Name: bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00
Duration: 7 min 22 s
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इस शोध को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC डिस्कवरी ग्रांट, RGPIN-2019-04384), नवाचार के लिए कनाडा फाउंडेशन (प्रोजेक्ट # 38710), और मेजर इनोवेशन फंड, अल्बर्टा द्वारा समर्थित किया गया था। हम पांडुलिपि के संपादन के लिए डॉ जॉन कास्टेलिक को धन्यवाद देते हैं।

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लेखकों ने घोषणा की है कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे हितों के संभावित संघर्ष के रूप में माना जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल ने एसटीईसी 9 और साल्मोनेला 10 सहित खाद्यजनित रोगजनकों के खिलाफ फेज प्रभावकारिता का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण का वर्णन किया। एक महत्वपूर्ण कदम यह है कि बैक्टीरिया की रातोंरात संस्कृति को पतला करना, पूर्व-ठंडा माध्यम का उपयोग करना और संभावित जीवाणु विकास को कम करने के लिए बर्फ की बाल्टी के साथ कमजोर पड़ने में हेरफेर करना। इसके अलावा, बैक्टीरिया की संस्कृति को पतला करने से पहले फेज कमजोर पड़ने को तैयार किया गया था। गणना चरण 2.8 ने लागू अंतिम MOI की गणना के लिए बैक्टीरियल इनोकुलम की वास्तविक संख्या प्रदान की। फेज की तैयारी के लिए, बैक्टीरियल संस्कृति के 4-6 ज में संक्रमित फिल्टर फेज द्वारा तैयार क्रूड फेज लिसेट का उपयोग आमतौर पर किया जाता है। फेज infectivity के साथ जुड़े महत्वपूर्ण कदम हमेशा 3 महीने के भीतर तैयार फेज काम स्टॉक का उपयोग करने के लिए है। अत्यंत सटीक पिपेटिंग (विशेष रूप से जब एक multichannel पिपेट का उपयोग कर) और दृष्टिकोण की एकरूपता भी तुलनीय और व्याख्या योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। संशोधित टीएसबी Mg2 + के 10 mM के साथ पूरक phages, जीवाणु संस्कृति, और आधार माध्यम पतला करने के लिए सोखना और फेज के संक्रमण का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
जैसा कि बैक्टीरिया लॉग चरण के दौरान फैलते हैं, यहां तक कि इनक्यूबेटर तापमान से नीचे भी, संभावित जीवाणु विकास को कम करने के लिए लॉग-फेज संस्कृति के बजाय पतला रातोंरात संस्कृति का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
प्रस्तावित प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं। सबसे पहले, क्योंकि माइक्रोप्लेट केवल 200 μL रख सकता है, लंबे समय तक इनक्यूबेशन पर्याप्त वाष्पीकरण का कारण बन सकता है और अनुशंसित नहीं है। इस मामले में, परख धीमी गति से बढ़ते बैक्टीरिया के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। दूसरा, प्रस्तावित प्रोटोकॉल फेज के प्रवर्धन की निगरानी करने में सक्षम नहीं था। तीसरा, यह प्रोटोकॉल समय के साथ फेज प्रतिरोध के विकास की निगरानी नहीं कर सका, एक महत्वपूर्ण कारक जो फेज उपचार 11,12 के परिणाम को निर्धारित करता है। अनुवर्ती प्रयोगों को एक व्यापक शोरबा संस्कृति प्रणाली और अन्य जैविक आव्यूहों में एंटी-फेज म्यूटेंट के उद्भव को रोकने में स्क्रीनिंग में सबसे प्रभावशाली कॉकटेल के आगे के प्रदर्शन का आकलन करने की आवश्यकता होती है।
