Giving Life (a H.P.) un Young Investigator Award dalla Melanoma Research Alliance (a S.H.), una borsa di studio della Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (a F.S.), un Seed Fund dell'Università Tecnica di Monaco (a S.H.) e una borsa di ricerca della Wilhelm Sander Foundation (2021.041.1, a S.H.). H. P. è supportato dall'EMBO Young Investigator Program.
CONTRIBUTI DELL'AUTORE:
F.S., H.P. e S.H. hanno progettato la ricerca, analizzato e interpretato i risultati. F.S. e S.H. scrissero il manoscritto. H.P. e S.H. hanno guidato lo studio.

All'inizio degli esperimenti, i topi avevano almeno 6 settimane di età e sono stati mantenuti in specifiche condizioni prive di agenti patogeni. Il presente protocollo è conforme agli standard etici istituzionali e alle normative locali vigenti. Gli studi sugli animali sono stati approvati dall'agenzia di regolamentazione locale (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania). Possibili pregiudizi legati al sesso non sono stati studiati in questi studi.
1. Generazione e isolamento di v...

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	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy.">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li><li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death.">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).</li><li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8++T+cell+responses+through+CD8{alpha}++dendritic+cells.">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li><li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy.">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity.">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li><li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin.">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer:+What+are+the+potential+clinical+ramifications.">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression.">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li><li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming.">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li><li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses.">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li><li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs.">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li><li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity.">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li><li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade.">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).</li><li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity.">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy.">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. 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F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice.">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li><li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma.">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation.">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li><li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shedding+of+CD62L+(L-selectin)+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes.">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).</li><li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines.">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).</li><li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer.">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li><li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions.">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li></ol>

Questo protocollo fornisce una valutazione immunologica in vivo dei veicoli elettrici derivati da cellule di melanoma sotto stress indotto dalla chemioterapia, adattandosi ai veicoli elettrici emessi da vari tumori sotto vari trattamenti. L'immunizzazione dei topi con EV derivati da cellule B16-OAV trattate con oxaliplatino, ad esempio, espande le cellule T CD8+ produttrici di IFN γ nella milza, che sono ulteriormente stimolate dall'incubazione ex vivo con ovoalbumina, indicando una risposta...

