Name: in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação alemã de pesquisa) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 e Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (para H.P.), uma Bolsa de Pesquisa Mechtild Harf do DKMS Foundation for Giving Life (to H.P.) a Young Investigator Award pela Melanoma Research Alliance (to S.H.), uma bolsa de estudos do Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (para F.S.), um Fundo semente pela Universidade Técnica de Munique (para S.H.) e uma bolsa de pesquisa da Fundação Wilhelm Sander (2021.041.1, para S.H.). O H. P. é apoiado pelo Programa de Jovens Investigadores da EMBO.
CONTRIBUIÇÕES AUTORAIS:
F.S., H.P.e S.H. projetaram a pesquisa, analisaram e interpretaram os resultados. F.S. e S.H. escreveram o manuscrito. H.P. e S.H. guiaram o estudo.

No início dos experimentos, os camundongos tinham pelo menos 6 semanas de idade e eram mantidos em condições específicas sem patógenos. O presente protocolo está em conformidade com os padrões éticos institucionais e as regulamentações locais vigentes. Estudos em animais foram aprovados pela agência reguladora local (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). Possíveis vieses relacionados ao sexo não foram investigados nestes estudos.
1. Geração e isolamento de EVs derivados de...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy.">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li><li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death.">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).</li><li>Fuertes, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses.">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li><li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs.">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li><li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity.">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li><li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade.">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).</li><li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity.">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy.">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. 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F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice.">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li><li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma.">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation.">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li><li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shedding+of+CD62L+(L-selectin)+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes.">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).</li><li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines.">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).</li><li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer.">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li><li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions.">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li></ol>

Este protocolo fornece uma avaliação imunológica in vivo de EVs derivados de células de melanoma sob estresse induzido pela quimioterapia, adaptando-se aos EVs emitidos de vários cânceres sob vários tratamentos. Imunizar camundongos com EVs derivados de células B16-OVA tratadas com oxaliplatina, por exemplo, expande as células CD8+ T produtoras de IFN γ no baço, que são ainda mais estimuladas pela incubação ex vivo com abumina oval, indicando uma resposta imune específica para ...

