Name: in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

Denna studie stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 och Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (till H.P.), ett Mechtild Harf Research Grant från DKMS Foundation for Giving Life (to H.P.) a Young Investigator Award av Melanoma Research Alliance (till S.H.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.) en ung prövarutmärkelse av Melanoma Research Alliance (till S.H.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.) en ung prövarutmärkelse av Melanoma Research Alliance (till S.H.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.) en ung prövarutmärkelse av Melanoma Research Alliance (till S.H.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium från Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.), ett stipendium av Else-Kröner-Stiftung (till H.P.) en ung prövarutmärkelse vid Melanoma researchallians (till S. en fröfond av Tekniska universitetet München (till S.H.) och ett forskningsanslag av Wilhelm Sander Foundation (2021.041.1, till S.H.). H. P. stöds av EMBO Young Investigator Program.
FÖRFATTARBIDRAG:
F.S., H.P., och S.H. designade forskningen, analyserade och tolkade resultaten. F.S. och S.H. skrev manuskriptet. H.P. och S.H. guidade studien.

Vid början av experiment var möss minst 6 veckors ålder och bibehölls under specifika patogenfria förhållanden. Detta protokoll överensstämmer med de institutionella etiska normerna och gällande lokala bestämmelser. Djurstudier godkändes av den lokala tillsynsmyndigheten (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Eventuella könsrelaterade fördomar undersöktes inte i dessa studier.
1. Generering och isolering av EL som härrör från tumörceller efter kemoterapiexponering
...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy.">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li><li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death.">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).</li><li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8++T+cell+responses+through+CD8{alpha}++dendritic+cells.">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li><li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy.">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity.">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li><li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin.">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer:+What+are+the+potential+clinical+ramifications.">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression.">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li><li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming.">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li><li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses.">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li><li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs.">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li><li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity.">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li><li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade.">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).</li><li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity.">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy.">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+storage+stability+of+extracellular+vesicles+for+therapeutic+applications.">Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+extracellular+vesicles+in+fresh+plasma.">Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice.">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li><li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma.">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation.">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li><li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shedding+of+CD62L+(L-selectin)+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes.">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).</li><li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines.">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).</li><li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer.">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li><li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions.">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li></ol>

Detta protokoll ger en immunologisk in vivo-bedömning av EVs som härrör från melanomceller under kemoterapiinducerad stress samtidigt som de anpassar sig till EVs som släpps ut från olika cancerformer under olika behandlingar. Immunisering av möss med EVs som härrör från oxaliplatinbehandlade B16-OVA-celler, till exempel, expanderar IFN-γ-producerande CD8 + T-celler i mjälten, som ytterligare stimuleras av ex vivo inkubation med ovalbumin, vilket indikerar ett tumörspecifikt immu...

