Name: bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

Cette recherche a été appuyée par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (Subvention de découverte du CRSNG, RGPIN-2019-04384), la Fondation du Canada pour l’innovation (projet no 38710) et le Fonds d’innovation majeure de l’Alberta. Nous remercions le Dr John Kastelic d’avoir édité le manuscrit.

1. Préparation du tampon et des réactifs
<ol><li>Faire 500 mL de bouillon de soja tryptique (TSB) (15 g de poudre de TSB et 500 mL d’eau ultrapure) et autoclave. REMARQUE: Cela peut être conservé à température ambiante jusqu’à 3 mois ou à 4 ° C jusqu’à 6 mois.</li>
	<li>Fabriquer 500 mL de gélose de soja tryptique (TSA) (20 g de poudre de TSA et 500 mL d’eau ultrapure) et autoclave. REMARQUE: Cela peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 3 mois.</li>
	<li>Faire 500 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS; 4 g de NaCl, 0,1 g de KCl, 0,77 g de Na2HPO4 et 0,12 g de KH2PO4, 500 mL d’eau ultrapure), mesurer et ajuster le pH à 7,2 ± 0,2 à 25 °C et autoclaver. REMARQUE: Cela peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 6 mois.</li>
	<li>Faire 200 mL de 1 M MgSO4 (49,294 g et 200 mL d’eau ultrapure) et stériliser via un filtre en polyéthersulfone de 0,22 μm.</li>
	<li>Produire 500 mL de BST avec 10 mM de MgSO4 (mTSB; 15 g de poudre de BST, 500 mL d’eau ultrapure et 5 mL de 1 M MgSO4) et autoclave; laisser le support autoclavé refroidir à température ambiante. Appliquez la technique aseptique. À l’aide d’une pipette sérologique, transférer soigneusement 5,0 mL de 1 M MgSO4; tourbillonner doucement pour mélanger.</li>
</ol>2. Préparation de la culture bactérienne
<ol><li>Pour préparer la culture de laboratoire de recherche bactérienne (BRLC), retirez le ou les flacons de glycérol de l’inventaire du congélateur et transférez-les au laboratoire.</li>
	<li>Utilisez une boucle d’inoculation jetable ou l’équivalent, trempez dans le flacon, retirez un grattage d’inoculum (gadoue congelée) et tracez sur une plaque TSA ou l’équivalent dans une armoire de sécurité biologique de niveau II. Incuber la plaque à 37 ± 2 °C pendant 15−18 h.</li>
	<li>Mettez en sac les plaques BRLC préparées et conservez-les à 4 °C. REMARQUE: Délai d’expiration général pour BRLC: 14 jours à 4 °C après la génération.</li>
	<li>Inoculer une seule colonie de chaque souche d’E. coli O157 à partir des plaques BRLC à tester dans 10 mL de BST et incuber statiquement à 37 °C pendant 18 h pour atteindre 9 log10 UFC/mL.</li>
	<li>Préparer une dilution en série des cultures pendant la nuit (le lendemain matin), chaque souche d’E. coli O157 à l’aide de mTSB contenant 10 mM de MgSO4 pour atteindre 4-5 log10 UFC/ml (ou tout autre niveau d’inoculum souhaité).</li>
	<li>Mélanger un volume égal d’une culture de nuit de chaque souche pour obtenir 4-5 log10 UFC/mL au total (ou selon le souhait) pour préparer le mélange bactérien.</li>
	<li>Placer immédiatement la culture bactérienne diluée à 4 °C pour une utilisation en attente.</li>
	<li>Diluer la culture d’inoculum 10 ou 100 fois et plaquer 0,1 mL aliquotes de ces dilutions sur les plaques TSA pour obtenir les colonies isolées.</li>
</ol>3. Préparation des solutions de travail des phages
<ol><li>Propager des stocks de travail à titre élevé pour chaque phage à dépister (≥108 PFU/mL) en suivant les méthodes standard4. REMARQUE: La période de péremption générale pour les stocks de phages est de 3 mois dans une bouteille en plastique à 4 ° C après la génération.</li>
	<li>Pour obtenir le titre souhaité, par exemple, d’environ 108 PFU/mL pour la cinétique de lyse, diluez les préparations de phages individuelles avec du mTSB contenant 10 mM de MgSO4. Préparez des cocktails de phages en mélangeant des volumes égaux de chaque stock de travail avec le même titre dans toutes les combinaisons possibles.</li>
</ol>4. Préparation de la cinétique de lyse in vitro pour les phages individuels et les cocktails de phages
<ol><li>Préparer des dilutions en série de 10 fois de chaque phage dans les colonnes 1 à 8 dans des microplaques stériles de 96 puits pour mettre en place le test de microplaques. REMARQUE: Quatre phages contre une souche bactérienne peuvent être testés en double, dans des colonnes adjacentes, sur chaque plaque. Les quatre colonnes restantes sont destinées aux contrôles, qui sont sans phage, ainsi qu’au mTSB vide (Figure 1).</li>