O sistema imunológico desempenha um papel fundamental na luta contra o câncer, tanto quando incitado pela inibição do ponto de verificação imunológica quanto pela eficácia das terapias convencionais contra o câncer. Células tumorais sucumbindo a terapias genoóxicas como os agentes quimioterápicos oxaliplatina e doxorubicina, ou tratamento de radiação ionizante podem liberar antígenos e padrões moleculares associados ao perigo (DAMPs) que potencialmente iniciam uma resposta imune anti-tumor adaptativa1. Os DAMPs mais proeminentes, no contexto da morte das células imunogênicas, incluem sinais de achado-me, como o ATP chemotactic, sinais eat-me, como a exposição da calreticulina, que promove a captação de células tumorais por células que apresentam antígenos, e a liberação de HMGB1, que ativa receptores de reconhecimento de padrões, aumentando assim a apresentação cruzada de antígenos tumorais2. Além disso, os interferons tipo I (IFN-I), induzidos através de ácidos nucleicos imunogênicos derivados do tumor ou outros estímulos, são sentidos por células dendríticas, permitindo-lhes efetivamente prime células T citotóxica específicas do tumor3,4. Clinicamente, as células T CD8+ ativadas e proliferadas infiltradas no tumor fornecem um fator prognóstico independente para a sobrevivência prolongada em muitos pacientes com câncer. Liberadas dessas células T ativadas, o IFN-γ media efeitos antiproliferativos diretos nas células cancerosas e impulsiona a polarização th1 e a diferenciação de células T citotóxica, contribuindo assim para uma imunossulusão eficaz contra o câncer5,6. Oxaliplatin é um indutor de morte de células imunogênicas de boa fé, mediando tal resposta imune adaptativa contra o câncer7. No entanto, a infinidade de sinais imunogênicos iniciais liberados pelas células tumorais sob estresse induzido pela terapia continua a ser totalmente revelada. Apesar dos avanços significativos na imunoterapia contra o câncer, expandir seus benefícios para uma parcela maior de pacientes continua sendo um desafio. Uma compreensão mais detalhada dos sinais imunogênicos que iniciam a ativação de células T pode guiar o desenvolvimento de novas terapias.
Um grupo heterogêneo de estruturas fechadas por membrana, conhecidos como vesículas extracelulares (EVs), parecem servir como dispositivos de comunicação intercelulares. Emitidos por praticamente todos os tipos de células, os EVs carregam proteínas funcionais, RNA, DNA e outras moléculas para uma célula receptora ou podem alterar o estado funcional de uma célula apenas por ligação aos receptores na superfície celular. Sua carga biologicamente ativa varia significativamente pelo tipo e estado funcional da célula geradora8. Na imunologia do câncer, os EVs liberados das células tumorais têm sido predominantemente considerados contraditórios à imunoterapia porque eventualmente promovem o crescimento invasivo, nichos metastáticos pré-formados9 e suprimem a resposta imune10. Em contraste, alguns estudos têm demonstrado que os EVs podem transferir antígenos tumorais para células dendríticas para uma efetiva apresentação cruzada11,12. Os EVs podem fornecer ácidos nucleicos imunostimulatórios se surgirem sob estresse induzido pela terapia, facilitando uma resposta imune anti-tumor13,14. A detecção de tais ligantes imunológicos inatos de RNA e DNA no microambiente tumoral tem sido recentemente demonstrada para modular a responsividade ao bloqueio de ponto de verificação significativamente15,16,17. Assim, o papel imunogênico dos EVs liberados pelas células tumorais sob diferentes estresse induzidos pela terapia precisa ser ainda mais elucidado. Uma vez que os EVs constituem um campo jovem, mas crescente de pesquisa, a padronização dos métodos ainda está em curso. Portanto, compartilhar conhecimento é essencial para melhorar a reprodutibilidade da pesquisa nas interações entre EVs e imunologia do câncer. Com isso em mente, este manuscrito descreve um protocolo simples para avaliar o efeito imunogênico dos EVs derivados do tumor in vivo.
Essa avaliação é realizada através da geração de EVs derivados do tumor, imunizando camundongos receptores com esses EVs e analisando células T esplênicas através da citometria de fluxo. A geração EV é idealmente realizada pela semeadura de células tumorais murinas em um meio de cultura celular livre de EV para um alto grau de pureza. As células são tratadas com um estímulo específico de estresse celular, como a quimioterapia, para comparar o efeito de EVs induzidos por terapia com a imunogenicidade da linha de base dos respectivos EVs derivados do tumor. O isolamento dos EVs pode muito bem ser realizado por diversas técnicas que devem ser selecionadas de acordo com a aplicabilidade in vivo e disponibilidade local. O protocolo a seguir descreve um ensaio baseado em precipitação com um kit comercial para purificação de EV. Os ratos são imunizados duas vezes com esses EVs. Quatorze dias após a primeira injeção, as células T são extraídas do baço e analisadas para produção de ifn-γ através de citometria de fluxo para avaliar uma resposta imune sistêmica. Com isso, o potencial de EVs derivados do tumor, emergindo sob diferentes regimes terapêuticos, para induzir respostas células T anti-tumor é avaliado relativamente facilmente, rapidamente e com alta validade13. Portanto, este método é adequado para um rastreamento imunológico de EVs derivados de células cancerosas em várias condições.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100204</td>
			<td>Clone 17A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 PacBlue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100428</td>
			<td>Clone GK1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN&#947; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>RM90022</td>
			<td>Clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420601</td>
			<td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>EASYstrainer 100 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>407952</td>
			<td>From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &#8805; 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>vac-pova</td>
			<td>Ovalbumine with &#60; 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Pharmacy of MRI hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1514-122</td>
			<td>Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate, &#8805; 99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF filter, 0,22 &#181;m, for syringes</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Filter Unit 0.22 &#181;m Durapore PVDF Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 26 G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305501</td>
			<td>1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Exosome Isolation Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478359</td>
			<td>For isolation from cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>31350</td>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells

A morte de células imunogênicas de tumores, causada por quimioterapia ou irradiação, pode desencadear respostas de células T específicas do tumor, liberando padrões moleculares associados ao perigo e induzindo a produção de interferon tipo I. As imunoterapias, incluindo a inibição do ponto de verificação, dependem principalmente de células T específicas do tumor pré-existentes para desdobrar um efeito terapêutico. Assim, abordagens terapêuticas sinérgicas que exploram a morte celular imunogênica como uma vacina anticânclica intrínseca podem melhorar sua capacidade de resposta. No entanto, o espectro de fatores imunogênicos liberados pelas células sob estresse induzido pela terapia permanece incompletamente caracterizado, especialmente no que se refere às vesículas extracelulares (EVs). EVs, partículas membranous nano-escala emitidas de praticamente todas as células, são consideradas para facilitar a comunicação intercelular e, no câncer, têm sido mostrados para mediar o cross-priming contra antígenos tumorais. Para avaliar o efeito imunogênico dos EVs derivados de tumores em várias condições, são procurados métodos adaptáveis, escaláveis e válidos. Portanto, aqui é apresentada uma abordagem relativamente fácil e robusta para avaliar a imunogenicidade in vivo dos EVs. O protocolo baseia-se na análise da citometria de fluxo de células T esplênicas após a imunização in vivo de camundongos com EVs, isolada por ensaios baseados em precipitação de culturas de células tumorais sob terapia ou condições de estado estável. Por exemplo, este trabalho mostra que a exposição à oxaliplatina de células de melanoma murina B16-OVA resultou na liberação de EVs imunogênicos que podem mediar a ativação de células T citotóxicas tumorais reativas. Assim, a triagem de EVs via imunização in vivo e citometria de fluxo identifica condições nas quais os EVs imunogênicos podem surgir. Identificar condições de liberação de EV imunogênico fornece um pré-requisito essencial para testar a eficácia terapêutica dos EVs contra o câncer e explorar os mecanismos moleculares subjacentes para, finalmente, revelar novas percepções sobre o papel dos EVs na imunologia do câncer.

Este protocolo visa facilitar a avaliação simples e facilmente reprodutível da imunogenicidade dos EVs derivados do tumor. Por meio deste, os camundongos são inoculados com EVs derivados de culturas in vitro de células tumorais expressando o modelo de frango de antígeno ovalbumina (OVA). A resposta imune subsequente é analisada em células T esplênicas através da citometria de fluxo.
A Figura 1 dá uma visão geral das etapas práticas d...

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In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Este manuscrito descreve como avaliar a imunogenicidade in vivo de vesículas extracelulares derivadas de células tumorais (EVs) usando citometria de fluxo. Os EVs derivados de tumores submetidos à morte de células imunogênicas induzidas pelo tratamento parecem particularmente relevantes na imunossuperveiência tumoral. Este protocolo exemplifica a avaliação dos EVs de tumor imunoestimulatório induzidos por oxaliplatina, mas pode ser adaptado a várias configurações.

In vivo Triagem de imunogenicidade de vesículas extracelulares derivadas do tumor por citometria de fluxo de células T esplênicas

