Name: bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), Canada Foundation for Innovation (Project # 38710) og Major Innovation Fund, Alberta. Vi takker Dr. John Kastelic for at redigere manuskriptet.

1. Udarbejdelse af buffer og reagenser
<ol><li>Lav 500 mL tryptisk soja bouillon (TSB) (15 g TSB pulver og 500 mL ultrapure vand) og autoklave. BEMÆRK: Dette kan opbevares ved stuetemperatur i op til 3 måneder eller ved 4 °C i op til 6 måneder.</li>
	<li>Lav 500 mL tryptisk soja agar (TSA) (20 g TSA pulver og 500 mL ultrapure vand) og autoklave. BEMÆRK: Dette kan opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.</li>
	<li>Der fremstilles 500 mL fosfatbuffered saltvand (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,77 g Na2HPO4 og 0,12 g KH2PO4, 500 mL ultrapure vand), måle og justere pH til 7,2 ± 0,2 ved 25 °C og autoklave. BEMÆRK: Dette kan opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder.</li>
	<li>Der fremstilles 200 mL 1 M MgSO4 (49.294 g og 200 mL ultrapurt vand) og steriliseres via 0,22 μm polyethersulfonfilter.</li>
	<li>Der fremstilles 500 mL TSB med 10 mM MgSO4 (mTSB; 15 g TSB-pulver, 500 mL ultrapure vand og 5 mL 1 M MgSO4) og autoklave. lad det autoklavede medie køle af til stuetemperatur. Påfør den aseptiske teknik. Ved hjælp af en serologisk pipette overføres 5,0 mL 1 M MgSO4 forsigtigt. hvirvle forsigtigt for at blande.</li>
</ol>2. Forberedelse af bakteriekultur
<ol><li>For at forberede bakterieforskningslaboratoriet kultur (BRLC), fjerne glycerol lager hætteglas (r) fra fryseren opgørelse og overførsel til laboratoriet.</li>
	<li>Brug en engangs-podningsløkke eller tilsvarende, dyp i hætteglasset, fjern en skrabning af inoculum (frossen sjap) og stribe på en TSA plade eller tilsvarende i et niveau II biologisk sikkerhedsskab. Pladen inkuberes ved 37 ± 2 °C i 15−18 timer.</li>
	<li>Sæk de forberedte BRLC-plader og opbevares ved 4 °C. BEMÆRK: Generel udløbsperiode for BRLC: 14 dage ved 4 °C efter generation.</li>
	<li>Pod en enkelt koloni af hver E. coli O157 stamme fra BRLC plader, der skal testes i 10 mL TSB og statisk inkubere ved 37 °C for 18 timer at nå 9 log10 CFU/mL.</li>
	<li>Forbered en seriel fortynding af natten kulturer (den følgende morgen), hver E. coli O157 stamme ved hjælp af mTSB indeholder 10 mM mgSO4 for at opnå 4-5 log10 CFU/ml (eller andre ønskede inoculum niveau).</li>
	<li>Bland et lige volumen af en overnatning kultur af hver stamme for at opnå 4-5 log10 CFU/ mL i alt (eller som ønsket) til at forberede bakterieblandingen.</li>
	<li>Placer straks den fortyndede bakteriekultur ved 4 °C til afventende brug.</li>
	<li>Fortynd inoculumkulturen 10 eller 100 gange og plade 0,1 mL aliquots af disse fortyndinger på TSA-pladerne for at opnå de isolerede kolonier.</li>
</ol>3. Udarbejdelse af phage arbejdsløsninger
<ol><li>Formere arbejdslagre med høj titer for hver phage, der skal screenes (≥108 PFU/mL) ved at følge standardmetoderne4. BEMÆRK: Den generelle udløbsdato for phagelagrene er 3 måneder i en plastflaske ved 4 °C efter generation.</li>
	<li>For at opnå den ønskede titer af fx ~108 PFU/mL for lysis kinetics fortyndes individuelle phagepræparater med mTSB indeholdende 10 mM MgSO4. Forbered phage cocktails ved at blande lige store mængder af hver arbejdslager med den samme titer i alle mulige kombinationer.</li>
</ol>4. Forberedelse af in vitro lysis kinetik til individuelle phage- og phagecocktails
<ol><li>Forbered seriel 10-fold fortyndinger af hver phages i kolonne 1-8 i sterile 96-brønd mikroplader til at oprette mikroplade assay. BEMÆRK: Fire phages mod en bakteriestamme kan testes i dubletter, i tilstødende kolonner, på hver plade. De resterende fire kolonner er til kontrolelementer, som er uden phage, samt mTSB tom (Figur 1).</li>
	<li>Placer 180 μL mTSB til brønde fra kolonne 1 til 12 af den 96-brønds mikroplade.</li>
	<li>Tilsæt 20 μL fortyndede individuelle phages eller phage cocktails (~ 108 PFU / mL) til brønde 1-8 af den øverste række af mikropladen (række A).</li>
	<li>For den phagefri og blanke kontrol tilsættes 20 μL mTSB til topbrøjen i kolonne 9, 10 og 11.</li>
	<li>Med en 12-kanals pipette fortyndes pladen. Overfør 20 μL fra række til række. Bland brøndens indhold med blid, gentagen aspiration, udslyngning (mindst fem gange) og skift tip mellem fortyndinger. Fjern 20 μL fra den sidste række (række H). BEMÆRK: Det anbefales at bruge tip med filtre for at forhindre krydskontaminering.</li>