Il sistema immunitario svolge un ruolo fondamentale nella lotta contro il cancro, sia quando incitato dall'inibizione del checkpoint immunitario sia per l'efficacia delle terapie convenzionali contro il cancro. Le cellule tumorali che soccombono a terapie genotossiche come gli agenti chemioterapici oxaliplatino e doxorubicina o il trattamento con radiazioni ionizzanti possono rilasciare antigeni e modelli molecolari associati al pericolo (DMP) che potenzialmente avviano una risposta immunitaria antitumorale adattativa1. I DAMP più importanti, nel contesto della morte cellulare immunogenica, includono segnali find-me come ATP chemiotattico, segnali eat-me come l'esposizione di calreticulina, che promuove l'assorbimento delle cellule tumorali da parte delle cellule che presentano l'antigene, e il rilascio di HMGB1, che attiva i recettori di riconoscimento del pattern, migliorando così la presentazione incrociata degli antigeni tumorali2. Inoltre, gli interferoni di tipo I (IFN-I), indotti tramite acidi nucleici immunogenici derivati dal tumore o altri stimoli, sono rilevati dalle cellule dendritiche, consentendo loro di innescare efficacemente cellule T citotossiche specifiche del tumore3,4. Clinicamente, le cellule T CD8+ attivate e proliferanti che si infiltrano nel tumore forniscono un fattore prognostico indipendente per una sopravvivenza prolungata in molti pazienti oncologici. Rilasciato da tali cellule T attivate, l'IFN-γ media effetti antiproliferativi diretti sulle cellule tumorali e guida la polarizzazione Th1 e la differenziazione citotossica delle cellule T, contribuendo così a un'efficace immunosorveglianza contro il cancro5,6. L'oxaliplatino è un induttore di morte cellulare immunogenico in buona fede, che media tale risposta immunitaria adattativa contro il cancro7. Tuttavia, la pletora di segnali immunogenici iniziali rilasciati dalle cellule tumorali sotto stress indotto dalla terapia rimane da svelare completamente. Nonostante i significativi progressi nell'immunoterapia del cancro, espandere i suoi benefici a una porzione più ampia di pazienti rimane una sfida. Una comprensione più dettagliata dei segnali immunogenici che avviano l'attivazione delle cellule T può guidare lo sviluppo di nuove terapie.
Un gruppo eterogeneo di strutture racchiuse in membrana, note come vescicole extracellulari (EV), sembrano servire come dispositivi di comunicazione intercellulare. Emessi praticamente da tutti i tipi di cellule, gli EV trasportano proteine funzionali, RNA, DNA e altre molecole a una cellula ricevente o possono alterare lo stato funzionale di una cellula semplicemente legandosi ai recettori sulla superficie cellulare. Il loro carico biologicamente attivo varia significativamente in base al tipo e allo stato funzionale della cellula generatrice8. Nell'immunologia del cancro, i veicoli elettrici rilasciati dalle cellule tumorali sono stati prevalentemente considerati come avversari dell'immunoterapia perché alla fine promuovono la crescita invasiva, preformano nicchie metastatiche9 e sopprimono la risposta immunitaria10. Al contrario, alcuni studi hanno dimostrato che gli EV possono trasferire antigeni tumorali alle cellule dendritiche per un'efficace presentazione incrociata11,12. I veicoli elettrici possono fornire acidi nucleici immunostimolatori se emergono sotto stress indotto dalla terapia, facilitando una risposta immunitaria antitumorale13,14. Il rilevamento di tali ligandi immunitari innati di RNA e DNA nel microambiente tumorale ha recentemente dimostrato di modulare significativamente la reattività al blocco del checkpoint15,16,17. Quindi, il ruolo immunogenico degli EV rilasciati dalle cellule tumorali sotto diverso stress indotto dalla terapia deve essere ulteriormente chiarito. Poiché i veicoli elettrici costituiscono un campo di ricerca giovane ma in crescita, la standardizzazione dei metodi è ancora in corso. Pertanto, la condivisione delle conoscenze è essenziale per migliorare la riproducibilità della ricerca sulle interazioni tra veicoli elettrici e immunologia del cancro. Con questo in mente, questo manoscritto descrive un semplice protocollo per valutare l'effetto immunogenico dei veicoli elettrici derivati dal tumore in vivo.
Questa valutazione viene eseguita generando EV derivati dal tumore, immunizzando i topi riceventi con quei veicoli elettrici e analizzando le cellule T spleniche tramite citometria a flusso. La generazione di veicoli elettrici viene eseguita idealmente seminando cellule tumorali murine in un terreno di coltura cellulare privo di EV per un alto grado di purezza. Le cellule vengono trattate con uno specifico stimolo di stress cellulare, come la chemioterapia, per confrontare l'effetto dei veicoli elettrici indotti dalla terapia con l'immunogenicità basale dei rispettivi VEICOLI elettrici derivati dal tumore. L'isolamento dei veicoli elettrici può essere eseguito con varie tecniche che dovrebbero essere selezionate in base all'applicabilità in vivo e alla disponibilità locale. Il seguente protocollo descrive un test basato sulla precipitazione con un kit commerciale per la purificazione dei veicoli elettrici. I topi sono immunizzati due volte con quei veicoli elettrici. Quattordici giorni dopo la prima iniezione, le cellule T vengono estratte dalla milza e analizzate per la produzione di IFN-γ tramite citometria a flusso per valutare una risposta immunitaria sistemica. Con questo, il potenziale degli EV derivati dal tumore, che emergono sotto diversi regimi terapeutici, per indurre risposte antitumorali delle cellule T viene valutato in modo relativamente semplice, rapido e con elevata validità13. Pertanto, questo metodo è adatto per uno screening immunologico di veicoli elettrici derivati da cellule tumorali in varie condizioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100204</td>
			<td>Clone 17A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 PacBlue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100428</td>
			<td>Clone GK1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN&#947; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>RM90022</td>
			<td>Clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420601</td>
			<td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>EASYstrainer 100 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>407952</td>
			<td>From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &#8805; 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>vac-pova</td>
			<td>Ovalbumine with &#60; 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Pharmacy of MRI hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1514-122</td>
			<td>Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate, &#8805; 99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF filter, 0,22 &#181;m, for syringes</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Filter Unit 0.22 &#181;m Durapore PVDF Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 26 G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305501</td>
			<td>1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Exosome Isolation Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478359</td>
			<td>For isolation from cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>31350</td>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells

La morte cellulare immunogenica dei tumori, causata dalla chemioterapia o dall'irradiazione, può innescare risposte delle cellule T specifiche del tumore rilasciando modelli molecolari associati al pericolo e inducendo la produzione di interferone di tipo I. Le immunoterapie, compresa l'inibizione del checkpoint, si basano principalmente su cellule T tumorali specifiche preesistenti per dispiegare un effetto terapeutico. Pertanto, approcci terapeutici sinergici che sfruttano la morte cellulare immunogenica come vaccino anti-cancro intrinseco possono migliorare la loro reattività. Tuttavia, lo spettro dei fattori immunogenici rilasciati dalle cellule sotto stress indotto dalla terapia rimane incompletamente caratterizzato, specialmente per quanto riguarda le vescicole extracellulari (EV). Gli EV, particelle membranose su scala nanometrica emesse praticamente da tutte le cellule, sono considerati per facilitare la comunicazione intercellulare e, nel cancro, hanno dimostrato di mediare il cross-priming contro gli antigeni tumorali. Per valutare l'effetto immunogenico dei veicoli elettrici derivati da tumori in varie condizioni, sono ricercati metodi adattabili, scalabili e validi. Pertanto, qui viene presentato un approccio relativamente semplice e robusto per valutare l'immunogenicità in vivo dei veicoli elettrici. Il protocollo si basa sull'analisi citometrica a flusso di cellule T spleniche dopo immunizzazione in vivo di topi con EV, isolati da saggi basati sulla precipitazione da colture di cellule tumorali in terapia o condizioni di stato stazionario. Ad esempio, questo lavoro mostra che l'esposizione all'oxaliplatino delle cellule di melanoma murino B16-OVA ha provocato il rilascio di EV immunogenici che possono mediare l'attivazione delle cellule T citotossiche reattive al tumore. Quindi, lo screening dei veicoli elettrici tramite immunizzazione in vivo e citometria a flusso identifica le condizioni in cui i veicoli elettrici immunogenici possono emergere. L'identificazione delle condizioni di rilascio di EV immunogenici fornisce un prerequisito essenziale per testare l'efficacia terapeutica dei veicoli elettrici contro il cancro ed esplorare i meccanismi molecolari sottostanti per svelare in definitiva nuove intuizioni sul ruolo dei veicoli elettrici nell'immunologia del cancro.

Questo protocollo ha lo scopo di facilitare la valutazione diretta e facilmente riproducibile dell'immunogenicità dei veicoli elettrici derivati dal tumore. Con la presente, i topi vengono inoculati con EV derivati da colture in vitro di cellule tumorali che esprimono l'antigene modello di ovoalbumina di pollo (OVA). La successiva risposta immunitaria viene analizzata nelle cellule T spleniche tramite citometria a flusso.
La Figura 1 fornisce un...

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In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Questo manoscritto descrive come valutare l'immunogenicità in vivo delle vescicole extracellulari derivate dalle cellule tumorali (EV) utilizzando la citometria a flusso. Gli EV derivati da tumori sottoposti a morte cellulare immunogenica indotta dal trattamento sembrano particolarmente rilevanti nell'immunosorveglianza tumorale. Questo protocollo esemplifica la valutazione dei veicoli elettrici immunostimolatori del tumore indotti da oxaliplatino, ma può essere adattato a varie impostazioni.