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Este vídeo mostra como avaliar a imunogenicidade in vivo de vesículas extracelulares derivadas do tumor, ou EVs, usando citometria de fluxo. O método de triagem descrito aqui é relativamente fácil de executar e pode ser adaptado a várias configurações. No câncer, identificando condições de liberação de vesícula extracelular imunogênica de particular relevância translacional.Como tal, os EVs autólogos podem ser usados como tratamentos anticâncológicos personalizados. Demonstrando a primeira parte do procedimento estará Tatiana Nedelko, assistente técnica do meu laboratório. Para iniciar a preparação da mídia de cultura celular necessária para vesícula extracelular, ou EVs, esgotar os EVs bovinos em mídia FCS por ultracentrifugação a 100.000 vezes g por 24 horas a 4 graus Celsius.Descarte a pelota após a centrifugação. Colher as células de melanoma murina B16 expressando ovalbumina, ou células B16-OVA, da cultura e lavar as células duas vezes com PBS. Em seguida, semeou as células a uma concentração de 400.000 células por mililitro na mídia esgotada pelo EV.Em seguida, trate as células B16-OVA com 30 microgramas de oxaliplatina por mililitro e incubar por 24 horas a 37 graus Celsius com amostras de controle não tratadas. Depois de 24 horas, colecione o supernatante para centrífuga a 400 vezes g por cinco minutos a 4 graus Celsius. Descarte a pelota antes da centrifugação novamente a 2.000 vezes g por 30 minutos a 4 graus Celsius.Depois de descartar a pelota, filtre o sobrenante através de um filtro de membrana PVDF de 220 nanômetros em um tubo fresco. Em seguida, misture 1 mililitro de supernascente com 0,5 mililitros de um reagente de isolamento exosome disponível comercialmente específico. Vórtice e transfira a mistura em tubos de 1,5 mililitro, seguido de incubação durante a noite a 4 graus Celsius.No dia seguinte, centrifufique a mistura a 10.000 vezes g por 60 minutos a 4 graus Celsius. Depois de descartar cuidadosamente o supernasce, remova as gotas restantes tocando o tubo de 1,5 mililitro de cabeça para baixo em uma toalha de papel e por aspiração através de uma fina ponta de pipeta sem tocar na pelota EV na parte inferior. Resuspenque a pelota em PBS frio, estocando para cima e para baixo sem arranhar a pelota com a ponta.Em seguida, acumule os EVs de todos os tubos. Se não estiver usando imediatamente, armazene as suspensões EV a 80 graus Celsius em vasos siliconizados por até 28 dias até a aplicação. Para imunizar cada camundongo no grupo de tratamento com EVs isolados de 4,0 x 10 para as quintas células B16-OVA, misture 5 microliters da suspensão EV com 55 microliters de PBS frio.Em seguida, encha as seringas montadas com agulhas de 26 a 30 com 60 microliters dos EVs diluídos ou PBS e, em seguida, imediatamente colocar a seringa no gelo. Inocular os EVs ou PBS subcutâneamente no aspecto medial da coxa do camundongo. Repita a imunização após sete dias.14 dias após o primeiro tratamento, sacrifique os ratos para resseccionar o baço. Em seguida, amasse o baço ressecado com um coador de células umedecida de 100 micrômetros e o êmbolo plástico de uma seringa. Jogue as células esplênicas em um tubo de 50 mililitros com 5 a 10 mililitros do RPMI completo.Em seguida, centrifugar as células a 400 vezes g por cinco minutos a 4 graus Celsius antes de descartar o supernante. Para remover os eritrócitos da suspensão celular, resuspendam e incubam a pelota celular com 2 mililitros do tampão de lise de glóbulos vermelhos por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, pare a reação adicionando cinco a 10 mililitros de RPMI completo, seguido de centrifugação como descrito anteriormente.Depois de reutilizar a pelota de célula em RPMI completo, conte as células de cada rato e coloque os triplicados de 200.000 esplenócitos com 200 microliters de cRPMI em cada poço de uma placa de 96 poços com um fundo em forma de U. Em seguida, incubar as placas por 48 horas a 37 graus Celsius. Após 48 horas, trate a cultura celular com 5 nanogramas por mililitro Brefeldin A, 20 nanogramas por MILilitro PMA e 1 micrograma por mililitro ionomicina a 37 graus Celsius por 4 horas.Pós incubação, transfira os esplenócitos para uma placa de 96 poços com um fundo em forma de V e lave as células duas vezes com PBS. Resuspenda os esplenócitos pelleted na solução de coloração recém-preparada e incubar a suspensão celular por 30 minutos a 4 graus Celsius protegidos da luz. Para fixação e permeabilização, lave os esplenócitos duas vezes no tampão FACS e, em seguida, resuspenda os esplenócitos em 100 microliters por poço da solução de fixação e permeabilização, seguido de incubação no escuro como explicado anteriormente.Para colorir o gamma de interferon intracelular, lave os esplenócitos na fixação ou tampão de permeabilização antes de retransmite as células com os anticorpos fluorescentes contra interferon gama diluída 1:200 no buffer. Incubar os esplenócitos por 1 a 12 horas a 4 graus Celsius no escuro. Após lavagem minuciosa e resuspensão no tampão FACS, analise a ativação de células T citotóxica de acordo com a estratégia de gating explicada no manuscrito.Na imagem representativa, a estratégia de gating para analisar a ativação de células T citotóxicas é exibida. As células foram fechadas como as células únicas, o subconjunto linfócito, as células T cd3 positivas viáveis, e as células T cd8-positivas CD4-negativos. O acúmulo intracelular do gama interferon foi avaliado como um marcador substituto para a ativação.Após a imunização com EVs derivados das células tumorais, foi estudada a indução de respostas de células T específicas de antígeno em camundongos receptores. Os EVs derivados do tumor cultivados sob condições de estresse genotóxico, como o tratamento de oxaliplatina, induziram a ativação potente das células T citotóxicas esplênicas em contraste com EVs não tratados. O grupo de animais tratados com veículos apresentou a menor resposta.A ativação das células T esplênicas foi determinada após a reimulação ex vivo, seja na presença ou ausência de ovalbumina. A produção do interferon gama foi aumentada quando os esplenócitos de animais tumorais tratados com EV foram repimulados com o modelo de antigenação ovalbumina antes da análise. Observe que os resultados reprodutíveis dependem da eficácia constante do isolamento dos EVs.Assim, certifique-se de que as pelotas EV sejam resuspengiadas inteiramente e prontamente para evitar a dessecação. Com este protocolo, pudemos analisar caminhos específicos dentro das células tumorais que determinam a imunogenicidade dos EVs derivados de células tumorais. Isso pode pavimentar o caminho para aproveitar tais EVs imunogênicos no tratamento do câncer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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