Name: in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 ve Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (H.P.'ye), DKMS Yaşam Verme Vakfı'ndan (H.P.'ye) bir Mechtild Harf Araştırma Bursu, Melanom Araştırma İttifakı (S.H.'ye) tarafından Genç Araştırmacı Ödülü, Else-Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından verilen bir burs (F.S.'ye), Münih Teknik Üniversitesi tarafından bir Tohum Fonu (S.H.'ye) ve Wilhelm Sander Vakfı tarafından bir araştırma hibesi (2021.041.1, S.H.'ye). H. P., EMBO Genç Araştırmacı Programı tarafından desteklenmektedir.
YAZAR KATKILARI:
F.S., H.P. ve S.H. araştırmayı tasarladı, analiz etti ve sonuçları yorumladı. F.S. ve S.H. el yazmasını yazdı. H.P. ve S.H. çalışmaya rehberlik etti.

Deneylerin başlangıcında, fareler en az 6 haftalıktı ve spesifik patojensiz koşullar altında tutuldu. Bu protokol, Kurumsal etik standartlara ve geçerli yerel düzenlemelere uygundur. Hayvan çalışmaları yerel düzenleyici kurum (Regierung von Oberbayern, Münih, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmalarda cinsiyetle ilgili olası önyargılar araştırılmamıştır.
1. Kemoterapiye maruz kaldıktan sonra tümör hücrelerinden elde edilen EV'lerin üretimi ve izolasyon...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy.">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li><li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death.">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).</li><li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8++T+cell+responses+through+CD8{alpha}++dendritic+cells.">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li><li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy.">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity.">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li><li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin.">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer:+What+are+the+potential+clinical+ramifications.">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression.">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li><li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming.">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li><li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses.">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li><li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs.">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li><li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity.">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li><li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade.">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).</li><li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity.">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy.">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+storage+stability+of+extracellular+vesicles+for+therapeutic+applications.">Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis:+a+variation+study.">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).</li><li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+extracellular+vesicles+in+fresh+plasma.">Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice.">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li><li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma.">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation.">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li><li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shedding+of+CD62L+(L-selectin)+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes.">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).</li><li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines.">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).</li><li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer.">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li><li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions.">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li></ol>

Bu protokol, kemoterapiye bağlı stres altında melanom hücrelerinden türetilen EV'lerin immünolojik in vivo bir değerlendirmesini sağlarken, çeşitli tedaviler altında çeşitli kanserlerden yayılan EV'lere uyum sağlar. Örneğin, oksaliplatin ile tedavi edilen B16-OVA hücrelerinden türetilen EV'lerle farelerin bağışıklanması, dalaktaki IFN γ üreten CD8 + T hücrelerini genişletir, bunlar da ovalbümin ile ex vivo inkübasyon ile daha da uyarılır ve tümöre özgü bir ...

Bağışıklık sistemi, hem bağışıklık kontrol noktası inhibisyonu tarafından kışkırtıldığında hem de geleneksel kanser tedavilerinin etkinliği için kansere karşı mücadelede çok önemli bir rol oynar. Kemoterapötik ajanlar oksaliplatin ve doksorubisin gibi genotoksik tedavilere yenik düşen tümör hücreleri veya iyonlaştırıcı radyasyon tedavisi, potansiyel olarak adaptif bir anti-tümör immün yanıtı başlatan antijenleri ve tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri (DAMP'ler) serbest bırakabilir1. İmmünojenik hücre ölümü bağlamında en belirgin DAMP'ler, kemotaktik ATP gibi beni bul sinyallerini, antijen sunan hücreler tarafından tümör hücresi alımını teşvik eden calreticulin maruziyeti gibi yeme-beni sinyalleri ve desen tanıma reseptörlerini aktive eden HMGB1'in salınımını içerir. Ayrıca, tümör kaynaklı immünojenik nükleik asitler veya diğer uyaranlar yoluyla indüklenen tip I interferonlar (IFN-I), dendritik hücreler tarafından algılanır ve tümöre özgü sitotoksik T hücrelerini etkili bir şekilde astarlamalarını sağlar3,4. Klinik olarak, tümöre sızan aktive ve proliferasyon CD8 + T hücreleri, birçok kanser hastasında uzun süreli sağkalım için bağımsız bir prognostik faktör sağlar. Bu tür aktive edilmiş T hücrelerinden salınan IFN-γ, kanser hücreleri üzerinde doğrudan antiproliferatif etkilere aracılık eder ve Th1 polarizasyonunu ve sitotoksik T hücresi farklılaşmasını yönlendirir, böylece kansere karşı etkili immünossürveyana katkıda bulunur5,6. Oksaliplatin, kansere karşı bu tür adaptif immün yanıta aracılık eden iyi niyetli bir immünojenik hücre ölümü indükleyicisidir7. Bununla birlikte, tedaviye bağlı stres altında tümör hücreleri tarafından salınan ilk immünojenik sinyallerin bolluğu tam olarak ortaya çıkarılmaya devam etmektedir. Kanser immünoterapisindeki önemli ilerlemelere rağmen, faydalarını hastaların daha büyük bir kısmına genişletmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. T hücresi aktivasyonunu başlatan immünojenik sinyallerin daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, yeni tedavilerin geliştirilmesine rehberlik edebilir.