	<li>Placer 180 μL de mTSB dans les puits des colonnes 1 à 12 de la microplaque de 96 puits.</li>
	<li>Ajouter 20 μL de phages individuels dilués ou de cocktails de phages (~108 PFU/mL) aux puits 1 à 8 de la rangée supérieure de la microplaque (rangée A).</li>
	<li>Pour le contrôle sans phage et vide, ajoutez 20 μL de mTSB au puits supérieur des colonnes 9, 10 et 11.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette à 12 canaux, diluer la plaque. Transférez 20 μL d’une ligne à l’autre. Mélanger le contenu du puits par aspiration douce et répétée, éjection (au moins cinq fois) et changement d’embouts entre les dilutions. Retirez 20 μL de la dernière ligne (ligne H). REMARQUE: L’utilisation de pointes avec des filtres est recommandée pour éviter la contamination croisée.</li>
	<li>Installez un réservoir pour chaque souche, utilisez une pipette de 1 mL pour transférer 2 à 3 mL de la culture diluée dans le réservoir. Pour les colonnes 1 à 10, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 20 μL de la culture bactérienne diluée à chaque puits. Changez les conseils entre chaque ajout.</li>
	<li>Couvrir et incuber la microplaque aux conditions souhaitées (par exemple, 37 °C pendant 10 h ou 22 °C pendant 22 h).</li>
	<li>À 2 h ou à d’autres intervalles souhaités, retirez les microplaques de l’incubateur.</li>
</ol>5. Détermination de la densité optique
<ol><li>Examinez la densité optique à 600 nm (OD600nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques. REMARQUE: Il est conseillé de configurer et d’enregistrer le protocole d’essai dans le programme avant la préparation de la plaque d’essai.</li>
	<li>Allumez le lecteur de microplaques et ouvrez le programme.</li>
	<li>Sélectionnez le mode Simple dans la fenêtre Options de démarrage et sélectionnez Créer un nouveau protocole dans le Gestionnaire des tâches (Figure supplémentaire 1a,b).</li>
	<li>Dans la fenêtre Sélectionner le type de plaque , choisissez 96 Plaque de puits dans la liste déroulante (Figure supplémentaire 2).</li>
	<li>Sélectionnez Absorbance pour la méthode de détection, l’option Endpoint/Kinetic pour le type de lecture et Monochromateurs pour le type optique. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 3).</li>
	<li>Pour Read Step (Étape de lecture), entrez 600 nm pour les longueurs d’onde et sélectionnez Normal (Normal ) pour la vitesse de lecture. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 4).</li>
	<li>Pour régler la température du test, cochez la case Incuber et sélectionnez Incubateur activé. Entrez la température souhaitée dans la zone Température . Cliquez sur OK. Pour éviter la condensation sur le couvercle de la plaque pendant l’incubation, définissez un gradient de température en entrant une valeur (1-3) dans la zone Gradient . Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 5a). REMARQUE: Cliquez sur la case à cocher Préchauffer avant de passer à l’étape suivante pour la température d’incubation de 37 ° C. Cette étape n’est pas requise pour l’état d’essai à 22 °C (RT).</li>
	<li>Ensuite, cliquez sur la case à cocher Kinetic pour ouvrir la configuration cinétique. Réglez la durée d’exécution sur 10 h pour une incubation de 37 °C ou sur 22 h pour RT. Entrez 2 h pour l’intervalle de lecture. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 5b).</li>
	<li>Cochez la case Shake dans la fenêtre Procédure pour configurer la condition de secousse, si nécessaire, pour chaque lecture cinétique (Figure supplémentaire 6a).</li>
	<li>Sélectionnez Linéaire pour les modes de secousse et modifiez durée à 30 s. Réglez la valeur fréquence linéaire sur 731 cpm (2 mm), puis cliquez sur OK (Figure supplémentaire 6b).</li>
	<li>Dans la fenêtre Dialogue de résumé du protocole , cliquez sur Disposition des plaques et sélectionnez Blancs, Contrôles de dosage et Échantillons. Cliquez sur Suivant (Figure supplémentaire 7). REMARQUE : Entrez 1 dans Nombre de types de contrôle différents pour le contrôle négatif.</li>
	<li>Après avoir défini les paramètres pour chaque type de puits, cliquez sur Terminer.</li>