In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Questo video mostra come valutare l'immunogenicità in vivo delle vescicole extracellulari derivate dal tumore, o EV, utilizzando la citometria a flusso. Il metodo di screening qui descritto è relativamente facile da eseguire e può essere adattato a varie impostazioni. Nel cancro, identificare le condizioni di rilascio di vescicole extracellulari immunogeniche di particolare rilevanza traslazionale.Come tale, i veicoli elettrici autologhi potrebbero essere utilizzati come trattamenti anti-cancro personalizzati. A dimostrare la prima parte della procedura sarà Tatiana Nedelko, assistente tecnica del mio laboratorio. Per iniziare la preparazione dei terreni di coltura cellulare necessari per le vescicole extracellulari, o EV, esaurire i veicoli elettrici bovini nei mezzi FCS mediante ultracentrifugazione a 100.000 volte g per 24 ore a 4 gradi Celsius.Scartare il pellet dopo la centrifugazione. Raccogliere le cellule murine del melanoma B16 che esprimono ovalbumina, o cellule B16-OAV, dalla coltura e lavare le cellule due volte con PBS. Quindi, seminare le cellule ad una concentrazione di 400.000 cellule per millilitro nel mezzo impoverito EV.Successivamente, trattare le cellule B16-OVA con 30 microgrammi di oxaliplatino per millilitro e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius con campioni di controllo non trattati. Dopo 24 ore, raccogliere il surnatante per centrifugare a 400 volte g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Scartare nuovamente il pellet prima della centrifugazione a 2.000 volte g per 30 minuti a 4 gradi Celsius.Dopo aver scartato il pellet, filtrare il surnatante attraverso un filtro a membrana PVDF a 220 nanometri in un tubo fresco. Quindi, mescolare 1 millilitro di surnatante con 0,5 millilitri di uno specifico reagente di isolamento degli esosomi disponibile in commercio. Vortice e trasferire la miscela in tubi da 1,5 millilitri, seguiti da incubazione notturna a 4 gradi Celsius.Il giorno successivo, centrifugare la miscela a 10.000 volte g per 60 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo aver scartato con cura il surnatante, rimuovere le gocce rimanenti picchiettando il tubo da 1,5 millilitri a testa in giù su un tovagliolo di carta e aspirando attraverso una punta fine di pipetta senza toccare il pellet EV sul fondo. Risospesso il pellet in PBS freddo tubando su e giù senza graffiare il pellet con la punta.Quindi, raggruppa i veicoli elettrici da tutti i tubi. Se non si utilizza immediatamente, conservare le sospensioni EV a 80 gradi Celsius in recipienti siliconati per un massimo di 28 giorni fino all'applicazione. Per immunizzare ogni topo nel gruppo di trattamento con EV isolati da 4,0 x 10 alla quinta cellula B16-OAV, mescolare 5 microlitri della sospensione EV con 55 microlitri di PBS freddo.Quindi, riempire le siringhe montate con aghi da 26 a 30 calibri con 60 microlitri dei veicoli elettrici diluiti o PBS e quindi mettere immediatamente la siringa sul ghiaccio. Inoculare i veicoli elettrici o PBS per via sottocutanea nell'aspetto mediale della coscia dei topi. Ripetere l'immunizzazione dopo sette giorni.14 giorni dopo il primo trattamento, sacrificare i topi per resecare la milza. Quindi, schiacciare la milza resecata con un filtro cellulare inumidito da 100 micrometri e lo stantuffo di plastica di una siringa. Sciacquare le celle spleniche in un tubo da 50 millilitri con 5-10 millilitri del fresco RPMI completo.Quindi, centrifugare le cellule a 400 volte g per cinque minuti a 4 gradi Celsius prima di scartare il surnatante. Per rimuovere gli eritrociti dalla sospensione cellulare, risospesciare e incubare il pellet cellulare con 2 millilitri del tampone di lisi dei globuli rossi per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, interrompere la reazione aggiungendo da cinque a 10 millilitri di RPMI completo, seguito dalla centrifugazione come descritto in precedenza.Dopo aver risospeso il pellet