	<li>Opret et reservoir for hver stamme, brug 1 mL pipette til at overføre 2-3 mL af den fortyndede kultur til reservoiret. For kolonne 1-10 skal du bruge en multikanalpipette til at tilføje 20 μL af den fortyndede bakteriekultur til hver brønd. Skift tip mellem hver tilføjelse.</li>
	<li>Dæk og inkuber mikropladen under de ønskede forhold (f.eks. 37 °C i 10 timer eller 22 °C i 22 timer).</li>
	<li>Med 2 timer eller andre ønskede intervaller fjernes mikropladerne fra inkubatoren.</li>
</ol>5. Bestemmelse af optisk densitet
<ol><li>Undersøg for optisk tæthed ved 600 nm (OD600nm) ved hjælp af en Microplate Reader. BEMÆRK: Det anbefales at opsætte og gemme analyseprotokollen i programmet før præparat af testplade.</li>
	<li>Tænd for mikropladelæseren, og åbn programmet.</li>
	<li>Vælg tilstanden Simpel i vinduet Startindstillinger, og vælg Opret en ny protokol i Jobliste (supplerende figur 1a,b).</li>
	<li>Vælg 96 Brøndplade på rullelisten (supplerende figur 2) i vinduet Vælg pladetype.</li>
	<li>Vælg Absorbans til registreringsmetode, indstillingen Slutpunkt/Kinetisk for læsetype og Monokrome til optiktype. Klik på OK (supplerende figur 3).</li>
	<li>For Læs Trin skal du indtaste 600 nm for bølgelængder og vælge Normal for læsehastighed. Klik på OK (supplerende figur 4).</li>
	<li>Hvis du vil indstille temperaturen for analysen, skal du klikke på afkrydsningsfeltet Inkuber og vælge Inkubator til. Angiv den ønskede temperatur i boksen Temperatur . Klik på OK. For at forhindre kondens på pladelåget under inkubation skal du indstille en temperaturgradient ved at indtaste en værdi (1-3) i gradientboksen . Klik på OK (supplerende figur 5a). BEMÆRK: Klik på forvarmningen, før du fortsætter med det næste trin for inkubationstemperaturen på 37 °C. Dette trin er ikke nødvendigt for testtilstanden ved 22 °C (RT).</li>
	<li>Klik derefter på afkrydsningsfeltet Kinetisk for at åbne den kinetiske opsætning. Sæt køretiden til 10 timer for 37 °C inkubation eller 22 timer for RT. Indtast 2 timer for læseinterval. Klik på OK (supplerende figur 5b).</li>
	<li>Klik på afkrydsningsfeltet Ryst i vinduet Procedure for at konfigurere rystetilstanden, hvis det er nødvendigt, for hver kinetisk læsning (supplerende figur 6a).</li>
	<li>Vælg Lineær for Shake Modes og skift varighed til 30 s. Angiv lineær frekvensværdi til 731 cpm (2 mm), og klik derefter på OK (supplerende figur 6b).</li>
	<li>Klik på Pladelayout i vinduet Protokoloversigtsdialog, og vælg Blanks, Analysekontrolelementer og Eksempler. Klik på Næste (supplerende figur 7). BEMÆRK: Skriv 1 i Antal forskellige kontroltyper for negativt kontrolelement.</li>
	<li>Når du har defineret indstillingerne for hver brøndtype, skal du klikke på Udfør.</li>
	<li>Vælg et Godt id i venstre sidegrænseflade, og tildel det derefter til den matrix, der vises i pladelayoutet enke. Klik på OK (supplerende figur 8).</li>
	<li>Klik på knappen Læs plade, og gem protokollen som en .prt-fil, og klik på Gem (supplerende figur 9).</li>
	<li>Indsæt pladen og klik på OK.</li>
	<li>Når eksperimentet er fuldført, skal du gemme eksperimentet som en .xpt-fil og klikke på Gem (supplerende figur 10).</li>
	<li>Eksporter data til Excel ved at klikke på knappen Ja i meddelelsesvinduet for yderligere analyse (supplerende figur 11).</li>
	<li>Klik på indstillingen Gem ja/nej, og afkrydsningsfeltet Spørg ikke igen for at gemme indstillingen.</li>
</ol>6. Dataanalyser
<ol><li>Gentag mindst to uafhængige eksperimenter som beskrevet ovenfor. Kompiler resultater fra alle de uafhængige forsøg. Beregn od600'ens gennemsnitlige og standardafvigelse fra hver phage-behandlet og -fri kultur.</li>
	<li>Udfør kvadratroden af OD-værdierne ved 600 nm og analysere dem ved hjælp af en passende statistisk model for hver bakteriestamme og temperatur. BEMÆRK: For SAS-software vælges MIXED-modellen og de mindst firkanter til at differentiere midler (P < 0,05). For hver stamme tildeles paneler A−G til hver phagebehandling, hvoraf den samlede anti-O157-effekt på tværs af tid og MOI'er varierede (P < 0,05).</li>
	<li>Definer overlegen phage-effekt baseret på OD600nm-værdi ≤ 0,01 svarende til ingen påviselig bakterievækst (grænse for påvisning:300 CFU/mL).<ol>
<li>Analysere virkningerne af tid, inkubation temperatur, E. coli O157 stammer, MOIs, og phage typer på phage effektivitet ved hjælp af en passende statistisk model. BEMÆRK: For SAS-software skal du bruge GLIMMIX med tilfældige foranstaltninger.</li>