	<li>Sélectionnez un ID de puits dans l’interface de gauche, puis affectez-le à la matrice affichée dans la veuve de la disposition de la plaque. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 8).</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Lire la plaque et enregistrez le protocole en tant que fichier .prt et cliquez sur Enregistrer (Figure supplémentaire 9).</li>
	<li>Insérez la plaque et cliquez sur OK.</li>
	<li>Une fois l’expérience terminée, enregistrez-la sous forme de fichier .xpt et cliquez sur Enregistrer (Figure supplémentaire 10).</li>
	<li>Exportez les données vers Excel en cliquant sur le bouton Oui dans la fenêtre de message pour une analyse plus approfondie (Figure supplémentaire 11).</li>
	<li>Cliquez sur la sélection Enregistrer Oui/Non et sur la case à cocher Ne plus demander pour enregistrer la préférence.</li>
</ol>6. Analyses des données
<ol><li>Répétez au moins deux expériences indépendantes comme décrit ci-dessus. Compiler les résultats de tous les essais indépendants. Calculer l’écart-type moyen et l’écart-type de l’OD600 par rapport à chaque culture sans phages.</li>
	<li>Effectuer la racine carrée des valeurs OD à 600 nm et les analyser à l’aide d’un modèle statistique approprié pour chaque souche bactérienne et température. REMARQUE: Pour les logiciels SAS, le modèle MIXED et les moindres carrés pour différencier les moyennes (P < 0,05) sont sélectionnés. Pour chaque souche, attribuez les panels A−G à chaque traitement par phages dont l’efficacité globale de l’anti-O157 au fil du temps et les ME différaient (P < 0,05).</li>
	<li>Définir une efficacité phage supérieure basée sur la valeur OD600nm ≤ 0,01 correspondant à aucune croissance bactérienne détectable (limite de détection: 300 UFC / mL).<ol>
<li>Analyser les effets du temps, de la température d’incubation, des souches d’E. coli O157, des MEI et des types de phages sur l’efficacité des phages à l’aide d’un modèle statistique approprié. REMARQUE: Pour les logiciels SAS, utilisez GLIMMIX avec des mesures aléatoires.</li>
		<li>Calculez les rapports de cotes pour comparer l’efficacité supérieure pour différents facteurs environnementaux et biologiques d’intérêt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections.">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li><li>Czaplewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+antibiotics-a+pipeline+portfolio+review.">Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).</li><li>Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. 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Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de relations commerciales ou financières qui pourraient être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.

Ce protocole décrivait une approche robuste pour évaluer systématiquement l’efficacité des phages contre les agents pathogènes d’origine alimentaire, y compris STEC9 et Salmonella10. Une étape critique consiste à diluer la culture de bactéries pendant la nuit, à utiliser un milieu pré-réfrigéré et à manipuler la dilution avec un seau à glace pour minimiser la croissance bactérienne potentielle. De plus, la dilution des phages a été préparée avant la dilution de la culture bactérienne. L’étape de dénombrement 2.8 a fourni le nombre réel d’inoculum bactérien pour le calcul de la ME finale appliquée. Pour la préparation des phages, on utilise généralement des lysats de phages bruts préparés par des phages filtrants infectés dans 4 à 6 heures de culture bactérienne. L’étape critique associée à l’infectiosité des phages est toujours d’utiliser des stocks de travail des phages préparés dans les 3 mois. Un pipetage extrêmement précis (en particulier lors de l’utilisation d’une pipette multicanal) et une uniformité d’approche sont également essentiels pour obtenir des résultats comparables et interprétables. Le BST modifié complété par 10 mM de Mg2+ a été utilisé pour diluer les phages, la culture bactérienne et le milieu de base afin d’optimiser l’adsorption et l’infection des phages.
Comme les bactéries prolifèrent pendant la phase logarithmique, même en dessous de la température de l’incubateur, il est recommandé d’utiliser une culture diluée pendant la nuit au lieu d’une culture log-phase, afin de minimiser la croissance bactérienne potentielle.