cellulare in RPMI completo, contare le cellule di ogni topo e posizionare i triplicati di 200.000 splenociti con 200 microlitri di cRPMI in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con un fondo a forma di U. Quindi, incubare le piastre per 48 ore a 37 gradi Celsius. Dopo 48 ore, trattare la coltura cellulare con 5 nanogrammi per millilitro Brefeldin A, 20 nanogrammi per millilitro PMA e 1 microgrammo per millilitro Ionomicina a 37 gradi Celsius per 4 ore.Dopo l'incubazione, trasferire gli splenociti su una piastra a 96 pozzetti con un fondo a forma di V e lavare le cellule due volte con PBS. Risospesciare gli splenociti pellettati nella soluzione colorante appena preparata e incubare la sospensione cellulare per 30 minuti a 4 gradi Celsius al riparo dalla luce. Per la fissazione e la permeabilizzazione, lavare gli splenociti due volte nel tampone FACS e quindi risospesare gli splenociti in 100 microlitri per pozzetto della soluzione di fissazione e permeabilizzazione, seguita da incubazione al buio come spiegato in precedenza.Per colorare l'interferone gamma intracellulare, lavare gli splenociti nel tampone di fissazione o permeabilizzazione prima di inviare nuovamente le cellule con gli anticorpi fluorescenti contro l'interferone gamma diluito 1:200 nel tampone. Incubare gli splenociti per 1-12 ore a 4 gradi Celsius al buio. Dopo un accurato lavaggio e risospensione nel tampone FACS, analizzare l'attivazione delle cellule T citotossiche secondo la strategia di gating spiegata nel manoscritto.Nell'immagine rappresentativa, viene visualizzata la strategia di gating per analizzare l'attivazione delle cellule T citotossiche. Le cellule sono state chiuse come le singole cellule, il sottoinsieme di linfociti, le cellule T CD3-positive vitali e le cellule T citotossiche CD8-positive CD4-negative. L'accumulo intracellulare dell'interferone gamma è stato valutato come marcatore surrogato per l'attivazione.Dopo l'immunizzazione con EV derivati dalle cellule tumorali, è stata studiata l'induzione delle risposte delle cellule T antigene-specifiche nei topi riceventi. I veicoli elettrici derivati dal tumore coltivati in condizioni di stress genotossico, come il trattamento con oxaliplatino, hanno indotto una potente attivazione delle cellule T citotossiche della milza in contrasto con i veicoli elettrici non trattati. Il gruppo di animali trattati con il veicolo ha mostrato la risposta più bassa.L'attivazione delle cellule T spleniche è stata determinata dopo la ristimolazione ex vivo in presenza o assenza di ovoalbumina. La produzione dell'interferone gamma è aumentata quando gli splenociti degli animali trattati con EV tumorale sono stati ristimati con l'ovoalbumina dell'antigene tumorale modello prima dell'analisi. Si prega di notare che i risultati riproducibili si basano sulla costante efficacia di isolamento dei veicoli elettrici.Pertanto, assicurarsi che i pellet EV siano risospesi interamente e prontamente per evitare l'essiccazione. Con questo protocollo, siamo stati in grado di analizzare percorsi specifici all'interno delle cellule tumorali che determinano l'immunogenicità degli EV derivati dalle cellule tumorali. Ciò potrebbe aprire la strada per sfruttare tali veicoli elettrici immunogenici nel trattamento del cancro.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per l'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Rilevazione in tempo reale nell'apoptosi delle cellule tumorali in Vitro indotta da CD8+ T cellule per studiare funzioni immuni soppressive di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolamento di vescicole extracellulari arricchite con esosomi che trasportano il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi da cellule staminali embrionali

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generazione di tumori pancreatici ortotopici e caratterizzazione ex vivo della citotossicità delle cellule T infiltranti di tumore

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...