		<li>Beregn oddsforhold for at sammenligne overlegen effekt for forskellige miljømæssige og biologiske faktorer af interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections.">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li><li>Czaplewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+antibiotics-a+pipeline+portfolio+review.">Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).</li><li>Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+therapy+in+bacterial+infections+treatment:+one+hundred+years+after+the+discovery+of+bacteriophages.">Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Escherichia+coli+O157+on+beef+at+37,+22+and+4&#176;C+by+T5-,+T1-,+T4-and+O1-like+bacteriophages.">Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4&#176;C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages.</a> Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).</li><li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing.">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), (2018).</li><li>Ly-Chatain, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factors+affecting+effectiveness+of+treatment+in+phages+therapy.">The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy.</a> Frontiers in Microbiololgy. 5, 51 (2014).</li><li>Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-based+biocontrol+strategies+and+their+application+in+agriculture+and+aquaculture.">Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).</li><li>Bourdin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coverage+of+diarrhoea-associated+Escherichia+coli+isolates+from+different+origins+with+two+types+of+phage+cocktails.">Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails.</a> Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).</li><li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+individual+bacteriophages+does+not+predict+efficacy+of+bacteriophage+cocktails+for+control+of+Escherichia+coli+O157.">Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157.</a> Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712 (2021).</li><li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+bacteriophage+T5virus+on+growth+of+Shiga+toxigenic+Escherichia+coli+and+Salmonella+strains+in+individual+and+mixed+cultures.">Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures.</a> Virology Journal. 17, 3 (2020).</li><li>Br&#252;ssow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+needed+for+phage+therapy+to+become+a+reality+in+Western+medicine.">What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine.</a> Virology. 434 (2), 138-142 (2012).</li><li>Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+cocktails+and+the+future+of+phage+therapy.">Phage cocktails and the future of phage therapy.</a> Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).</li><li>Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+therapy:+developments+and+directions.">Bacteriophage therapy: developments and directions.</a> Antibiotics. 9 (3), 135 (2020).</li><li>Niu, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+range+and+lytic+capability+of+four+bacteriophages+against+bovine+and+clinical+human+isolates+of+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli+O157:H7.">Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle relationer, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Denne protokol beskrev en robust tilgang til systemisk evaluering af phage-effekten mod fødevarebårne patogener, herunder STEC9 og Salmonella10. Et kritisk skridt er, når fortynding natten kultur af bakterier, ved hjælp af prækølet medium og manipulere fortynding med en is spand anbefales at minimere potentielle bakterievækst. Derudover blev phage fortynding udarbejdet før fortynding af bakteriekultur. Optællingstrin 2.8 indeholdt faktiske antal bakteriel inoculum til beregning af den endelige moi anvendt. Til phagepræparat anvendes rå phage lysater fremstillet af filter phage inficeret i 4-6 timer af bakteriekulturen generelt. Det kritiske skridt forbundet med phage infectivity er altid at bruge phage arbejde bestande udarbejdet inden for 3 måneder. Ekstremt nøjagtig pipettering (især ved brug af en multikanalpipette) og ensartet tilgang er også afgørende for at opnå sammenlignelige og fortolkelige resultater. Modificeret TSB suppleret med 10 mM Mg2+ blev brugt til at fortynde phages, bakteriekultur og basismedium for at optimere adsorption og infektion af phages.
