Name: in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 및 Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (H.P.), DKMS Foundation for Giving Life (H.P.)의 Mechtild Harf Research Grant, Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (F.S.)의 장학금 인 Melanoma Research Alliance (S.H.)의 Young Investigator Award를 지원했습니다. 뮌헨 기술 대학 (S.H.)의 종자 기금과 빌헬름 샌더 재단 (2021.041.1, S.H.)의 연구 보조금. H. P.는 EMBO Young Investigator Program의 지원을 받습니다.
저자 기여 :
F.S., H.P., S.H.는 연구를 설계하고, 분석하고, 결과를 해석했습니다. F.S.와 S.H.는 원고를 썼다. H.P.와 S.H.가 연구를 이끌었다.

실험 개시시, 마우스는 적어도 6주령이었고, 특정 병원체가 없는 조건 하에서 유지되었다. 본 프로토콜은 제도적 윤리 기준과 통용되는 지역 규정을 준수합니다. 동물 연구는 현지 규제 기관 (Regierung von Oberbayern, 독일 뮌헨)의 승인을 받았습니다. 가능한 성 관련 편향은 이들 연구에서 조사되지 않았다.
1. 화학요법 노출 후 종양 세포로부터 유래된 EVs의 생성 및 분리
<ol><li>오?...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy.">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li><li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death.">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).</li><li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8++T+cell+responses+through+CD8{alpha}++dendritic+cells.">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li><li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy.">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity.">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li><li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin.">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer:+What+are+the+potential+clinical+ramifications.">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression.">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li><li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming.">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li><li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses.">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li><li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs.">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li><li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity.">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li><li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade.">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).</li><li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity.">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy.">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+storage+stability+of+extracellular+vesicles+for+therapeutic+applications.">Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+extracellular+vesicles+in+fresh+plasma.">Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice.">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li><li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma.">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation.">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li><li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shedding+of+CD62L+(L-selectin)+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes.">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).</li><li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines.">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).</li><li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer.">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li><li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions.">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li></ol>

이 프로토콜은 다양한 치료 하에서 다양한 암으로부터 방출되는 EV에 적응하면서 화학요법-유도된 스트레스 하에서 흑색종 세포로부터 유래된 EVs의 면역학적 생체내 평가를 제공한다. 옥살리플라틴-처리된 B16-OVA 세포로부터 유래된 EVs로 마우스를 면역화시키는 것은, 예를 들어, 비장에서 IFN-γ-생산 CD8+ T 세포를 확장시키고, 이는 오브알부민을 사용한 생체외 인큐베이션에 ?...

