Name: in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

Denne studien ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 og Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (til H.P.), et Mechtild Harf Research Grant fra DKMS Foundation for Giving Life (to H.P.) a Young Investigator Award av Melanoma Research Alliance (til S.H.), et stipend fra Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (til F.S.), et frøfond av Det tekniske universitetet münchen (til S.H.) og et forskningsstipend av Wilhelm Sander Foundation (2021.041.1, til S.H.). H. P. støttes av EMBO Young Investigator Program.
FORFATTERBIDRAG:
F.S., H.P. og S.H. designet forskningen, analyserte og tolket resultatene. F.S. og S.H. skrev manuskriptet. H.P. og S.H. ledet studien.

Ved begynnelsen av eksperimenter var mus minst 6 uker gamle og ble opprettholdt under spesifikke patogenfrie forhold. Den nåværende protokollen er i samsvar med institusjonelle etiske standarder og gjeldende lokale forskrifter. Dyrestudier ble godkjent av det lokale reguleringsorganet (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Mulige kjønnsrelaterte skjevheter ble ikke undersøkt i disse studiene.
1. Generering og isolering av elbiler avledet fra tumorceller etter kjemoterapieksponering<...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy.">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li><li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death.">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).</li><li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8++T+cell+responses+through+CD8{alpha}++dendritic+cells.">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li><li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy.">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity.">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li><li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin.">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer:+What+are+the+potential+clinical+ramifications.">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression.">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li><li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming.">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li><li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses.">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li><li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs.">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li><li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity.">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li><li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade.">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).</li><li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity.">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy.">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+storage+stability+of+extracellular+vesicles+for+therapeutic+applications.">Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+extracellular+vesicles+in+fresh+plasma.">Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice.">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li><li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma.">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation.">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li><li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shedding+of+CD62L+(L-selectin)+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes.">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).</li><li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines.">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).</li><li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer.">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li><li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions.">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li></ol>

Denne protokollen gir en immunologisk in vivo-vurdering av elbiler avledet fra melanomceller under kjemoterapiindusert stress mens de tilpasser seg elbiler som slippes ut fra ulike kreftformer under ulike behandlinger. Immunisering av mus med elbiler avledet fra oksaliplatinbehandlede B16-OVA-celler utvider for eksempel IFN-γ produserende CD8+ T-celler i milten, som ytterligere stimuleres av eks vivo-inkubasjon med ovalbumin, noe som indikerer en tumorspesifikk immunrespons. Påvisning av im...