Som bakterier formere sig i log fase, selv under inkubator temperatur, anbefales det at bruge fortyndet natten kultur i stedet for log-fase kultur, for at minimere potentielle bakterievækst.
Den foreslåede protokol har begrænsninger. For det første, fordi mikropladen kun kan rumme 200 μL, kan langvarig inkubation forårsage betydelig fordampning og anbefales ikke. I dette tilfælde er analysen muligvis ikke egnet til langsomt voksende bakterier. For det andet var den foreslåede protokol ikke i stand til at overvåge forstærkningen af phages. For det tredje kunne denne protokol ikke overvåge udviklingen af phage resistens over tid, en kritisk faktor, der bestemmer resultatet af phage behandling11,12. Opfølgende eksperimenter er nødvendige for at vurdere den videre ydeevne af den mest indflydelsesrige cocktail i screeningen for at forhindre fremkomsten af anti-phage mutanter i et omfattende bouillonkultursystem og andre biologiske matricer.
I modsætning til konventionelle antimikrobielle stoffer påvirker phages biologiske karakter kompleksiteten af biokontrol og terapeutisk brug i praktiske indstillinger. Konventionelt er rationelt udvalg af phage cocktails primært baseret på lytisk aktivitet og værtssortimentet af phages. Ph.d.-kandidater med den stærkeste aktivitet og bredeste værtsområde anbefales ofte13,14. På grundlag af den aktuelle undersøgelse lettede phages som rV5 og T1, selv om de alene ikke var så virulent som T4 og T5, imidlertid i høj grad det samlede biocontrol-resultat, når de kombineres med T4 og/eller T5. For at opnå overlegen effekt af phage cocktails anbefales det derfor at udføre systemisk screening af antibakteriel aktivitet af potentielle phagekombinationer mod målrettede værtsstammer under de ønskede miljøforhold. Derudover kan bestemmelse af receptorer for phage kandidater og inddragelse af phages med forskellige receptorer forhindre konkurrence om værtstilbehør, forpurre hurtig udvikling af anti-phage mutanter og forbedre biocontrol resultater13.
Denne metode muliggjorde nøjagtig kvantificering af phage lysis kinetik i et format med høj gennemløb. Desuden tillod det systematisk evaluering af forskellige biologiske og miljømæssige faktorer på den antibakterielle effekt af et sortiment af phages, hvilket lettede formuleringen af phage cocktails med optimerede resultater. Metodens fremtidige anvendelse og udvikling antages at indebære in situ overvågning af effekten af hver phages inden phage cocktails ved fluorescens mærkning af phages. Ud over den foreslåede protokol, forståelse af genetiske determinanter, der fremmer synergistiske og lettede virkninger mellem phages, når co-inficere en vært ville lette formuleringen af passende phage cocktails med overlegen effektivitet.

Bakterielofager (phages) er vira, der naturligt invaderer bakterieceller, forstyrrer bakteriel metabolisme og forårsager lysis af bakterien. I modsætning til konventionelle antimikrobielle stoffer (f.eks. antibiotika) er phage-værtsspektrum relativt smalle, kan kun inficere et målrettet sæt bakteriearter eller stammer og bør derfor minimere følgevirkningerne på mikrobiota, der gavner dyrs og menneskers sundhed. Med stigningen i antimikrobiel resistens (AMR) fører phages og deres derivater til alternative antimikrobielle stoffer til bekæmpelse af bakterielle infektionssygdomme, herunder AMR bakterielle infektioner hos mennesker og dyr1,2. Phages har bekræftet terapeutisk potentiale mod >20 bakterielle patogener, der forårsager overfladiske infektioner og infektioner i det øvre luftvejssystem og mave-tarmkanalen hos mennesker3.