पारंपरिक रोगाणुरोधी के विपरीत, फेज की जैविक प्रकृति व्यावहारिक सेटिंग्स में बायोकंट्रोल और चिकित्सीय उपयोग की जटिलता को प्रभावित करती है। परंपरागत रूप से, फेज कॉकटेल का तर्कसंगत चयन मुख्य रूप से लाइटिक गतिविधि और फेज की मेजबान सीमा पर आधारित है। सबसे मजबूत लिटिक गतिविधि और व्यापक मेजबान रेंज वाले फेज उम्मीदवारों को अक्सर 13,14 की सिफारिश की जाती है। हालांकि, वर्तमान अध्ययन के आधार पर, rV5 और T1 जैसे फेज, हालांकि अकेले T4 और T5 के रूप में विषैले नहीं हैं, T4 और / या T5 के साथ संयुक्त होने पर समग्र जैव नियंत्रण परिणाम की बहुत सुविधा प्रदान करते हैं। नतीजतन, फेज कॉकटेल की बेहतर प्रभावकारिता प्राप्त करने के लिए, वांछित पर्यावरणीय परिस्थितियों में लक्षित मेजबान उपभेदों के खिलाफ संभावित फेज संयोजनों की जीवाणुरोधी गतिविधि की प्रणालीगत स्क्रीनिंग की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, फेज उम्मीदवारों के लिए रिसेप्टर्स का निर्धारण और विभिन्न रिसेप्टर्स के साथ फेज को शामिल करने से मेजबान लगाव के लिए प्रतिस्पर्धा को रोका जा सकता है, एंटी-फेज म्यूटेंट के तेजी से विकास को विफल किया जा सकता है, और बायोकंट्रोल परिणामों में सुधार हो सकता है।
इस विधि ने एक उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में फेज लाइसिस कैनेटीक्स के सटीक परिमाणीकरण को सक्षम किया। इसके अलावा, इसने फेज के वर्गीकरण की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता पर विभिन्न जैविक और पर्यावरणीय कारकों के व्यवस्थित मूल्यांकन की अनुमति दी, जिससे अनुकूलित परिणामों के साथ फेज कॉकटेल के निर्माण की सुविधा मिलती है। विधि के भविष्य के अनुप्रयोगों और विकास को फेज के प्रतिदीप्ति लेबलिंग द्वारा फेज कॉकटेल के भीतर प्रत्येक फेज की प्रभावकारिता की निगरानी करने के लिए सीटू में शामिल माना जाता है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल के अलावा, आनुवांशिक निर्धारकों को समझना जो फेज के बीच सहक्रियात्मक और सुविधाजनक प्रभावों को बढ़ावा देते हैं जब एक मेजबान को सह-संक्रमित करते हैं, तो बेहतर प्रभावकारिता के साथ उपयुक्त फेज कॉकटेल के निर्माण की सुविधा होगी।

बैक्टीरियोफेज (फेज) वायरस हैं जो स्वाभाविक रूप से बैक्टीरिया कोशिकाओं पर आक्रमण करते हैं, बैक्टीरिया चयापचय को बाधित करते हैं और बैक्टीरिया के लाइसिस का कारण बनते हैं। पारंपरिक रोगाणुरोधी (जैसे, एंटीबायोटिक्स) के विपरीत, फेज होस्ट स्पेक्ट्रम अपेक्षाकृत संकीर्ण होते हैं, केवल बैक्टीरिया प्रजातियों या उपभेदों के लक्षित सेट को संक्रमित करने में सक्षम होते हैं और इस प्रकार माइक्रोबायोटा पर संपार्श्विक प्रभाव को कम करना चाहिए जो पशु और मानव स्वास्थ्य को लाभान्वित करते हैं। रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) के उदय के साथ, फेज और उनके डेरिवेटिव बैक्टीरिया के संक्रामक रोगों को नियंत्रित करने के लिए वैकल्पिक रोगाणुरोधी का कारण बनते हैं, जिसमें मनुष्यों और जानवरों में एएमआर जीवाणु संक्रमण शामिल हैं1,2। फेज ने >20 जीवाणु रोगजनकों के खिलाफ चिकित्सीय क्षमता की पुष्टि की है जो सतही संक्रमण और ऊपरी श्वसन प्रणाली और मनुष्यों के जठरांत्र संबंधी मार्ग के संक्रमण का कारण बनते हैं3।
कृषि सेटिंग्स में, एक फेज-आधारित बायोकंट्रोल रणनीति जीवाणु रोगजनकों को नियंत्रित करने के लिए फेज का चिकित्सीय उपयोग है। फेज बायोकंट्रोल को एक हरी तकनीक के रूप में अच्छी तरह से स्वीकार किया जाता है, जो खाद्य जनित रोगजनकों (उदाहरण के लिए, शिगा-विष उत्पादन एस्चेरिचिया कोलाई (एसटीईसी), साल्मोनेला और लिस्टेरिया) को विभिन्न खाद्य पदार्थों में विघटित करने में प्रभावी है4,5। इसके अलावा, खाद्य प्रसंस्करण सतहों और जानवरों की खाल को कीटाणुरहित करने के लिए फेज का उपयोग सैनिटाइजर के रूप में किया जा सकता है, जिसे वांछित परिणामों को बढ़ाने और पर्यावरणीय प्रभावों को कम करने के लिए पारंपरिक रोगाणुरोधी प्रणालियों (जैसे, रसायनों, भाप और गर्म पानी के पास्चुरीकरण) में एकीकृत किया जा सकता है। जानवरों में जूनोटिक बैक्टीरिया को कम करने के लिए फेज का उपयोग भी आशाजनक है। हालांकि, विभिन्न खाद्य उत्पादन प्रणालियों में लोकप्रिय रूप से लागू किए जाने वाले फेज बायोकंट्रोल दृष्टिकोण से परिणामों में सुधार करने के लिए तकनीकी चुनौतियों को संबोधित करने की आवश्यकता है। मुख्य चुनौती बैक्टीरिया-प्रतिरोधी म्यूटेंट 5 के विकास के कारण फेज की बिगड़ा प्रभावशीलता और पर्यावरणीय तनावों के संपर्क में आने के कारण जीवाणु शरीर विज्ञान में परिवर्तन है6।