Hücre dışı veziküller (EV'ler) olarak bilinen membranla çevrili heterojen bir yapı grubu, hücreler arası iletişim cihazları olarak hizmet ediyor gibi görünmektedir. Hemen hemen tüm hücre tipleri tarafından yayılan EV'ler, fonksiyonel proteinleri, RNA'yı, DNA'yı ve diğer molekülleri bir alıcı hücreye taşır veya sadece hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanarak bir hücrenin fonksiyonel durumunu değiştirebilir. Biyolojik olarak aktif kargoları, üreten hücrenin türüne ve fonksiyonel durumuna göre önemli ölçüde değişir8. Kanser immünolojisinde, tümör hücrelerinden salınan EV'ler ağırlıklı olarak immünoterapiye düşman olarak kabul edilmiştir, çünkü sonunda invaziv büyümeyi teşvik eder, metastatik nişleri önceden şekillendirir9 ve bağışıklık tepkisini baskılar10. Buna karşılık, bazı çalışmalar EV'lerin etkili çapraz sunum için tümör antijenlerini dendritik hücrelere aktarabildiğini göstermiştir11,12. EV'ler, tedaviye bağlı stres altında ortaya çıktıkları takdirde immünostimülatör nükleik asitler sağlayabilir ve anti-tümör immün yanıtını kolaylaştırır13,14. Tümör mikroortamında bu tür RNA ve DNA'dan gelen immün ligandların algılanmasının son zamanlarda kontrol noktası blokajına duyarlılığı önemli ölçüde modüle ettiği gösterilmiştir15,16,17. Bu nedenle, farklı tedaviye bağlı stres altında tümör hücreleri tarafından salınan EV'lerin immünojenik rolünün daha da açıklığa kavuşturulması gerekmektedir. EV'ler genç ama büyüyen bir araştırma alanı oluşturduğundan, yöntemlerin standardizasyonu hala devam etmektedir. Bu nedenle, EV'ler ve kanser immünolojisi arasındaki etkileşimler üzerine araştırma tekrarlanabilirliğini geliştirmek için bilgi paylaşımı esastır. Bunu akılda tutarak, bu makale tümör kaynaklı EV'lerin immünojenik etkisini in vivo olarak değerlendirmek için basit bir protokolü açıklamaktadır.