I landbrugsmiljøer er en phage-baseret biocontrol-strategi den terapeutiske anvendelse af phages til at kontrollere bakteriepatogener. Phage biocontrol er godt accepteret som en grøn teknologi, effektiv til dekontaminering af fødevarebårne patogener (f.eks Shiga-toksin producerer Escherichia coli (STEC), Salmonella, og Listeria) i forskellige fødevarer4,5. Derudover kan phages bruges som sanitizers til at desinficere fødevareforarbejdningsoverflader og dyrehuder, som kan integreres i konventionelle antimikrobielle systemer (f.eks. kemikalier, damp og varmtvandspastaurisering) for at forbedre de ønskede resultater og reducere miljøpåvirkningerne. Brugen af phages til at reducere zoonotiske bakterier hos dyr er også lovende1. Der er imidlertid behov for at tage fat på de tekniske udfordringer for at forbedre resultaterne af phage biocontrol-tilgangen, der skal anvendes populært i forskellige fødevareproduktionssystemer. Den største udfordring er den nedsat effektivitet af phages på grund af udviklingen af bakterieresistente mutanter5 og ændringer i bakteriefysiologi på grund af eksponering for miljømæssige stressfaktorer6.
For at minimere risikoen for phage resistens foreslås phage cocktails (dvs. en kombination af flere phages) og har forbedret biocontrol styrke i landbrug og akvakultur indstillinger7. Men fra flere undersøgelser er det blevet bevist, at phage cocktails ikke altid tilbyde bedre effektivitet end administrationen af en enkelt phage. For eksempel havde en cocktail af 3 T4-lignende phages et smallere værtsområde mod E. coli stammer8. Desuden havde AKFV33, et medlem af Tequintavirus, større effekt end en cocktail af fire phages ved at fjerne E. coli O157 fra oksekød, på trods af de anvendte inkubationstemperaturer4. For nylig er det blevet rapporteret, at effektiviteten af individuelle phages ikke forudsige effekten af phage cocktails til kontrol af O1579, som interaktioner mellem flere phages kan ændre effekten. Vigtigst er det, at mange faktorer, såsom phage slægter og kombinationer, målrettede stammer og MOI'er, og inkubationstemperaturer og -tider, kan påvirke interaktioner mellem phages. Derfor er omhyggeligt screening kombinationer af phages mod specifikke bakterier til at vurdere phage synergi eller lettelse, eller i det mindste for at sikre minimal phage antagonisme under specifikke miljøforhold, afgørende vigtigt for optimale resultater. Her beskrives en metode til systematisk at vurdere effekten af forskellige phagekombinationer mod fødevarebårne patogener under en række miljøforhold. Fordelen ved denne tilgang er at muliggøre screening af alle mulige biotiske og abiotiske faktorer forventes at påvirke antibakterielle effekt af phages i naturlige indstillinger. I protokollen anvendes STEC O157 og deres inficerende phages som eksempel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essential supplies, reagents, and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374361</td>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Diameter: 100 mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17013808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips RT LTS 1000&#181;L FL 768A/8-low retention</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 20&#181;L F 960A/5</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 300&#181;L 768A/4</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005867</td>
			<td>no filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>168055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar (TSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105458-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105459-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Shaped Cell Spreaders</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76299-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Microbiological Incubators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50125590H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer Hotplates</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-889-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon Stir Bars</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>14-512-125</td>
			<td>length: 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BTNEO2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>9.4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings

Bakteriepatogener udfordrer løbende fødevaresikkerhedssystemer over hele verden. Med stigende bekymring over fremkomsten af varme- og sanitizer-resistente bakterier, nye antibakterielle midler, er presserende behov. En bakteriofagebaseret biocontrolstrategi er den terapeutiske anvendelse af phages til at kontrollere bakteriepatogener i landbrugsmiljøer. Phage biocontrol accepteres i stigende grad som en bæredygtig teknologi, der er effektiv til dekontaminering af fødevarebårne patogener. For at sikre effektive biokontrolresultater er systematisk screening af phagekombinationer mod målrettede bakterier under de krævede miljøforhold afgørende. Antibakteriel effekt af phage cocktails kan blive påvirket af phage slægter og kombination, målrettede bakteriestammer, mangfoldigheden af infektion, temperatur, og tid. For at formulere en phage cocktail med overlegen effekt var den foreslåede metode systematisk at evaluere effektiviteten af individuelle phages og phage cocktails ved at dræbe fødevarebårne bakteriepatogener under målrettede forhold. Bakteriel aflivning effekt blev overvåget ved at måle optisk tæthed ved ønskede temperaturer og varigheder. Overlegen phage effekt blev bestemt ved fuldstændig hæmning af bakterievækst. Den foreslåede metode er en robust, evidensbaseret tilgang til at lette formuleringen af phage cocktails med overlegen antibakteriel effekt.