면역 체계는 면역 체크포인트 억제에 의해 유발될 때와 종래의 암 치료법의 효능에 대해 암과의 싸움에서 중추적인 역할을 한다. 화학요법제인 옥살리플라틴 및 독소루비신과 같은 유전독성 요법에 굴복하거나 이온화 방사선 치료로 인해 항원 및 잠재적으로 적응성 항종양 면역 반응을 개시하는 위험 관련 분자 패턴(DAMP)을 방출할 수 있다1. 면역원성 세포 사멸의 맥락에서 가장 두드러진 DAMPs는 화학주성 ATP와 같은 find-me 신호, 칼레티쿨린의 노출과 같은 먹거리-나 신호, 항원 제시 세포에 의한 종양 세포 흡수를 촉진하고, 패턴 인식 수용체를 활성화시켜 종양 항원의 교차 제시를 증진시키는 HMGB1의 방출을 포함한다2. 또한, 종양 유래 면역원성 핵산 또는 다른 자극을 통해 유도되는 I형 인터페론(IFN-I)은 수지상 세포에 의해 감지되어 종양 특이적 세포독성 T 세포를 효과적으로 프라이밍할 수 있게 한다3,4. 임상적으로, 활성화되고 증식하는 CD8+ T 세포는 종양에 침윤하여 많은 암 환자에서 장기간 생존을 위한 독립적인 예후 인자를 제공한다. 이러한 활성화된 T 세포로부터 방출된 IFN-γ은 암 세포에 대한 직접적인 항증식 효과를 매개하고 Th1 분극화 및 세포독성 T 세포 분화를 유도하여 암에 대한 효과적인 면역감시에 기여한다5,6. 옥살리플라틴은 암에 대한 이러한 적응성 면역 반응을 매개하는 선의의 면역원성 세포 사멸 유도제이다7. 그러나, 치료-유도된 스트레스 하에서 종양 세포에 의해 방출되는 초기 면역원성 신호의 과다함은 완전히 밝혀진 채로 남아 있다. 암 면역 요법의 상당한 발전에도 불구하고, 환자의 더 많은 부분에 그 혜택을 확대하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. T 세포 활성화를 개시하는 면역원성 신호에 대한 보다 상세한 이해는 새로운 치료법의 개발을 안내할 수 있다.
세포밖 소포 (EVs)로 알려진 막으로 둘러싸인 구조의 이종 그룹은 세포 간 통신 장치 역할을하는 것으로 보인다. 거의 모든 세포 유형에 의해 방출되는 EV는 기능적 단백질, RNA, DNA 및 기타 분자를 수용자 세포에 운반하거나 세포 표면의 수용체에 결합함으로써 세포의 기능 상태를 변경할 수 있습니다. 이들의 생물학적 활성 화물은 생성 세포의 유형 및 기능 상태에 따라 크게 달라진다8. 암 면역학에서, 종양 세포로부터 방출된 EV는 결국 침습적 성장을 촉진하고, 전이성 틈새를 형성하며9, 면역 반응을 억제하기 때문에 면역요법에 대한 적대적인 것으로 우세하게 간주되어 왔다10. 대조적으로, 일부 연구는 EV가 효과적인 교차 프리젠 테이션을 위해 종양 항원을 수지상 세포로 옮길 수 있음을 보여주었습니다11,12. EVs는 치료-유도된 스트레스 하에서 출현하는 경우 면역자극성 핵산을 제공할 수 있고, 항종양 면역 반응을 촉진시킨다13,14. 종양 미세환경에서 이러한 RNA 및 DNA 선천적 면역 리간드의 감지는 최근 체크포인트 봉쇄에 대한 반응성을 유의적으로 조절하는 것으로 나타났다15,16,17. 따라서, 상이한 요법-유도된 스트레스 하에서 종양 세포에 의해 방출되는 EVs의 면역원성 역할은 추가로 해명될 필요가 있다. EV는 젊지만 성장하는 연구 분야를 구성하기 때문에 방법의 표준화는 여전히 진행 중입니다. 따라서 EV와 암 면역학 간의 상호 작용에 대한 연구 재현성을 향상시키기 위해 지식을 공유하는 것이 필수적입니다. 이를 염두에두고,이 원고는 생체 내에서 종양 유래 EV의 면역원성 효과를 평가하기위한 간단한 프로토콜을 설명합니다.
이 평가는 종양 유래 EV를 생성하고, 수용자 마우스를 그 EV로 면역화하고, 유세포 분석기를 통해 비장 T 세포를 분석함으로써 수행됩니다. EV 생성은 뮤린 종양 세포를 높은 순도의 EV가 없는 세포 배양 배지에 시딩함으로써 이상적으로 수행된다. 세포는 화학요법과 같은 특정 세포 스트레스 자극으로 처리되어, 치료-유도된 EVs의 효과를 각각의 종양 유래 EVs의 기준선 면역원성과 비교한다. EV들의 단리는 생체내 적용가능성 및 국부적 이용가능성에 따라 선택되어야 하는 다양한 기술들에 의해 잘 수행될 수 있다. 다음 프로토콜은 EV 정제를 위한 상용 키트를 사용한 침전 기반 분석을 기술한다. 마우스는 EV로 두 번 예방 접종을받습니다. 첫 번째 주사 후 십사일 후, T 세포는 비장으로부터 추출되고 유세포 분석기를 통해 IFN-γ 생산을 분석하여 전신 면역 반응을 평가하였다. 이와 함께, 상이한 치료 요법 하에서 출현하는 종양 유래 EVs의 잠재성은 항종양 T 세포 반응을 유도하기 위해 비교적 쉽고, 신속하며, 높은 타당성으로 평가된다13. 따라서, 이 방법은 다양한 조건하에서 암 세포로부터 유래된 EVs의 면역학적 스크리닝에 적합하다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100204</td>
			<td>Clone 17A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 PacBlue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100428</td>
			<td>Clone GK1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN&#947; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>RM90022</td>
			<td>Clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420601</td>
			<td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>EASYstrainer 100 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>407952</td>
			<td>From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &#8805; 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>vac-pova</td>
			<td>Ovalbumine with &#60; 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Pharmacy of MRI hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1514-122</td>
			<td>Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate, &#8805; 99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF filter, 0,22 &#181;m, for syringes</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Filter Unit 0.22 &#181;m Durapore PVDF Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 26 G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305501</td>
			<td>1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Exosome Isolation Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478359</td>
			<td>For isolation from cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>31350</td>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells

화학요법 또는 방사선 조사에 의해 야기된 종양의 면역원성 세포 사멸은 위험-관련 분자 패턴을 방출하고 타입 I 인터페론의 생산을 유도함으로써 종양 특이적 T 세포 반응을 촉발시킬 수 있다. 체크포인트 억제를 포함한 면역요법은 주로 치료 효과를 전개하기 위해 기존의 종양 특이적 T 세포에 의존한다. 따라서, 면역원성 세포 사멸을 내재적 항암 백신으로서 이용하는 상승적 치료 접근법은 그들의 반응성을 향상시킬 수 있다. 그러나, 치료-유도된 스트레스 하에서 세포에 의해 방출되는 면역원성 인자의 스펙트럼은 특히 세포밖 소포(EVs)와 관련하여 불완전하게 특성화되어 있다. 거의 모든 세포에서 방출되는 나노 규모의 막성 입자 인 EVs는 세포 간 통신을 용이하게하는 것으로 간주되며, 암에서는 종양 항원에 대한 교차 프라이밍을 매개하는 것으로 나타났습니다. 다양한 조건하에서 종양으로부터 유래된 EVs의 면역원성 효과를 평가하기 위해, 적응가능하고, 확장 가능하고, 유효한 방법들이 요구된다. 따라서, 본원에서 EVs'의 생체내 면역원성을 평가하기 위해 비교적 쉽고 강력한 접근법이 제시된다. 이 프로토콜은 EVs로 마우스를 생체내 면역화한 후 비장 T 세포의 유세포 분석 분석에 기초하며, 치료 또는 정상 상태 조건 하에서 종양 세포 배양물로부터 침전 기반 분석에 의해 단리된다. 예를 들어, 이 연구는 B16-OVA 뮤린 흑색종 세포의 옥살리플라틴 노출이 종양 반응성 세포독성 T 세포의 활성화를 매개할 수 있는 면역원성 EVs의 방출을 가져왔다는 것을 보여준다. 따라서, 생체내 면역화 및 유동 세포측정법을 통한 EV의 스크리닝은 면역원성 EV가 출현할 수 있는 조건을 식별한다. 면역원성 EV 방출의 조건을 확인하는 것은 암에 대한 EV의 치료 효능을 테스트하고 암 면역학에서 EV의 역할에 대한 새로운 통찰력을 궁극적으로 공개하기 위해 근본적인 분자 메커니즘을 탐구하는 데 필수적인 전제 조건을 제공합니다.

이 프로토콜은 종양 유래 EVs의 면역원성의 간단하고 쉽게 재현가능한 평가를 용이하게 하기 위한 것이다. 이에 의해, 마우스는 모델 항원인 닭 난알부민(OVA)을 발현하는 종양 세포의 시험관내 배양물 로부터 유래된 EVs를 접종한다. 후속 면역 반응은 유세포 분석기를 통해 비장 T 세포에서 분석된다.
그림 1은 전체 프로토콜의 실제 단계에 대...

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In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

이 원고는 유세포 분석기를 사용하여 종양 세포 유래 세포밖 소포 (EVs)의 생체 내 면역원성을 평가하는 방법을 설명합니다. 치료를 받는 종양으로부터 유래된 EVs-유도된 면역원성 세포 사멸은 종양 면역감시에 특히 관련있는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 옥살리플라틴-유도된 면역자극성 종양 EVs의 평가를 예시하지만, 다양한 설정에 적응될 수 있다.