Immunsystemet spiller en sentral rolle i kampen mot kreft, både når det oppfordres av immunkontrollpunkthemming og for effekten av konvensjonelle kreftbehandlinger. Tumorceller som bukker under for gentoksiske terapier som kjemoterapeutiske midler oxaliplatin og doksorubicin, eller ioniserende strålebehandling, kan frigjøre antigener og farerelaterte molekylære mønstre (DAMPer) som potensielt kan initiere en adaptiv anti-tumor immunrespons1. De mest fremtredende DAMP-ene, i sammenheng med immunogen celledød, inkluderer finn-meg-signaler som kjemosaktisk ATP, eat-me-signaler som eksponering av calreticulin, som fremmer tumorcelleopptak av antigen-presenterende celler, og utgivelsen av HMGB1, som aktiverer mønstergjenkjenningsreseptorer, og dermed forbedrer krysspresentasjonen av tumorantigener2. Videre er type I interferoner (IFN-I), indusert via tumor-avledede immunogene nukleinsyrer eller andre stimuli, følt av dendrittiske celler, slik at de effektivt kan prime tumorspesifikke cytotoksiske T-celler3,4. Klinisk gir aktiverte og prolifererende CD8+ T-celler som infiltrerer svulsten en uavhengig prognostisk faktor for langvarig overlevelse hos mange kreftpasienter. IFN-γ frigjøres fra slike aktiverte T-celler, og formidler direkte antiproliferative effekter på kreftceller og driver polarisering og cytotoksisk T-celledifferensiering, og bidrar dermed til effektiv immunosurveillans mot kreft5,6. Oxaliplatin er en bona fide immunogen celledødsinduser, som medierer slik adaptiv immunrespons mot kreft7. Imidlertid gjenstår mengden av innledende immunogene signaler utgitt av tumorceller under terapiindusert stress å bli fullstendig avduket. Til tross for betydelige fremskritt innen kreftimmunoterapi, er det fortsatt en utfordring å utvide fordelene til en større del av pasientene. En mer detaljert forståelse av immunogene signaler som initierer T-celleaktivering kan lede utviklingen av nye terapier.
En heterogen gruppe membran-lukkede strukturer, kjent som ekstracellulære vesikler (ELBILER), ser ut til å fungere som intercellulære kommunikasjonsenheter. Avgitt av nesten alle celletyper, bærer elbiler funksjonelle proteiner, RNA, DNA og andre molekyler til en mottakercelle eller kan endre cellens funksjonelle tilstand bare ved å binde seg til reseptorer på celleoverflaten. Deres biologisk aktive last varierer betydelig etter type og funksjonell tilstand av den genererende cellen8. I kreftimmunologi har elbiler frigjort fra tumorceller overveiende blitt ansett som motstandere av immunterapi fordi de til slutt fremmer invasiv vekst, preform metastatiske nisjer9 og undertrykker immunresponsen10. I motsetning har noen studier vist at elbiler kan overføre tumorantigener til dendrittiske celler for effektiv krysspresentasjon11,12. Elbiler kan gi immunostimulatoriske nukleinsyrer hvis de oppstår under terapiindusert stress, noe som letter en anti-tumor immunrespons13,14. Sensing av slike RNA og DNA medfødte immunligander i tumormikromiljøet har nylig vist seg å modulere respons på sjekkpunktblokaden betydelig15,16,17. Derfor må den immunogene rollen til elbiler som frigjøres av tumorceller under forskjellig terapiindusert stress, belyses ytterligere. Siden elbiler utgjør et ungt, men voksende forskningsfelt, pågår det fortsatt standardisering av metoder. Derfor er det viktig å dele kunnskap for å forbedre forskningens reproduserbarhet på interaksjoner mellom elbiler og kreftimmunologi. Med dette i tankene beskriver dette manuskriptet en enkel protokoll for å vurdere den immunogene effekten av tumoravledede elbiler in vivo.
Denne vurderingen utføres ved å generere tumoravledede elbiler, immunisere mottakermus med disse ELBIL-ene og analysere milt-T-celler via strømningscytometri. EV-generasjonen utføres ideelt av såing murine tumorceller i et EV-fritt cellekulturmedium for en høy grad av renhet. Celler behandles med en bestemt cellestress-stimulus, for eksempel kjemoterapi, for å sammenligne effekten av terapiinduserte elbiler mot baseline immunogenisitet av respektive tumoravledede elbiler. Isolering av elbiler kan godt utføres av ulike teknikker som bør velges i henhold til in vivo-anvendbarhet og lokal tilgjengelighet. Følgende protokoll beskriver en nedbørsbasert analyse med et kommersielt sett for EV-rensing. Mus immuniseres to ganger med disse elbilene. Fjorten dager etter den første injeksjonen ekstraheres T-celler fra milten og analyseres for IFN-γ produksjon via strømningscytometri for å evaluere en systemisk immunrespons. Med dette vurderes potensialet for tumoravledede elbiler, som dukker opp under forskjellige terapeutiske regimer, for å indusere anti-tumor T-celleresponser relativt enkelt, raskt og med høy gyldighet13. Derfor er denne metoden egnet for en immunologisk screening av elbiler avledet fra kreftceller under ulike forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100204</td>
			<td>Clone 17A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 PacBlue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100428</td>
			<td>Clone GK1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN&#947; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>RM90022</td>
			<td>Clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420601</td>
			<td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>EASYstrainer 100 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>407952</td>
			<td>From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &#8805; 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>vac-pova</td>
			<td>Ovalbumine with &#60; 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Pharmacy of MRI hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1514-122</td>
			<td>Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate, &#8805; 99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF filter, 0,22 &#181;m, for syringes</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Filter Unit 0.22 &#181;m Durapore PVDF Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 26 G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305501</td>
			<td>1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Exosome Isolation Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478359</td>
			<td>For isolation from cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>31350</td>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells

Immunogen celledød av svulster, forårsaket av kjemoterapi eller bestråling, kan utløse tumorspesifikke T-celleresponser ved å frigjøre farerelaterte molekylære mønstre og indusere produksjonen av type I interferon. Immunterapi, inkludert sjekkpunkthemming, er først og fremst avhengig av eksisterende tumorspesifikke T-celler for å utfolde en terapeutisk effekt. Dermed kan synergistiske terapeutiske tilnærminger som utnytter immunogen celledød som en iboende anti-kreftvaksine forbedre deres respons. Imidlertid forblir spekteret av immunogene faktorer utgitt av celler under terapiindusert stress ufullstendig karakterisert, spesielt med hensyn til ekstracellulære vesyrer (ELBILER). Elbiler, nano-skala membranøse partikler som slippes ut fra nesten alle celler, anses å lette intercellulær kommunikasjon og, i kreft, har vist seg å megle krysspriming mot tumorantigener. For å vurdere den immunogene effekten av elbiler avledet fra svulster under ulike forhold, er det søkt om tilpasningsdyktige, skalerbare og gyldige metoder. Derfor presenteres heri en relativt enkel og robust tilnærming for å vurdere ELBILERs in vivo immunogenisitet. Protokollen er basert på strømningscytometrianalyse av miltNiske T-celler etter in vivo-immunisering av mus med elbiler, isolert av nedbørsbaserte analyser fra tumorcellekulturer under terapi eller steady-state forhold. For eksempel viser dette arbeidet at oksaliplatineksponering av B16-OVA murin melanomceller resulterte i frigjøring av immunogene elbiler som kan megle aktiveringen av tumorreaktive cytotoksiske T-celler. Derfor identifiserer screening av elbiler via in vivo-immunisering og strømningscytometri forhold der immunogene elbiler kan dukke opp. Identifisering av tilstander for immunogen EV-utgivelse gir en viktig forutsetning for å teste ELBILERs terapeutiske effekt mot kreft og utforske de underliggende molekylære mekanismene for til slutt å avdekke ny innsikt i ELBILERs rolle i kreftimmunologi.

Denne protokollen er ment å lette den enkle og lett reproduserbare vurderingen av immunogenisiteten til tumoravledede elbiler. Herved er mus inokulert med elbiler avledet fra in vitrokulturer av tumorceller som uttrykker modellen antigen kylling ovalbumin (OVA). Den påfølgende immunresponsen analyseres i miltNiske T-celler via strømningscytometri.
Figur 1 gir en oversikt over de praktiske trinnene i hele protokollen. Siden arbeidet fokuserer ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Dette manuskriptet beskriver hvordan man vurderer in vivo immunogenisitet av tumorcelleavledede ekstracellulære vesyrer (EVs) ved hjelp av strømningscytometri. Elbiler avledet fra svulster som gjennomgår behandlingsindusert immunogen celledød virker spesielt relevante i tumorimmunosurveillans. Denne protokollen eksemplifiserer vurderingen av oksaliplatininduserte immunostimulatoriske tumor-elbiler, men kan tilpasses ulike innstillinger.