Efter protokollen blev der foretaget en sammenligning af anti-O157 phage-effekten med forskellige phagekombinationer, temperaturer, tider og MOI'er. Virkninger af inkubation temperatur og tider, MOIs, phages, og bakteriestammer, der anvendes til at øge anti-E. coli O157 effekt er præsenteret i tabel 1 (odds ratio tabel)9. Procentdelen (%) af optisk turbiditetsmåling ≤ 0,01 udbyttet blev analyseret af hvert phagepræparat under hver eksperimentel tilstand. Baseret på denne analyse blev anti-O157 phage-effekten maksimeret efter 14, 16 eller 18 timers inkubation ved 22 °C (P < 0,001) og MOI = 1000 (P < 0,001), idet henholdsvis 75 % og 89 % af væksten af phagebehandlet kultur er helt hæmmet. Generelt var en cocktail af T1, T4 og rV5 blandt 11 phagepræparater mest effektiv (P < 0,05) mod O157. Derudover varierede følsomheden over for phages på tværs af inkubationstemperaturer, tider, MOI'er og phages, idet O157-stammerne blev testet med stamme CO281-31N mest følsomme (P < 0,001) og 3081 (P < 0,001) mindst følsomme over for phages.
For at forstå phage-drab kinetik af hver bakteriestamme testet, OD600 værdi blev plottet mod hver prøveudtagning tid, MOIs, og phage behandling ved hver inkubation temperatur. Repræsentative resultater fra effekten af phages mod E. coli O157 3081 ved 37 °C er vist i figur 2. Det sikres, at vækstkurven for phage-fri kontrolkultur er normal, før man vurderer hæmning af vækstkurve af phage-behandlet kultur. Ifølge figur 2 hæmmede inddragelsen af T4 fuldstændig bakterievækst ved 37 °C ved hvert prøveudtagningstidspunkt ved en MOI helt ned til 1. For at oversigt over, hvordan phage hæmmet bakterievækst over tid ved forskellige temperaturer, uanset MOIs, den gennemsnitlige OD600nm værdi gennemsnit fra alle MOI (MOI > 0) blev plottet mod hver prøveudtagning tid og phage behandling (Figur 3). Sammenlignet med 37 °C blev den særlige phage-aflivning, f.eks. En anden metode til at opsummere og sammenligne den samlede anti-O157-effektivitet blandt phages er vist i tabel 2 og tabel 39. OD600-værdien blev i gennemsnit fra hver prøvetagningstid og moi og rangeret phage-effekt fra højeste (A) til laveste (F: 37 °C og D: 22 °C). Denne tabel letter identifikationen af den bedste phage behandling. For eksempel var phages T4 og T5 + T4 (panel A) for stamme 3081 den mest effektive behandling ved 37 °C, mens phage T1 + T4, T1 + T4 + rV5 og 4 phage cocktails (panel A) ud over phage T4 var den mest effektive behandling ved 22 °C.