Le protocole proposé comporte des limites. Tout d’abord, comme la microplaque ne peut contenir que 200 μL, une incubation prolongée peut provoquer une évaporation importante et n’est pas recommandée. Dans ce cas, le test peut ne pas convenir aux bactéries à croissance lente. Deuxièmement, le protocole proposé n’était pas en mesure de surveiller l’amplification des phages. Troisièmement, ce protocole n’a pas pu surveiller le développement de la résistance aux phages au fil du temps, un facteur critique qui détermine l’issue du traitement par phages11,12. Des expériences de suivi sont nécessaires pour évaluer les performances ultérieures du cocktail le plus influent dans le dépistage dans la prévention de l’émergence de mutants anti-phages dans un vaste système de culture de bouillon et d’autres matrices biologiques.
Contrairement aux antimicrobiens conventionnels, la nature biologique des phages affecte la complexité du biocontrôle et de l’utilisation thérapeutique dans des contextes pratiques. Classiquement, la sélection rationnelle des cocktails de phages est principalement basée sur l’activité lytique et la gamme de phages hôtes. Les candidats phages ayant la plus forte activité lytique et la gamme d’hôtes la plus large sont souvent recommandés13,14. Cependant, d’après la présente étude, des phages tels que le rV5 et le T1, bien qu’ils ne soient pas aussi virulents que le T4 et le T5, ont grandement facilité les résultats globaux de la biocontrôle lorsqu’ils sont combinés avec T4 et / ou T5. Par conséquent, pour obtenir une efficacité supérieure des cocktails de phages, il est recommandé de dépister systématiquement l’activité antibactérienne des combinaisons potentielles de phages contre des souches hôtes ciblées dans les conditions environnementales souhaitées. En outre, la détermination des récepteurs pour les candidats phages et l’inclusion de phages avec divers récepteurs peuvent empêcher la compétition pour l’attachement de l’hôte, contrecarrer le développement rapide de mutants anti-phages et améliorer les résultats du biocontrôle13.
Cette méthode a permis une quantification précise de la cinétique de la lyse des phages dans un format à haut débit. En outre, il a permis une évaluation systématique de divers facteurs biologiques et environnementaux sur l’efficacité antibactérienne d’un assortiment de phages, facilitant ainsi la formulation de cocktails de phages avec des résultats optimisés. Les applications et le développement futurs de la méthode sont supposés impliquer une surveillance in situ de l’efficacité de chaque phage dans les cocktails de phages par marquage par fluorescence des phages. En plus du protocole proposé, la compréhension des déterminants génétiques qui favorisent les effets synergiques et facilités entre les phages lors de la co-infection d’un hôte faciliterait la formulation de cocktails de phages appropriés avec une efficacité supérieure.

Les bactériophages (phages) sont des virus qui envahissent naturellement les cellules bactériennes, perturbant le métabolisme bactérien et provoquant la lyse de la bactérie. Contrairement aux antimicrobiens conventionnels (p. ex. antibiotiques), les spectres des hôtes des phages sont relativement étroits, ne pouvant infecter qu’un ensemble ciblé d’espèces ou de souches bactériennes et devraient donc minimiser les effets collatéraux sur le microbiote qui sont bénéfiques pour la santé animale et humaine. Avec l’augmentation de la résistance aux antimicrobiens (RAM), les phages et leurs dérivés conduisent à des antimicrobiens alternatifs pour contrôler les maladies infectieuses bactériennes, y compris les infections bactériennes À RAM chez les humains et les animaux1,2. Les phages ont confirmé leur potentiel thérapeutique contre les agents pathogènes bactériens >20 qui causent des infections superficielles et des infections du système respiratoire supérieur et du tractus gastro-intestinal de l’homme3.