In Vivo Immunogenisitet Screening av tumor-avledede ekstracellulære vesicles av Flow Cytometry av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Denne videoen viser hvordan man vurderer in vivo-immunogenisiteten til tumoravledede ekstracellulære vesyrer, eller elbiler, ved hjelp av strømningscytometri. Screeningmetoden som er beskrevet her, er relativt enkel å utføre og kan tilpasses ulike innstillinger. Ved kreft, identifiserende tilstander av immunogene ekstracellulære vesicle utgivelser av spesiell translasjonell relevans.Som sådan kan autologe elbiler brukes som personlige antikreftbehandlinger. Å demonstrere den første delen av prosedyren vil være Tatiana Nedelko, en teknisk assistent fra laboratoriet mitt. For å starte utarbeidelsen av cellekulturmedier som kreves for ekstracellulær vesicle, eller ELBILER, tømmer du de bovine ELBIL-ene i FCS-medier ved ultracentrifugation ved 100.000 ganger g i 24 timer ved 4 grader Celsius.Kast pelletsen etter sentrifugering. Høst murin B16 melanomceller som uttrykker ovalbumin, eller B16-OVA celler, fra kulturen og vask cellene to ganger med PBS. Deretter frø cellene i en konsentrasjon på 400.000 celler per milliliter i EV-utarmede medier.Deretter behandler du B16-OVA-cellene med 30 mikrogram oksaliplatin per milliliter og inkuberer i 24 timer ved 37 grader Celsius med ubehandlede kontrollprøver. Etter 24 timer, samle supernatant å sentrifuge på 400 ganger g i fem minutter på 4 grader Celsius. Kast pelletsen før sentrifugering igjen ved 2000 ganger g i 30 minutter ved 4 grader Celsius.Etter å ha kastet pelletsen, filtrer supernatanten gjennom et 220 nanometer PVDF membranfilter i et friskt rør. Bland deretter 1 milliliter supernatant med 0,5 milliliter av et spesifikt kommersielt tilgjengelig eksosomisolasjonsreagens. Vortex og overfør blandingen til 1,5 milliliter rør, etterfulgt av overnatting inkubasjon ved 4 grader Celsius.Neste dag sentrifugerer blandingen ved 10.000 ganger g i 60 minutter ved 4 grader Celsius. Etter forsiktig å kaste supernatanten, fjern de resterende dråpene ved å trykke på 1,5 milliliterrøret opp ned på et papirhåndkle og ved aspirasjon gjennom en fin spiss av pipette uten å berøre EV-pelletsen nederst. Resuspend pellet i kald PBS ved pipettering opp og ned uten å skrape pellet med spissen.Deretter kan du samle elbilene fra alle rør. Hvis du ikke bruker umiddelbart, oppbevar EV-suspensjonene ved 80 grader Celsius i silikoniserte kar i opptil 28 dager til påføring. For å immunisere hver mus i behandlingsgruppen med elbiler isolert fra 4,0 x 10 til femte B16-OVA-celler, bland 5 mikroliter av EV-suspensjonen med 55 mikroliter kald PBS.Fyll deretter sprøyter montert med 26 til 30 gauge nåler med 60 mikroliter av de fortynnede ELBIL-ene eller PBS, og legg deretter sprøyten umiddelbart på is. Inokuler ELBILene eller PBS subkutant inn i mediale aspektet av musenes lår. Gjenta immuniseringen etter syv dager.14 dager etter den første behandlingen, ofre musene for å resect milten. Mos deretter den resekterte milten med en fuktet 100-mikrometer cellesil og plaststempelet til en sprøyte. Skyll miltcellene inn i et 50 milliliterrør med 5 til 10 milliliter av den kjølige komplette RPMI.Deretter sentrifugerer cellene ved 400 ganger g i fem minutter ved 4 grader Celsius før du kaster supernatanten. For å fjerne erytrocytter fra celleopphenget, resuspend og inkubere cellepelleten med 2 milliliter av den røde blodcellelysbufferen i fem minutter ved romtemperatur. Stopp deretter reaksjonen ved å legge til fem til 10 milliliter fullstendig RPMI, etterfulgt av sentrifugering som beskrevet tidligere.Etter å ha resuspendert cellepelleten i fullstendig RPMI, tell cellene fra hver mus og plasser triplikatene på 200 000 splenocytter med 200 mikroliter cRPMI i hver brønn av en 96-brønns plate med u-formet bunn. Deretter inkuberer du platene i 48 timer