Immunsystemet spelar en central roll i kampen mot cancer, både när det uppviglats av immunkontrollhämning och för effekten av konventionella cancerbehandlingar. Tumörceller som dukar under för genotoxiska terapier som kemoterapeutiska medel oxaliplatin och doxorubicin, eller joniserande strålbehandling kan frigöra antigener och fara-associerade molekylära mönster (DAMPs) som potentiellt initierar ett adaptivt anti-tumör immunsvar1. De mest framträdande DAMPs, i samband med immunogenic celldöd, inkluderar find-me signaler såsom chemotactic ATP, eat-me signaler såsom exponering av calreticulin, som främjar tumör cellupptag av antigen-presenterar celler, och frisättningen av HMGB1, som aktiverar mönsterigenkänningsreceptorer, vilket förbättrar korspresentationen av tumör antigener2. Dessutom känns typ I-interferoner (IFN-I), inducerade via tumör-härledda immunogenic nukleinsyror eller andra stimuli, av dendritiska celler, vilket gör det möjligt för dem att effektivt prime tumör-specifika cytotoxiska T-celler3,4. Kliniskt, aktiverade och prolifererande CD8 + T celler infiltrera tumör ger en oberoende prognostisk faktor för långvarig överlevnad hos många cancerpatienter. IFN-γ frigörs från sådana aktiverade T-celler och förmedlar direkta antiproliferativa effekter på cancerceller och driver Th1 polarisering och cytotoxisk T-cellsdifferentiering, vilket bidrar till effektiv immunosurveillance mot cancer5,6. Oxaliplatin är en äkta immunogen celldödsinducerare, som förmedlar ett sådant adaptivt immunsvar mot cancer7. Den mängd initiala immunogenic signaler som släppts av tumörceller under terapi-inducerad stress återstår dock att vara helt avtäckt. Trots betydande framsteg inom cancerimmunterapi är det fortfarande en utmaning att utöka sina fördelar till en större del av patienterna. En mer detaljerad förståelse av immunogenic signaler som initierar T-cells aktivering kan vägleda utvecklingen av nya terapier.
En heterogen grupp av membran-slutna strukturer, känd som extracellulära blåsor (EVs), verkar fungera som intercellulära kommunikationsanordningar. EVs avges av praktiskt taget alla celltyper och bär funktionella proteiner, RNA, DNA och andra molekyler till en mottagarcell eller kan ändra en cells funktionella tillstånd bara genom att binda till receptorer på cellytan. Deras biologiskt aktiva last varierar avsevärt beroende på typ och funktionstillstånd hos den genererande cellen8. I cancerimmunologi har EVs som släppts ut från tumörceller främst betraktats som adversarial till immunterapi eftersom de så småningom främjar invasiv tillväxt, preform metastaserade nischer9 och undertrycka immunsvaret10. Däremot har vissa studier visat att EVs kan överföra tumör antigener till dendritiska celler för effektiv korspresentation11,12. EVs kan ge immunostimulatoriska nukleinsyror om de dyker upp under terapiinducerad stress, vilket underlättar ett immunsvar mot tumör13,14. Avkänning av sådana RNA och DNA medfödda immunligander i tumör mikromiljön har nyligen visat sig modulera lyhördhet för kontrollpunkt blockad betydligt15,16,17. Därför måste den immunogenic rollen av EVs släppta av tumörceller under olika terapi-inducerad stress förklaras ytterligare. Eftersom elfordon utgör ett ungt men växande forskningsområde pågår fortfarande standardisering av metoder. Därför är kunskapsutbyte avgörande för att förbättra forskningens reproducerbarhet vid interaktioner mellan EVs och cancerimmunologi. Med detta i åtanke beskriver detta manuskript ett enkelt protokoll för att bedöma den immunogenic effekten av tumör-härledda EVs in vivo.
Denna bedömning utförs genom att generera tumör-härledda EVs, immunisera mottagarmöss med dessa EVs och analysera splenic T-celler via flöde cytometry. EV-generationen utförs idealiskt genom sådd av murin tumörceller i ett EV-fritt cellkulturmedium för en hög renhetsgrad. Celler behandlas med en specifik cellstressstimulans, såsom kemoterapi, för att jämföra effekten av terapiinducerade EVs mot immungenitet vid respektive tumör-härledda EVs. Isoleringen av elfordon kan mycket väl utföras med olika tekniker som bör väljas efter in vivo-tillämplighet och lokal tillgänglighet. Följande protokoll beskriver en nederbördsbaserad analys med ett kommersiellt kit för EV-rening. Möss immuniseras två gånger med dessa EVs. Fjorton dagar efter den första injektionen extraheras T-celler från mjälten och analyseras för IFN-γ produktion via flödescytometri för att utvärdera ett systemiskt immunsvar. Med detta bedöms potentialen hos tumör-härledda EVs, som dyker upp under olika terapeutiska regimer, att inducera anti-tumor T-cells svar relativt enkelt, snabbt och med hög giltighet13. Därför är denna metod lämplig för en immunologisk screening av EVs som härrör från cancerceller under olika förhållanden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100204</td>
			<td>Clone 17A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 PacBlue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100428</td>
			<td>Clone GK1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN&#947; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>RM90022</td>
			<td>Clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420601</td>
			<td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>EASYstrainer 100 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>407952</td>
			<td>From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &#8805; 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>vac-pova</td>
			<td>Ovalbumine with &#60; 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Pharmacy of MRI hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1514-122</td>
			<td>Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate, &#8805; 99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF filter, 0,22 &#181;m, for syringes</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Filter Unit 0.22 &#181;m Durapore PVDF Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 26 G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305501</td>
			<td>1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Exosome Isolation Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478359</td>
			<td>For isolation from cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>31350</td>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells

Immunogenic cell död av tumörer, orsakas av kemoterapi eller bestrålning, kan utlösa tumör-specifika T-cells svar genom att släppa fara-associerade molekylära mönster och inducera produktionen av typ I interferon. Immunterapier, inklusive checkpoint hämning, förlitar sig främst på befintliga tumörspecifika T-celler för att utveckla en terapeutisk effekt. Således kan synergistiska terapeutiska metoder som utnyttjar immunogen celldöd som ett inneboende anti-cancervaccin förbättra deras lyhördhet. Spektrumet av immunogenic faktorer som frigörs av celler under terapi-inducerad stress är dock fortfarande ofullständigt karakteriseras, särskilt när det gäller extracellulära blåsor (EVs). EVs, membranösa partiklar i nanoskala som släpps ut från praktiskt taget alla celler, anses underlätta intercellulär kommunikation och har vid cancer visat sig medla tvärprimering mot tumörantigener. För att bedöma den immunogenic effekten av EVs härrör från tumörer under olika förhållanden, är anpassningsbara, skalbara och giltiga metoder söks. Därför presenteras häri ett relativt enkelt och robust tillvägagångssätt för att bedöma EVs in vivo immunogenicitet. Protokollet är baserat på flödescytometrianalys av mjälte-T-celler efter in vivo-immunisering av möss med EVs, isolerade av nederbördsbaserade analyser från tumörcellskulturer under terapi eller steady-state-tillstånd. Till exempel visar detta arbete att oxaliplatin exponering av B16-OVA murine melanom celler resulterade i frisättning av immunogenic EVs som kan medla aktiveringen av tumör-reaktiva cytotoxiska T-celler. Därför identifierar screening av EVs via in vivo immunisering och flöde cytometri villkor under vilka immunogenic EVs kan dyka upp. Att identifiera villkor för immunogenic EV-frisättning ger en viktig förutsättning för att testa EVs terapeutiska effekt mot cancer och utforska de underliggande molekylära mekanismerna för att i slutändan avslöja nya insikter om EVs roll i cancerimmunologi.

Detta protokoll är avsett att underlätta enkel och lätt reproducerbar bedömning av immunogenicity av tumör-härledda EVs. Därmed inokuleras möss med EVs som härrör från in vitro-kulturer av tumörceller som uttrycker modellen antigen kyckling ovalbumin (OVA). Det efterföljande immunsvaret analyseras i mjälte T-celler via flödescytometri.
Figur 1 ger en översikt över de praktiska stegen i hela protokollet. Eftersom arbetet fokuserar...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Detta manuskript beskriver hur man bedömer in vivo immunogenicity av tumör cell-härledda extracellulära blåsor (EVs) med hjälp av flöde cytometri. EVs härrör från tumörer som genomgår behandling-inducerad immunogenic cell död verkar särskilt relevant i tumör immunosurveillance. Detta protokoll exemplifierar bedömningen av oxaliplatin-inducerad immunostimulatory tumör EVs men kan anpassas till olika inställningar.