Bu değerlendirme, tümör kaynaklı EV'ler üreterek, alıcı fareleri bu EV'lerle bağışıklayarak ve dalak T hücrelerini akış sitometrisi ile analiz ederek gerçekleştirilir. EV üretimi, murin tümör hücrelerinin EV'siz bir hücre kültürü ortamında yüksek derecede saflık için tohumlanmasıyla ideal olarak gerçekleştirilir. Hücreler, tedaviye bağlı EV'lerin etkisini, ilgili tümör kaynaklı EV'lerin temel immünojenisitesine karşı karşılaştırmak için kemoterapi gibi spesifik bir hücre stres uyaranı ile tedavi edilir. EV'lerin izolasyonu, in vivo uygulanabilirliğe ve yerel mevcudiyete göre seçilmesi gereken çeşitli tekniklerle iyi bir şekilde gerçekleştirilebilir. Aşağıdaki protokol, EV saflaştırması için ticari bir kit ile çökeltme bazlı bir tahlili açıklamaktadır. Fareler bu EV'lerle iki kez aşılanır. İlk enjeksiyondan on dört gün sonra, T hücreleri dalaktan çıkarılır ve sistemik bir bağışıklık tepkisini değerlendirmek için akış sitometrisi yoluyla IFN-γ üretimi için analiz edilir. Bununla birlikte, farklı terapötik rejimler altında ortaya çıkan tümör kaynaklı EV'lerin anti-tümör T hücresi yanıtlarını indükleme potansiyeli nispeten kolay, hızlı ve yüksek geçerlilikle değerlendirilir13. Bu nedenle, bu yöntem çeşitli koşullar altında kanser hücrelerinden türetilen EV'lerin immünolojik taraması için uygundur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100204</td>
			<td>Clone 17A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 PacBlue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100428</td>
			<td>Clone GK1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN&#947; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>RM90022</td>
			<td>Clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420601</td>
			<td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 100 &#181;m</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542000</td>
			<td>EASYstrainer 100 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good Forte</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td>eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5123-43</td>
			<td>Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>407952</td>
			<td>From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &#8805; 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>vac-pova</td>
			<td>Ovalbumine with &#60; 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Pharmacy of MRI hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1514-122</td>
			<td>Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate, &#8805; 99% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF filter, 0,22 &#181;m, for syringes</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Filter Unit 0.22 &#181;m Durapore PVDF Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11875</td>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 26 G</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305501</td>
			<td>1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total Exosome Isolation Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478359</td>
			<td>For isolation from cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>31350</td>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunogenicity screening of tumor-derived extracellular vesicles by flow cytometry of splenic t cells

Kemoterapi veya ışınlamanın neden olduğu tümörlerin immünojenik hücre ölümü, tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri serbest bırakarak ve tip I interferon üretimini indükleyerek tümöre özgü T hücresi yanıtlarını tetikleyebilir. Kontrol noktası inhibisyonu da dahil olmak üzere immünoterapiler, terapötik bir etki ortaya çıkarmak için öncelikle önceden var olan tümöre özgü T hücrelerine dayanır. Bu nedenle, immünojenik hücre ölümünü içsel bir anti-kanser aşısı olarak kullanan sinerjik terapötik yaklaşımlar yanıtlarını artırabilir. Bununla birlikte, tedaviye bağlı stres altındaki hücreler tarafından salınan immünojenik faktörlerin spektrumu, özellikle hücre dışı veziküller (EV'ler) ile ilgili olarak eksik karakterize olmaya devam etmektedir. EV'lerin, hemen hemen tüm hücrelerden yayılan nano ölçekli membranöz parçacıkların, hücreler arası iletişimi kolaylaştırdığı düşünülmektedir ve kanserde, tümör antijenlerine karşı çapraz astarlamaya aracılık ettiği gösterilmiştir. Çeşitli koşullar altında tümörlerden türetilen EV'lerin immünojenik etkisini değerlendirmek için uyarlanabilir, ölçeklenebilir ve geçerli yöntemler aranmaktadır. Bu nedenle, burada EV'lerin in vivo immünojenisitesini değerlendirmek için nispeten kolay ve sağlam bir yaklaşım sunulmaktadır. Protokol, farelerin EV'lerle in vivo immünizasyonundan sonra, tedavi veya kararlı durum koşulları altında tümör hücre kültürlerinden çökeltme bazlı tahlillerle izole edilen dalak T hücrelerinin akış sitometrisi analizine dayanmaktadır. Örneğin, bu çalışma, B16-OVA murin melanom hücrelerinin oksaliplatin maruziyetinin, tümör-reaktif sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonuna aracılık edebilecek immünojenik EV'lerin salınımıyla sonuçlandığını göstermektedir. Bu nedenle, EV'lerin in vivo immünizasyon ve akış sitometrisi yoluyla taranması, immünojenik EV'lerin ortaya çıkabileceği koşulları tanımlar. İmmünojenik EV salınımının koşullarını belirlemek, EV'lerin kansere karşı terapötik etkinliğini test etmek ve sonuçta EV'lerin kanser immünolojisindeki rolüne dair yeni bilgiler ortaya çıkarmak için altta yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için önemli bir ön koşul sağlar.