Dans les milieux agricoles, une stratégie de biocontrôle à base de phages est l’utilisation thérapeutique des phages pour contrôler les agents pathogènes bactériens. La biocontrôle des phages est bien acceptée en tant que technologie verte, efficace pour décontaminer les agents pathogènes d’origine alimentaire (p. ex., Escherichia coli productrice de shigatoxine (STEC), Salmonella et Listeria) dans divers aliments4,5. De plus, les phages peuvent être utilisés comme désinfectants pour désinfecter les surfaces de transformation des aliments et les peaux d’animaux, qui peuvent être intégrés dans les systèmes antimicrobiens conventionnels (p. ex. produits chimiques, pasteurisation de la vapeur et de l’eau chaude) afin d’améliorer les résultats souhaités et de réduire les impacts environnementaux. L’utilisation de phages pour réduire les bactéries zoonotiques chez les animaux est également prometteuse1. Cependant, il est nécessaire de relever les défis techniques pour améliorer les résultats de l’approche de biocontrôle des phages qui sera couramment appliquée dans divers systèmes de production alimentaire. Le principal défi est l’altération de l’efficacité des phages en raison du développement de mutants résistants aux bactéries5 et des changements dans la physiologie bactérienne dus à l’exposition à des facteurs de stress environnementaux6.
Pour minimiser le risque de résistance aux phages, des cocktails de phages (c.-à-d. une combinaison de plusieurs phages) sont proposés et ont amélioré la puissance de biocontrôle dans les milieux agricoles et aquacoles7. Cependant, à partir de plusieurs études, il a été prouvé que les cocktails de phages n’offraient pas toujours une meilleure efficacité que l’administration d’un seul phage. Par exemple, un cocktail de 3 phages de type T4 avait une gamme d’hôtes plus étroite par rapport aux souches d’E. coli8. De plus, l’AKFV33, un membre du Tequintavirus, avait une plus grande efficacité qu’un cocktail de quatre phages pour éliminer E. coli O157 du bœuf, malgré les températures d’incubation appliquées4. Récemment, il a été rapporté que l’efficacité des phages individuels ne prédit pas l’efficacité des cocktails de phages pour le contrôle de l’O1579, car les interactions entre plusieurs phages peuvent altérer l’efficacité. Plus important encore, de nombreux facteurs, tels que les genres et les combinaisons de phages, les souches et les MEI ciblés, ainsi que les températures et les temps d’incubation, peuvent avoir un impact sur les interactions entre les phages. Par conséquent, il est d’une importance vitale pour évaluer la synergie ou la facilitation des phages, ou du moins pour assurer un antagonisme minimal des phages dans des conditions environnementales spécifiques, il est d’une importance vitale pour des résultats optimaux. Ici, une méthode est décrite pour évaluer systématiquement l’efficacité de diverses combinaisons de phages contre les agents pathogènes d’origine alimentaire dans diverses conditions environnementales. L’avantage de cette approche est de permettre le dépistage de tous les facteurs biotiques et abiotiques possibles qui devraient affecter l’efficacité antibactérienne des phages dans des milieux naturels. Dans le protocole, STEC O157 et leurs phages infectieux sont utilisés à titre d’exemple.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essential supplies, reagents, and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374361</td>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Diameter: 100 mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17013808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips RT LTS 1000&#181;L FL 768A/8-low retention</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 20&#181;L F 960A/5</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 300&#181;L 768A/4</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005867</td>
			<td>no filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>168055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar (TSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105458-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105459-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Shaped Cell Spreaders</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76299-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Microbiological Incubators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50125590H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer Hotplates</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-889-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon Stir Bars</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>14-512-125</td>
			<td>length: 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BTNEO2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>9.4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings

Les agents pathogènes bactériens remettent continuellement en question les systèmes de sécurité alimentaire dans le monde entier. Avec les préoccupations croissantes concernant l’émergence de bactéries résistantes à la chaleur et aux désinfectants, de nouveaux agents antibactériens sont nécessaires de toute urgence. Une stratégie de biocontrôle basée sur les bactériophages est l’utilisation thérapeutique des phages pour contrôler les agents pathogènes bactériens dans les milieux agricoles. La biocontrôle des phages est de plus en plus acceptée comme une technologie durable, efficace pour décontaminer les agents pathogènes d’origine alimentaire. Pour garantir des résultats efficaces en matière de biocontrôle, il est crucial de procéder à un dépistage systématique des combinaisons de phages contre les bactéries ciblées dans les conditions environnementales requises. L’efficacité antibactérienne des cocktails de phages peut être affectée par les genres et la combinaison de phages, les souches bactériennes ciblées, la multiplicité de l’infection, la température et le temps. Pour formuler un cocktail de phages d’une efficacité supérieure, la méthode proposée consistait à évaluer systématiquement l’efficacité des phages individuels et des cocktails de phages à tuer les pathogènes bactériens d’origine alimentaire dans des conditions ciblées. L’efficacité de la destruction bactérienne a été surveillée en mesurant la densité optique aux températures et aux durées souhaitées. L’efficacité supérieure des phages a été déterminée par l’inhibition complète de la croissance bactérienne. La méthode proposée est une approche robuste et fondée sur des données probantes pour faciliter la formulation de cocktails de phages avec une efficacité antibactérienne supérieure.