In Vivo Immunogenicitet Screening av tumör-härledda extracellulära vesicles av flöde cytometri av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Denna video visar hur man bedömer in vivo immunogenicity av tumör-härledda extracellulära blåsor, eller EVs, med hjälp av flöde cytometri. Screeningmetoden som beskrivs häri är relativt enkel att utföra och kan anpassas till olika inställningar. Vid cancer, identifiera villkor för immunogenic extracellular vesicle releaser av särskild translationell relevans.Som sådan kan autologa EVs användas som personliga anti-cancerbehandlingar. Tatiana Nedelko, teknisk assistent från mitt laboratorium, demonstrerar den första delen av förfarandet. För att påbörja beredningen av cellodlingsmedier som krävs för extracellulär blåsor, eller EVs, utarma de nötkreatur EVs i FCS-medier genom ultracentrifugation vid 100 000 gånger g i 24 timmar vid 4 grader Celsius.Kassera pelleten efter centrifugering. Skörda de murin B16 melanomceller som uttrycker ovalbumin, eller B16-OVA-celler, från kulturen och tvätta cellerna två gånger med PBS. Såna sedan cellerna i en koncentration av 400 000 celler per milliliter i det EV-utarmade mediet.Behandla sedan B16-OVA-cellerna med 30 mikrogram oxaliplatin per milliliter och inkubera i 24 timmar vid 37 grader Celsius med obehandlade kontrollprover. Efter 24 timmar, samla supernatanten för att centrifugera vid 400 gånger g i fem minuter vid 4 grader Celsius. Kassera pelleten före centrifugering igen vid 2 000 gånger g i 30 minuter vid 4 grader Celsius.Efter att ha kastat pelleten filtrerar du supernatanten genom ett 220 nanometer PVDF-membranfilter i ett nytt rör. Blanda sedan 1 milliliter supernatant med 0,5 milliliter av ett specifikt kommersiellt tillgängligt exosomisoleringsreagens. Virvel och överför blandningen till 1,5 milliliter rör, följt av inkubation över natten vid 4 grader Celsius.Nästa dag centrifugerar blandningen vid 10 000 gånger g i 60 minuter vid 4 grader Celsius. Efter att försiktigt ha kasserat supernatanten, ta bort de återstående dropparna genom att knacka upp och ner på 1,5 ml-röret på en pappershandduk och genom att aspirera genom en fin pipettspets utan att röra EV-pelleten längst ner. Återanvänd pelleten i kall PBS genom att pipettera upp och ner utan att repa pelleten med spetsen.Poola sedan EVs från alla rör. Om du inte använder omedelbart, förvara EV-suspensionerna vid 80 grader Celsius i silikoniserade kärl i upp till 28 dagar fram till applicering. För att immunisera varje mus i behandlingsgruppen med EVs isolerade från 4,0 x 10 till de femte B16-OVA-cellerna, blanda 5 mikroliter av EV-suspensionen med 55 mikroliter kall PBS.Fyll sedan sprutor monterade med 26 till 30-gauge nålar med 60 mikroliter av de utspädda EVs eller PBS och lägg sedan omedelbart sprutan på is. Inokulera EVs eller PBS subkutana i den mediala aspekten av mössens lår. Upprepa immuniseringen efter sju dagar.14 dagar efter den första behandlingen, offra mössen för att återförsluta mjälten. Mosa sedan den resected mjälten med en fuktad 100-mikrometer cellsil och plastkolven på en spruta. Spola de spleniska cellerna i ett 50 ml rör med 5 till 10 milliliter av den svala kompletta RPMI.Centrifugera sedan cellerna vid 400 gånger g i fem minuter vid 4 grader Celsius innan du kasserar supernatanten. För att avlägsna erytrocyter från cellupphängningen, återanvänd och inkubera cellpelleten med 2 milliliter av den röda blodkropparlysbufferten i fem minuter vid rumstemperatur. Stoppa sedan reaktionen genom att tillsätta fem till 10 milliliter komplett RPMI, följt av centrifugering som beskrivits tidigare.Efter att ha spenderat cellpellet i fullständig RPMI, räkna cellerna från varje mus och placera tre exemplaren av 200 000 praktocyter med 200 mikroliter cRPMI i varje brunn på en 96-välplatta med en