생체 내 비장 T 세포의 유세포 분석기에 의한 종양 유래 세포밖 소포의 면역원성 스크리닝

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

이 비디오는 유세포 분석기를 사용하여 종양 유래 세포밖 소포 또는 EVs의 생체내 면역원성을 평가하는 방법을 보여준다. 본원에 기재된 스크리닝 방법은 비교적 수행이 용이하고 다양한 설정에 적응될 수 있다. 암에서, 특정 번역 관련성의 면역원성 세포밖 소포 방출의 상태를 확인한다.따라서 자가 EV는 개인화 된 항암 치료제로 사용될 수 있습니다. 절차의 첫 번째 부분을 시연하는 것은 내 실험실의 기술 조수 인 Tatiana Nedelko입니다. 세포밖 소포 또는 EVs에 필요한 세포 배양 배지의 제조를 시작하기 위해, 섭씨 4도에서 24시간 동안 100, 000배 g에서 초원심분리에 의해 FCS 배지에서 소 EV를 고갈시킨다.원심분리 후 펠렛을 버린다. 배양물로부터 오브알부민 또는 B16-OVA 세포를 발현하는 뮤린 B16 흑색종 세포를 수확하고, PBS로 세포를 두 번 세척한다. 이어서, 세포를 EV 고갈 배지에서 밀리리터 당 400, 000 세포의 농도로 시드한다.다음으로, B16-OVA 세포를 밀리리터 당 30마이크로그램의 옥살리플라틴으로 처리하고, 처리되지 않은 대조군 샘플로 섭씨 37도에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 24시간 후, 상층액을 수집하여 섭씨 4도에서 5분 동안 400배 g에서 원심분리한다. 펠렛을 다시 원심분리하기 전에 폐기하고 섭씨 4도에서 30분 동안 2, 000회 g에서 폐기한다.펠렛을 폐기한 후, 상층액을 220 나노미터 PVDF 멤브레인 필터를 통해 신선한 튜브로 여과한다. 이어서, 1 밀리리터의 상청액을 상업적으로 이용가능한 특정 엑소좀 분리 시약의 0.5 밀리리터와 혼합한다. 소용돌이 혼합물을 1.5 밀리리터 튜브 내로 옮기고, 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션하였다.다음날, 혼합물을 섭씨 4도에서 60분 동안 10, 000배 g에서 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 버린 후, 종이 타월에 1.5 밀리리터 튜브를 거꾸로 두드리고, 바닥의 EV 펠릿을 만지지 않고 피펫의 미세한 끝을 통해 흡인하여 나머지 방울을 제거하십시오. 펠릿을 팁으로 긁지 않고 위아래로 피펫팅하여 차가운 PBS에 펠렛을 재현탁시킨다.그런 다음 모든 튜브에서 EV를 풀링합니다. 즉시 사용하지 않을 경우, EV 서스펜션을 실리콘 용기에 섭씨 80도에서 도포할 때까지 최대 28일 동안 보관하십시오. 4.0 x 10에서 단리된 EVs로 처리군의 각 마우스를 5번째 B16-OVA 세포로 면역화시키기 위해, 5 마이크로리터의 EV 현탁액을 55 마이크로리터의 차가운 PBS와 혼합한다.다음으로, 26 내지 30 게이지 바늘로 장착된 주사기를 희석된 EV 또는 PBS의 60 마이크로리터로 채운 다음, 즉시 주사기를 얼음 위에 놓는다. EV 또는 PBS를 마우스의 허벅지의 내측 측면에 피하 접종한다. 칠일 후에 예방 접종을 반복하십시오.첫 번째 치료 14 일 후, 비장을 절제하기 위해 마우스를 희생시킨다. 그런 다음 절제된 비장을 축축한 100마이크로미터 세포 스트레이너와 주사기의 플라스틱 플런저로 으깬다. 비장 세포를 5 ~ 10 밀리리터의 차가운 완전한 RPMI로 50 밀리리터 튜브에 플러시하십시오.다음으로, 상층액을 버리기 전에 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 400회 g에서 원심분리한다. 