ved 37 grader Celsius. Etter 48 timer, behandle cellekulturen med 5 nanogram per milliliter Brefeldin A, 20 nanogram per milliliter PMA og 1 mikrogram per milliliter Ionomycin ved 37 grader Celsius i 4 timer.Etter inkubasjon, overfør splenocyttene til en 96-brønns plate med en V-formet bunn og vask cellene to ganger med PBS. Resuspend pelleted splenocytter i den nylagde fargingsløsningen og inkuber cellefjæringen i 30 minutter ved 4 grader Celsius beskyttet mot lys. For fiksering og permeabilisering, vask splenocyttene to ganger i FACS-bufferen og bruk deretter splenocyttene på nytt i 100 mikroliter per brønn av fikserings- og permeabiliseringsløsningen, etterfulgt av inkubasjon i mørket som forklart tidligere.For farging av intracellulær interferongamma, vask splenocyttene i fikserings- eller permeabiliseringsbufferen før du overfører cellene med fluorescerende antistoffer mot interferongamma fortynnet 1:200 i bufferen. Inkuber splenocyttene i 1 til 12 timer ved 4 grader Celsius i mørket. Etter grundig vask og resuspension i FACS-buffer, analyser aktiveringen av cytotoksiske T-celler i henhold til gatingstrategien forklart i manuskriptet.I det representative bildet vises gatingstrategien for å analysere aktiveringen av cytotoksiske T-celler. Cellene ble inngjerdet som enkeltceller, lymfocyttundergruppen, de levedyktige CD3-positive T-cellene og CD4-negative CD8-positive cytotoksiske T-celler. Den intracellulære opphopningen av interferongamma ble vurdert som surrogatmarkør for aktiveringen.Etter immuniseringen med elbiler avledet fra tumorcellene, ble induksjonen av antigenspesifikke T-celleresponser hos mottakermus studert. Tumor-avledede elbiler dyrket under gentoksiske stressforhold, som oksaliplatinbehandling, induserte potent aktivering av de miltniske cytotoksiske T-cellene i motsetning til ubehandlede elbiler. Den kjøretøybehandlede gruppen av dyr viste lavest respons.Aktiveringen av milt T-celler ble bestemt etter ex vivo-restimuleringen enten i nærvær eller fravær av ovalbumin. Produksjonen av interferongamma ble økt da splenocyttene av tumor EV-behandlede dyr ble restimulert med modellen tumor antigen ovalbumin før analysen. Vær oppmerksom på at reproduserbare resultater er avhengige av den konstante isolasjonseffekten av elbiler.Sørg derfor for at EV-pellets blir resuspendert helt og raskt for å unngå uttørking. Med denne protokollen var vi i stand til å analysere spesifikke veier i tumorceller som bestemmer immunogenisiteten til tumorcelleavledede elbiler. Dette kan bane vei for å utnytte slike immunogene elbiler i kreftbehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow cytometri-baserte narkotika Screening System for identifisering av små molekyler som fremmer differensiering av glioblastom stilk celler

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow cytometri å anslå leukemi stamceller i primære akutt myelogen leukemi og pasient-avledet-xenografts, diagnose og følge opp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping av Orthotopic Homograft (Syngeneic) av Murine primære KPC bukspyttkjertelen Ductal Adenocarcinoma av flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En Spheroid drapet analysen av bilen T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Utvinning av ekstracellulære blemmer fra hele vev

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Celle syklus-spesifikk måling av γH2AX og apoptose etter gentoksisk stress av Flow flowcytometri

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolering av exosome-beriket ekstracellulære vesikler som bærer granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor fra embryonale stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av Orthotopic bukspyttkjertel svulster og ex vivo karakterisering av tumor-infiltrere T Cell cytotoksisitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...