U-formad botten. Inkubera sedan plattorna i 48 timmar vid 37 grader Celsius. Efter 48 timmar, behandla cellkulturen med 5 nanogram per milliliter Brefeldin A, 20 nanogram per milliliter PMA och 1 mikrogram per milliliter Ionomycin vid 37 grader Celsius i 4 timmar.Efter inkubation, överför praktocyterna till en 96-välplatta med en V-formad botten och tvätta cellerna två gånger med PBS. Resuspend de pelleterade splenocyterna i den nyberedda färgningslösningen och inkubera cellupphängningen i 30 minuter vid 4 grader Celsius skyddad från ljus. För fixering och permeabilisering, tvätta glanscellerna två gånger i FACS-bufferten och sedan återanvända praktocyterna i 100 mikroliter per brunn av fixerings- och permeabiliseringslösningen, följt av inkubation i mörkret som förklarats tidigare.För färgning av intracellulär interferon gamma, tvätta splenocyterna i fixerings- eller permeabiliseringsbufferten innan cellerna återförs med fluorescerande antikroppar mot interferon gamma utspädd 1:200 i bufferten. Inkubera splenocyterna i 1 till 12 timmar vid 4 grader Celsius i mörkret. Efter noggrann tvättning och resuspension i FACS-buffert, analysera aktiveringen av cytotoxiska T-celler enligt gatingstrategin som förklaras i manuskriptet.I den representativa bilden visas gatingstrategin för att analysera aktiveringen av cytotoxiska T-celler. Cellerna var gated som enstaka celler, lymfocyt delmängd, livskraftiga CD3-positiva T celler och CD4-negativa CD8-positiva cytotoxiska T-celler. Intracellulär ackumulering av interferon gamma bedömdes som en surrogat markör för aktivering.Efter immunisering med EVs härleds från tumör cellerna, induktion av antigen-specifika T cell svar i mottagare möss studerades. Tumör-härledda EVs odlas under genotoxiska stress villkor, såsom oxaliplatin behandling, inducerad potent aktivering av mjälte cytotoxiska T-celler i motsats till obehandlade EVs. Den fordonsbehandlade gruppen av djur visade det lägsta svaret.Aktivering av splenic T celler fastställdes efter ex vivo restimulering antingen i närvaro eller avsaknad av ovalbumin. Produktionen av interferon gamma ökades när splenocyter av tumör EV-behandlade djur restimulerades med modellen tumör antigen ovalbumin före analysen. Observera att reproducerbara resultat beror på den konstanta isoleringseffektiviteten hos EL-fordon.Se således till att EV-pellets återanvänds helt och hållet och snabbt för att undvika uttorkning. Med detta protokoll kunde vi analysera specifika vägar inom tumör celler som bestämmer immunogenicity av tumör cell-härledda EVs. Detta kan bana väg för att utnyttja sådana immunogenic EVs i cancerbehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flöde flödescytometri-baserade Drug Screening System för identifiering av små molekyler som främjar celldifferentiering av Glioblastoma stamceller

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flödescytometri för att uppskatta leukemi stamceller i primär akut myeloisk leukemi och i Patient-härrör-xenograft, vid diagnos och följa upp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping av ortotop Homograft (syngena) av murina primära KPC pankreas duktal adenokarcinom av flödescytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En sfäroid dödande analys av CAR T-celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8+ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Utvinning av extracellulära blåsor från hela vävnad

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell cykelns specifika mätningar av γH2AX och apoptos efter genotoxisk stress genom flödescytometri

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolering av exosomberikade extracellulära vesiklar som bär granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor från embryonala stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...