세포 현탁액으로부터 적혈구를 제거하기 위해, 세포 펠릿을 실온에서 5분 동안 적혈구 용해 완충액 2 밀리리터와 함께 재현탁하고 인큐베이션한다. 이어서, 다섯 내지 10 밀리리터의 완전한 RPMI를 첨가하여 반응을 중지시키고, 이어서 앞서 기술한 바와 같이 원심분리하였다.세포 펠릿을 완전한 RPMI에 재현탁시킨 후, 모든 마우스로부터의 세포를 계수하고, 200 마이크로리터의 cRPMI를 갖는 200, 000 개의 비장세포의 삼중항을 U자형 바닥을 갖는 96-웰 플레이트의 각 웰에 놓는다. 이어서, 플레이트를 섭씨 37도에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 48시간 후, 세포 배양물을 섭씨 37도에서 밀리리터 브레펠딘 A당 5나노그램, 밀리리터 PMA 당 20나노그램, 및 밀리리터 이오노마이신 당 1마이크로그램으로 4시간 동안 처리하였다.인큐베이션 후, 비장세포를 V자형 바닥을 갖는 96-웰 플레이트로 옮기고 PBS로 세포를 두 번 세척한다. 펠릿화된 비장세포를 갓 제조된 염색 용액에 재현탁시키고, 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 30분 동안 세포 현탁액을 인큐베이션한다. 고정 및 투과를 위해, 비장세포를 FACS-완충액에서 두 번 세척한 다음, 비장세포를 고정 및 투과 용액의 웰 당 100 마이크로리터에 재현탁시키고, 이어서 앞서 설명된 바와 같이 어둠 속에서 인큐베이션하였다.세포내 인터페론 감마를 염색하기 위해, 비장세포를 고정 또는 투과화 완충액에서 1:200으로 희석된 인터페론 감마에 대한 형광 항체로 세포를 재전송하기 전에 세척한다. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 1 내지 12시간 동안 비장세포를 배양한다. FACS-버퍼에서 철저한 세척 및 재현탁 후, 원고에 설명된 게이팅 전략에 따라 세포독성 T 세포의 활성화를 분석한다.대표적인 이미지에서, 세포독성 T 세포의 활성화를 분석하기 위한 게이팅 전략이 표시된다. 세포를 단일 세포, 림프구 서브세트, 생존가능한 CD3 양성 T 세포, 및 CD4 음성 CD8 양성 세포독성 T 세포로서 게이팅하였다. 인터페론 감마의 세포내 축적은 활성화를 위한 대리 마커로서 평가되었다.종양 세포로부터 유래된 EVs로 면역화시킨 후, 수용자 마우스에서 항원 특이적 T 세포 반응의 유도를 연구하였다. 옥살리플라틴 처리와 같은 유전독성 스트레스 조건 하에서 배양된 종양 유래 EVs는 처리되지 않은 EVs와는 대조적으로 비장 세포독성 T 세포의 강력한 활성화를 유도하였다. 비히클 처리된 동물군은 가장 낮은 반응을 보였다.비장 T 세포의 활성화는 난알부민의 존재 또는 부재 하에 생체외 재자극 후에 결정되었다. 인터페론 감마의 생산은 종양 EV 처리된 동물의 비장세포가 분석 전에 모델 종양 항원 오브알부민으로 재자극되었을 때 증가하였다. 재현 가능한 결과는 EV의 지속적인 분리 효능에 의존한다는 점에 유의하십시오.따라서 건조를 피하기 위해 EV 펠릿을 완전하고 신속하게 재현탁하십시오. 이 프로토콜을 통해 우리는 종양 세포 유래 EV의 면역원성을 결정하는 종양 세포 내의 특정 경로를 분석 할 수있었습니다. 이것은 암 치료에서 이러한 면역원성 EV를 활용하는 길을 열어 줄 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

연구

암 연구학

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

배아 줄기 세포에서 과립구-대식세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포의 격리

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...