Bu protokol, tümör kaynaklı EV'lerin immünojenisitesinin basit ve kolay tekrarlanabilir değerlendirmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu sayede fareler, model antijen tavuk ovalbümini (OVA) eksprese eden tümör hücrelerinin in vitro kültürlerinden türetilen EV'lerle aşılanır. Sonraki immün yanıt, dalak T hücrelerinde akış sitometrisi ile analiz edilir.
Şekil 1 , tüm protokolün pratik adımlarına genel bir bakış s...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells at JoVE.com

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Bu yazıda, akım sitometrisi kullanılarak tümör hücresi kaynaklı hücre dışı veziküllerin (EV'ler) in vivo immünojenisitesinin nasıl değerlendirileceği açıklanmaktadır. Tedaviye bağlı immünojenik hücre ölümü geçiren tümörlerden türetilen EV'ler, tümör immünosürveyansı ile özellikle ilgili görünmektedir. Bu protokol, oksaliplatin ile indüklenen immünostimülatör tümör EV'lerin değerlendirilmesini örneklemektedir, ancak çeşitli ortamlara uyarlanabilir.

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Bu video, tümör kaynaklı hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin in vivo immünojenisitesinin akış sitometrisi kullanılarak nasıl değerlendirileceğini göstermektedir. Burada açıklanan tarama yönteminin gerçekleştirilmesi nispeten kolaydır ve çeşitli ayarlara uyarlanabilir. Kanserde, immünojenik hücre dışı vezikül koşullarının belirlenmesi, belirli translasyonel alaka düzeyine sahiptir.Bu nedenle, otolog EV'ler kişiselleştirilmiş anti-kanser tedavileri olarak kullanılabilir. Prosedürün ilk bölümünü gösteren, laboratuvarımdan teknik asistan Tatiana Nedelko olacak. Hücre dışı vezikül veya EV'ler için gerekli hücre kültürü ortamının hazırlanmasına başlamak için, FCS ortamındaki sığır EV'lerini, 4 santigrat derecede 24 saat boyunca 100.000 kez g'de ultrasantrifüjleme yoluyla tüketin.Santrifüjlemeden sonra peleti atın. Ovalbümin eksprese eden murin B16 melanom hücrelerini veya B16-OVA hücrelerini kültürden toplayın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri EV-tükenmiş ortamda mililitre başına 400.000 hücre konsantrasyonunda tohumlayın.Daha sonra, B16-OVA hücrelerine mililitre başına 30 mikrogram oksaliplatin uygulayın ve işlenmemiş kontrol numuneleriyle 37 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin. 24 saat sonra, süpernatantı 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 400 kez g'de santrifüje toplayın. Pelet, 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 2.000 kez g'de tekrar santrifüjlemeden önce atın.Peleti attıktan sonra, süpernatantı 220 nanometre PVDF membran filtresinden taze bir tüpe süzün. Daha sonra, 1 mililitre süpernatantı 0.5 mililitre ticari olarak temin edilebilen belirli bir eksozom izolasyon reaktifi ile karıştırın. Vorteks yapın ve karışımı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın, ardından 4 santigrat derecede gece boyunca inkübasyon.Ertesi gün, karışımı 4 santigrat derecede 60 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüj edin. Süper natantı dikkatlice attıktan sonra, 1,5 mililitrelik tüpü bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı vurarak ve alttaki EV peletine dokunmadan ince bir pipet ucundan aspirasyon yaparak kalan damlaları çıkarın. Peletin ucu ile çizilmeden yukarı ve aşağı pipetle pipetlenerek soğuk PBS'de peleti yeniden askıya alın.Ardından, EV'leri tüm tüplerden toplayın. Hemen kullanmıyorsanız, EV süspansiyonlarını uygulamaya kadar 28 güne kadar silikonize kaplarda 80 santigrat derecede saklayın. Tedavi grubundaki her fareyi 4.0 x 10'dan beşinci B16-OVA hücrelerine izole edilmiş EV'lerle aşılamak için, 5 mikrolitre EV süspansiyonunu 55 mikrolitre soğuk PBS ile karıştırın.Daha sonra, 26 ila 30 gauge iğne ile monte edilmiş şırıngaları 60 mikrolitre seyreltilmiş EV veya PBS ile doldurun ve ardından şırıngayı hemen buza koyun. EV'leri veya PBS'yi deri altından farelerin uyluğunun medial yönüne aşılayın. Yedi gün sonra bağışıklamayı tekrarlayın.