Denne protokol gjorde det også muligt for os at sammenligne phage effektivitet mod forskellige bakteriestammer målrettet og tilpasse phage forberedelse. For eksempel, når du vælger phages, ved 37 °C, eksklusive stamme 3081, phage T1 + T4 + rV5 havde den mest signifikante effektivitet mod alle andre stammer, uanset deres phage typer. Ved 22 °C var 4-phage-cocktailen den mest effektive mod alle testede stammer. De bedste MOI'er resulterede i komplette lysis (OD600 ≤ 0,01), hvilket berettigede potentiel overlegen effekt under forsøgsbetingelser (tabel 2 og tabel 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg"> Figur 1: Foreslået layout af 96-brønd mikroplade assay. Seriel 10-fold fortyndinger af hver phage fremstilles i kolonne 1-8 af sterile 96-brønd mikroplader. Fire phages mod en bakteriestamme kan testes i dupliker, i tilstødende kolonner, på hver plade. De resterende kolonner er til kontrolelementer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg"> Figur 2: Vækstkurver af E. coli O157 stamme 3081 ved 37 °C behandlet og ikke behandlet med phages ved hver MOI. Dataene blev indsamlet fra to uafhængige forsøg. Søjler præsenterer standardafvigelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg"> Figur 3: Vækstkurver af E. coli O157 stamme 3081 stammer. (A) Vækstkurver ved 37 °C. (B) Vækstkurver ved 22 °C. Hver kurve repræsenterer individuelle og blandede kulturer, behandlet og ikke behandlet med phages på tværs af MOIs. Dataene blev indsamlet fra to uafhængige forsøg. Søjler præsenterer standardfejlen i middelværdien (tilpasset fra Reference9 med tilladelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tabel 1: Oddsforhold, der sammenligner sandsynligheden for overlegen phage-effekt med E. coli O157 ved inkubationstemperaturer, inkubationstider, MOI'er, phages og stammer af E. coli O157 (tilpasset fra Reference9 med tilladelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 2: Samlet phage-effekt mod E. coli O157 ved 37 °C (tilpasset fra Reference9 med tilladelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 3: Samlet phage-effekt mod E. coli O157 ved 22 °C (tilpasset fra Reference9 med tilladelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tal 1-11: Snapshots af mikropladelæserens drift og procedurer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank"></a>

Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

Denne protokol beskriver en robust metode til brug af indstillinger med høj gennemløb til at screene den antibakterielle effekt af bakteriofagecocktails.

Bakteriofageeffektivitet for biokontrol af fødevarebårne patogener evalueret via indstillinger for højgennemstrømning

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

Denne nemme at udføre protokol evaluerer antibakterielle effekt af forskellige bakteriofage kombinationer, også kendt som phage cocktails, under varierende forhold i en høj-throughput indstilling. De vigtigste fordele ved teknikken er evnen til at streame forskellige biotika og abiotiske faktorer, såsom temperatur, der kan påvirke phage-effekten under en række miljøforhold. Denne metode kan lette udformningen af passende phage cocktails til at forbedre biokontrol og terapeutiske resultater og bestemme samspillet mellem bakterielle værter og bakteriofager.Til at begynde med skal du konfigurere mikropladeanalysen ved hjælp af filtrerede spidser for at undgå krydskontaminering. Først tilsættes 180 mikroliter af mTSB i brøndene af kolonner en til 12 af 96-brønd mikropladen, derefter forberede serielle tidobbelte fortyndinger af hver phage i kolonne et til otte af de sterile 96-brønd mikroplader til at oprette analysen. Tilsæt 20 mikroliter af individuelle phages eller phage cocktails til brønde en til otte af den øverste række A af mikropladen.For phage-fri og tom kontrol, tilføje 20 mikroliter af mTSB til toppen brønd af kolonner ni til 12. Under pipettering blandes brøndindholdet med blid og gentagen aspiration mindst fem gange og skift af spidser mellem fortyndinger. Fjern 20 mikroliter fra den sidste række H, og opret derefter et reservoir til den testede bakteriestamme ved at overføre to til tre milliliter af den fortyndede kultur til reservoiret ved hjælp af en milliliter pipette.Ved hjælp af en multikanal pipette tilsættes 20 mikroliter af den fortyndede bakteriekultur til hver brønd i kolonne et til 10, mens du ændrer spidser mellem hver tilføjelse. Dæk og inkuber mikropladen ved 37 grader Celsius. Med to timers mellemrum fjernes mikropladen fra inkubatoren og pladen læses ved hjælp af en mikropladelæser.Alternativt inkuberes pladen i en mikropladelæser og læser den over tid. For at undersøge