À la suite du protocole, une comparaison de l’efficacité des phages anti-O157 avec diverses combinaisons de phages, températures, temps et ME a été effectuée. Les impacts de la température et des temps d’incubation, des MEO, des phages et des souches bactériennes utilisés pour améliorer l’efficacité de l’anti-E. coli O157 sont présentés dans le tableau 1 (tableau des rapports de cotes)9. Le pourcentage (%) de mesure de turbidité optique ≤ 0,01 donné a été analysé par chaque préparation de phage dans chaque condition expérimentale. Sur la base de cette analyse, l’efficacité des phages anti-O157 a été maximisée après 14, 16 ou 18 h d’incubation à 22 °C (P < 0,001) et MOI = 1000 (P < 0,001), 75 % et 89 % de la croissance de la culture traitée par phages étant complètement inhibée, respectivement. En général, parmi 11 préparations de phages, un cocktail de T1, T4 et rV5 était le plus efficace (P < 0,05) contre O157. En outre, à travers les températures d’incubation, les temps, les MOÏ et les phages testés, la sensibilité aux phages variait, les souches O157 testées avec la souche CO281-31N étant les plus sensibles (P < 0,001) et 3081 (P < 0,001) étant les moins sensibles aux phages.
Pour comprendre la cinétique de destruction des phages de chaque souche bactérienne testée, la valeur OD600 a été tracée par rapport à chaque temps d’échantillonnage, À chaque millioni et traitement des phages à chaque température d’incubation. Les résultats représentatifs de l’efficacité des phages contre E. coli O157 3081 à 37 °C sont présentés à la figure 2. On s’assure que la courbe de croissance de la culture témoin sans phage est normale avant d’évaluer l’inhibition de la courbe de croissance de la culture traitée par phage. Selon la figure 2, l’inclusion de T4 a complètement inhibé la croissance bactérienne à 37 °C, à chaque moment d’échantillonnage à un MOI aussi bas que 1. Pour avoir une vue d’ensemble de la façon dont les phages ont inhibé la croissance bactérienne au fil du temps à différentes températures, indépendamment des ME, la valeur moyenne de l’OD600 nm calculée en moyenne à partir de tous les AMI (MOI > 0) a été tracée par rapport à chaque temps d’échantillonnage et traitement des phages (Figure 3). Par rapport à 37 °C, l’efficacité particulière de la destruction des phages, par exemple les phages T4 et T1 + T4, a été améliorée sur 22 °C. Une autre approche pour résumer et comparer l’efficacité globale de l’anti-O157 chez les phages est présentée dans les tableaux 2 et 39. La valeur de l’OD600 a été calculée en moyenne à partir de chaque temps d’échantillonnage et DE chaque MOI et a classé l’efficacité des phages de la plus élevée (A) à la plus faible (F: 37 °C et D: 22 °C). Ce tableau facilite l’identification du meilleur traitement des phages. Par exemple, pour la souche 3081, les phages T4 et T5 + T4 (panel A) ont été le traitement le plus efficace à 37 °C, tandis qu’en plus du phage T4, les phages T1 + T4, T1 + T4 + rV5 et 4 cocktails de phages (panel A) ont été le traitement le plus efficace à 22 °C.