İlk tedaviden 14 gün sonra, dalağı rezeke etmek için fareleri feda edin. Daha sonra, rezeke edilmiş dalağı nemlendirilmiş 100 mikrometre hücre süzgeci ve bir şırınganın plastik pistonu ile ezin. Dalak hücrelerini, 5 ila 10 mililitre serin tam RPMI ile 50 mililitrelik bir tüpe yıkayın.Daha sonra, süpernatanı atmadan önce hücreleri 400 kez g'de 4 santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Eritrositleri hücre süspansiyonundan çıkarmak için, hücre peletini oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2 mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile yeniden askıya alın ve inkübe edin. Ardından, beş ila 10 mililitre tam RPMI ekleyerek reaksiyonu durdurun, ardından daha önce açıklandığı gibi santrifüjleme yapın.Hücre peletini tam RPMI'da yeniden askıya aldıktan sonra, her fareden hücreleri sayın ve 200 mikrolitre cRPMI ile 200.000 splenositin üçlüsünü, U şeklinde bir tabana sahip 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirin. Ardından, plakaları 37 santigrat derecede 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, hücre kültürünü mililitre Brefeldin A başına 5 nanogram, mililitre PMA başına 20 nanogram ve mililitre İyonomisin başına 1 mikrogram ile 4 saat boyunca 37 santigrat derecede tedavi edin.Kuluçka sonrası, plenositleri V şeklinde bir tabana sahip 96 delikli bir plakaya aktarın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Pelet edilmiş plenositleri taze hazırlanmış boyama çözeltisinde yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu ışıktan korunan 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyon ve geçirgenlik için, FACS-tamponunda iki kez yıkayın ve daha sonra plenositleri, fiksasyon ve geçirgenlik çözeltisinin kuyucuğu başına 100 mikrolitre içinde yeniden askıya alın, ardından daha önce açıklandığı gibi karanlıkta inkübasyon.Hücre içi interferon gamayı boyamak için, hücreleri tamponda 1:200 seyreltilmiş interferon gamaya karşı floresan antikorlarla tekrar göndermeden önce plenositleri fiksasyon veya permeabilizasyon tamponunda yıkayın. Splenositleri karanlıkta 4 santigrat derecede 1 ila 12 saat boyunca inkübe edin. FACS-tamponunda kapsamlı yıkama ve resüsitasyondan sonra, makalede açıklanan geçit stratejisine göre sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu analiz edin.Temsili görüntüde, sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu analiz etmek için geçit stratejisi gösterilmektedir. Hücreler tek hücreler, lenfosit alt kümesi, canlı CD3-pozitif T hücreleri ve CD4-negatif CD8-pozitif sitotoksik T hücreleri olarak kapılıydı. İnterferon gamanın hücre içi birikimi, aktivasyon için vekil bir belirteç olarak değerlendirildi.Tümör hücrelerinden türetilen EV'lerle bağışıklamadan sonra, alıcı farelerde antijene özgü T hücresi yanıtlarının indüksiyonu incelenmiştir. Oksaliplatin tedavisi gibi genotoksik stres koşulları altında kültürlenen tümör kaynaklı EV'ler, tedavi edilmemiş EV'lerin aksine, dalak sitotoksik T hücrelerinin güçlü aktivasyonunu indükledi. Araçla tedavi edilen hayvan grubu en düşük yanıtı gösterdi.Dalak T hücrelerinin aktivasyonu, ovalbümin varlığında veya yokluğunda ex vivo restimüle edildikten sonra belirlendi. İnterferon gama üretimi, tümör EV ile tedavi edilen hayvanların plenositleri, analizden önce model tümör antijeni ovalbümin ile yeniden uyarıldığında artmıştır. Tekrarlanabilir sonuçların EV'lerin sürekli izolasyon etkinliğine dayandığını lütfen unutmayın.Bu nedenle, kurumayı önlemek için EV peletlerinin tamamen ve derhal yeniden askıya alındığından emin olun. Bu protokolle, tümör hücresi kaynaklı EV'lerin immünojenisitesini belirleyen tümör hücreleri içindeki spesifik yolları analiz edebildik. Bu, kanser tedavisinde bu tür immünojenik EV'lerden yararlanmanın yolunu açabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

ΓH2AX ve Apoptosis'in Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Embriyonik Kök Hücrelerden Granülosit-Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Taşıyan EkzozomLa Zenginleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...