den optiske tæthed ved 600 nanometer ved hjælp af en mikropladelæser skal du åbne programmet på en mikropladelæser. Vælg Simpel tilstand i vinduet Startindstillinger, og vælg derefter Opret en ny protokol i Jobliste.Vælg 96-brønds plade på rullelisten i vinduet Vælg pladetype. Vælg Absorbans for læsetypen som registreringsmetode, vælg Slutpunkt/Kinetisk indstilling for optiktype, vælg Monokrome og klik derefter på OK. For Læs Trin skal du indtaste 600 nanometer for bølgelængder, vælge Normal for læsehastighed og klikke på OK.To indstille temperaturen for analysen, klikke på afkrydsningsfeltet Inkuber og vælge Inkubator On.Indtast den ønskede temperatur i temperaturboksen og klik derefter på OK. Klik på forvarmningen, før du fortsætter med det næste trin for inkubationstemperaturen på 37 grader Celsius, selvom indstillingen ikke er nødvendig for testbetingelserne ved 22 grader Celsius. For at forhindre kondens på pladelåget under inkubationen skal du indstille temperaturgradienten ved at indtaste en værdi i gradientboksen og derefter klikke på OK. Klik derefter på afkrydsningsfeltet Kinetisk for at åbne den kinetiske opsætning.Indstil køretiden i 10 timer for 37 grader Celsius inkubation eller 22 timer for stuetemperatur og indtast to timer som læseinterval, og klik derefter på OK. Klik på afkrydsningsfeltet Ryst i procedurevinduet for at konfigurere rystetilstanden, hvis det er nødvendigt for hver kinetisk læsning. Vælg Lineær som shake mode og ændre varigheden til 30 sekunder. Angiv lineær frekvensværdi til 731 cyklusser i minuttet, og klik derefter på OK.In vinduet Protokoloversigtsdialog, klik på Pladelayout, vælg Blanks, Analysekontrolelementer og Prøver, og klik på Næste.Når du har defineret indstillingerne for hver brøndtype, skal du klikke på Udfør. Vælg et brønd-id i venstre sidegrænseflade, tildel det til den matrix, der vises i vinduet Pladelayout, og klik derefter på OK. Klik på knappen Læs plade, gem protokollen som en prt-fil og klik på Gem. Indsæt pladen og klik på OK. Når eksperimentet er afsluttet, skal du gemme eksperimentet som en xpt-fil og klikke på Gem.Eksporter dataene til Excel ved at klikke på knappen Ja i meddelelsesvinduet for yderligere analyse. Klik på indstillingen Gem ja/nej, og du skal ikke spørge igen for at gemme markeringen. Efter protokollen, en sammenligning af phage effekt med forskellige phage kombinationer, temperaturer, tidspunkter, og mangfoldighed af infektioner, eller MOIs, blev udført.Baseret på denne analyse blev anti-O157 phage-effekten maksimeret efter 14, 16 eller 18 timers inkubation ved 22 grader Celsius. For at forstå phage drab kinetiker af bakterier, OD værdier på 600 nanometer blev plottet mod prøveudtagning tid, MOIs, og phage behandling. De repræsentative bakterievækstkurver ved 37 grader Celsius behandlet er vist.T4 hæmmede fuldstændig bakterievæksten ved hvert prøveudtagningstidspunkt selv ved lav MOI. For at analysere phage hæmmet bakterievækst, de gennemsnitlige OD værdier fra alle MOIs blev plottet mod hver prøveudtagning tid og phage behandling. De repræsentative grafer ved to temperaturer viste, at phage drab effekt, for eksempel, for T1 plus T4 blev forbedret ved 22 grader Celsius sammenlignet med 37 grader Celsius.Sammenligningen af den samlede phage effektivitet er vist, hvilket letter identificere den bedste fase behandling. For eksempel var behandling med phages T4 og T5 plus T4 for Escherichia coli-stamme 3081 den mest effektive behandling ved 37 grader Celsius. Men ved 22 grader Celsius, ud over T4, phage T1 plus T4, T1 plus T4 plus rV5, og fire phage cocktails var effektive.Når du udfører denne procedure, ekstremt præcis pipettering, især når du bruger en multikanal pipette og ensartet tilgang er afgørende for at opnå sammenlignelige og fortolkelige resultater. Opfølgende eksperimenter er nødvendige for at vurdere den videre ydeevne af den mest indflydelsesrige cocktail i screeningen, hvilket forhindrer fremkomsten af antiphage mutanter i et omfattende bouillonkultursystem og andre biologiske matricer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High Throughput Fluorometrisk Teknik for Vurdering af makrofag Fagocytose og actinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging i<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Påvisning af respiratoriske patogener i Animal Prøver af Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En Fluorescens-baserede lymfocyt Assay Egnet til high-throughput screening af små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høj overførselshastighed Shigella-specifikke bakteriedræbende Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...