Ce protocole nous a également permis de comparer l’efficacité des phages à diverses souches bactériennes ciblées et de personnaliser la préparation des phages. Par exemple, lors de la sélection de phages, à 37 °C, à l’exclusion de la souche 3081, le phage T1 + T4 + rV5 avait l’efficacité la plus significative contre toutes les autres souches, quel que soit leur type de phage. À 22 °C, le cocktail à 4 phages était le plus efficace contre toutes les souches testées. Les meilleurs DIO ont abouti à une lyse complète (OD600 ≤ 0,01), ce qui a justifié une efficacité potentielle supérieure dans des conditions expérimentales (tableau 2 et tableau 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg"> Figure 1 : Disposition suggérée du test de microplaques à 96 puits. Les dilutions en série 10 fois de chaque phage sont préparées dans les colonnes 1 à 8 de microplaques stériles de 96 puits. Quatre phages contre une souche bactérienne peuvent être testés en double, dans des colonnes adjacentes, sur chaque plaque. Les colonnes restantes sont destinées aux contrôles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg"> Figure 2 : Courbes de croissance de la souche 3081 d’E. coli O157 à 37 °C traitée et non traitée avec des phages à chaque DIO. Les données ont été compilées à partir de deux essais indépendants. Les barres présentent un écart-type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg"> Figure 3: Courbes de croissance des souches E. coli O157 de la souche 3081. (A) Courbes de croissance à 37 °C. (B) Courbes de croissance à 22 °C. Chaque courbe représente des cultures individuelles et mixtes, traitées et non traitées avec des phages dans les MEI. Les données ont été compilées à partir de deux essais indépendants. Les barres présentent l’erreur-type de la moyenne (adaptée de la référence 9 avec permission). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Rapports de cotes comparant la probabilité d’une efficacité supérieure des phages à celle d’E. coli O157 aux températures d’incubation, aux temps d’incubation, aux MIO, aux phages et aux souches d’E. coli O157 (adapté de la référence 9 avec permission). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2: Efficacité globale des phages contre E. coli O157 à 37 °C (adapté de la référence 9 avec permission). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 3: Efficacité globale des phages contre E. coli O157 à 22 °C (adapté de la référence 9 avec permission). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Figures supplémentaires 1 à 11: Instantanés du fonctionnement et des procédures du lecteur de microplaques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

Ce protocole décrit une méthode robuste d’utilisation de paramètres à haut débit pour dépister l’efficacité antibactérienne des cocktails de bactériophages.

Efficacité des bactériophages pour le biocontrôle des agents pathogènes d’origine alimentaire évaluée à l’aide de paramètres à haut débit

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

Ce protocole facile à réaliser évalue l’efficacité antibactérienne de diverses combinaisons de bactériophages, également connues sous le nom de cocktails de phages, dans des conditions variables dans un environnement à haut débit. Les principaux avantages de la technique sont la capacité de diffuser différents facteurs biotiques et abiotiques, tels que la température, qui peuvent affecter l’efficacité des phages dans diverses conditions environnementales. Cette méthode peut faciliter la conception de cocktails de phages appropriés pour améliorer le biocontrôle et les résultats thérapeutiques et déterminer l’interaction entre les hôtes bactériens et les bactériophages.Pour commencer, configurez le test sur microplaque à l’aide d’embouts filtrés pour éviter la contamination croisée. Tout d’abord, ajoutez 180 microlitres de mTSB dans les puits des colonnes un à 12 de la microplaque de 96 puits, puis préparez des dilutions décuplées en série de chaque phage dans les colonnes un à huit des microplaques stériles de 96 puits pour mettre en place le test. Ajouter 20 microlitres de phages individuels ou de cocktails de phages aux puits un à huit de la rangée supérieure A de la microplaque.Pour un contrôle sans phages et à blanc, ajoutez 20 microlitres de mTSB au puits supérieur des colonnes neuf à 12. Pendant le pipetage, mélanger le contenu du puits avec une aspiration douce et répétée au moins cinq fois et en changeant les extrémités entre les dilutions. Retirez 20 microlitres de la dernière rangée H, puis installez un réservoir pour la souche bactérienne testée en transférant deux à trois millilitres de la culture diluée dans le réservoir à l’aide d’une pipette d’un millilitre.À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 20 microlitres de la culture bactérienne diluée à chaque puits dans les colonnes un à 10 tout en changeant les embouts entre chaque ajout. Couvrir et incuber la microplaque à 37 degrés Celsius. À deux heures d’intervalle, retirez la microplaque de l’incubateur et lisez la plaque à l’aide d’un lecteur de microplaques.Alternativement, incubez la plaque dans un lecteur de microplaques et lisez-la au fil du temps. Pour examiner la densité optique à 600 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques, ouvrez le programme sur un lecteur de microplaques. Sélectionnez le mode simple dans la fenêtre des options de démarrage, puis sélectionnez Créer un nouveau protocole dans le Gestionnaire des tâches.Dans la fenêtre Sélectionner le type de plaque, choisissez plaque à 96 puits dans la liste déroulante. Comme méthode de détection, sélectionnez Absorbance pour le type de lecture, sélectionnez l’option Point de terminaison/Cinétique pour le type optique, sélectionnez Monochromateurs, puis cliquez sur OK. Pour l’étape de lecture, entrez 600 nanomètres pour les longueurs d’onde, sélectionnez Normal pour la vitesse de lecture et cliquez sur OK.To réglez la température pour le test, cliquez sur la case à cocher Incuber et sélectionnez Incubateur activé.Entrez la température souhaitée dans la zone température, puis cliquez sur OK. Cliquez sur la case à cocher Préchauffer avant de passer à l’étape suivante pour la température d’incubation de 37 degrés Celsius, bien que l’option ne soit pas requise pour les conditions de test à 22 degrés Celsius. Pour éviter la condensation sur le couvercle de la plaque pendant l’incubation, définissez le gradient de température en entrant une valeur dans la zone de dégradé, puis cliquez sur OK. Ensuite, cliquez sur la case à cocher Cinétique pour ouvrir la configuration cinétique.Réglez la durée d’exécution pendant 10 heures pour une incubation de 37 degrés Celsius ou 22 heures pour la température ambiante et entrez deux heures comme intervalle de lecture, puis cliquez sur OK. Cliquez sur la case à cocher Secouer dans la fenêtre de procédure pour configurer la condition de secousse, si nécessaire pour chaque lecture cinétique. Sélectionnez Linéaire comme mode de secousse et modifiez la durée à 30 secondes. Définissez la valeur fréquence linéaire sur 731 cycles par minute, puis cliquez sur OK.In la fenêtre Dialogue de résumé du protocole, cliquez sur Disposition de la plaque, sélectionnez Blancs, Contrôles de test et Échantillons, puis cliquez sur Suivant.Après avoir défini les paramètres pour chaque type de puits, cliquez sur Terminer. Sélectionnez un ID de puits dans l’interface de gauche, affectez-le à la matrice affichée dans la fenêtre Disposition des plaques, puis cliquez sur OK. Cliquez sur le bouton Lire la plaque, enregistrez le protocole en tant que fichier prt et cliquez sur Enregistrer. Insérez la plaque et cliquez sur OK. Une fois l’expérience terminée, enregistrez l’expérience en tant que fichier xpt et cliquez sur Enregistrer.Exportez les données vers Excel en cliquant sur le bouton Oui dans la fenêtre de message pour une analyse plus approfondie. Cliquez sur la sélection Enregistrer Oui/Non et cochez la case Ne plus demander pour enregistrer la préférence. À la suite du protocole, une comparaison de l’efficacité des phages avec diverses combinaisons de phages, températures, temps et multiplicité d’infections, ou ME, a été effectuée.Sur la base de cette analyse, l’efficacité des phages anti-O157 a été maximisée après 14, 16 ou 18 heures d’incubation à 22 degrés Celsius. Pour comprendre la cinétique de destruction des phages des bactéries, les valeurs de DO à 600 nanomètres ont été tracées en fonction du temps d’échantillonnage, des MEI et du traitement des phages. Les courbes de croissance bactérienne représentatives à 37 degrés Celsius traitées sont montrées.T4 a complètement inhibé la croissance bactérienne à chaque moment d’échantillonnage, même à faible MOI. Pour analyser la croissance bactérienne inhibée par les phages, les valeurs moyennes de DO de tous les MOO ont été tracées par rapport à chaque temps d’échantillonnage et à chaque traitement des phages. Les graphiques représentatifs à deux températures ont révélé que l’efficacité de la destruction des phages, par exemple, pour T1 plus T4 était améliorée à 22 degrés Celsius contre 37 degrés Celsius.La comparaison de l’efficacité globale des phages est montrée, ce qui facilite l’identification du meilleur traitement de phase. Par exemple, pour la souche 3081 d’Escherichia coli, le traitement par phages T4 et T5 plus T4 a été le traitement le plus efficace à 37 degrés Celsius. Cependant, à 22 degrés Celsius, en plus de T4, les phages T1 plus T4, T1 plus T4 plus rV5 et quatre cocktails de phages ont été efficaces.Lors de l’exécution de cette procédure, un pipetage extrêmement précis, en particulier lors de l’utilisation d’une pipette multicanal et l’uniformité de l’approche sont essentiels pour obtenir des résultats comparables et interprétables. Des expériences de suivi sont nécessaires pour évaluer les performances ultérieures du cocktail le plus influent dans le dépistage, empêchant l’émergence de mutants antiphages dans un vaste système de culture de bouillon et d’autres matrices biologiques.

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