फेज प्रतिरोध के जोखिम को कम करने के लिए, फेज कॉकटेल (यानी, कई फेज का संयोजन) प्रस्तावित हैं और कृषि और एक्वाकल्चर सेटिंग्स में बायोकंट्रोल शक्ति में सुधार हुआ है। हालांकि, कई अध्ययनों से, यह साबित हो गया है कि फेज कॉकटेल हमेशा एक ही फेज के प्रशासन की तुलना में बेहतर प्रभावशीलता प्रदान नहीं करता था। उदाहरण के लिए, 3 टी 4-जैसे फेज के कॉकटेल में ई कोलाई उपभेदों 8 के खिलाफ एक संकीर्ण मेजबान सीमा थी। इसके अलावा, AkFV33, Tequintavirus के एक सदस्य, गोमांस से ई कोलाई O157 को हटाने में चार फेज के कॉकटेल की तुलना में अधिक प्रभावकारिता थी, इनक्यूबेशन तापमान लागू होने के बावजूद। हाल ही में, यह बताया गया है कि व्यक्तिगत फेज की प्रभावशीलता O1579 के नियंत्रण के लिए फेज कॉकटेल की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी नहीं करती है, क्योंकि कई फेज के बीच बातचीत प्रभावकारिता को बदल सकती है। सबसे महत्वपूर्ण बात, कई कारक, जैसे फेज जेनेरा और संयोजन, लक्षित उपभेदों और एमओआई, और इनक्यूबेशन तापमान और समय, फेज के बीच बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, फेज तालमेल या सुविधा का आकलन करने के लिए विशिष्ट बैक्टीरिया के खिलाफ फेज के संयोजनों की सावधानीपूर्वक स्क्रीनिंग, या कम से कम विशिष्ट पर्यावरणीय परिस्थितियों में न्यूनतम फेज विरोध सुनिश्चित करने के लिए, इष्टतम परिणामों के लिए महत्वपूर्ण रूप से महत्वपूर्ण है। यहां, पर्यावरणीय परिस्थितियों की एक श्रृंखला के तहत खाद्यजनित रोगजनकों के खिलाफ विभिन्न फेज संयोजनों की प्रभावकारिता का व्यवस्थित रूप से आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। इस दृष्टिकोण का लाभ प्राकृतिक सेटिंग्स में फेज की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता को प्रभावित करने के लिए भविष्यवाणी किए गए सभी संभावित जैविक और अजैविक कारकों की स्क्रीनिंग को सक्षम करना है। प्रोटोकॉल में, एसटीईसी O157 और उनके संक्रमित फेज को एक उदाहरण के रूप में नियोजित किया जाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essential supplies, reagents, and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374361</td>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Diameter: 100 mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17013808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips RT LTS 1000&#181;L FL 768A/8-low retention</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 20&#181;L F 960A/5</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 300&#181;L 768A/4</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005867</td>
			<td>no filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>168055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar (TSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105458-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105459-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Shaped Cell Spreaders</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76299-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Microbiological Incubators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50125590H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer Hotplates</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-889-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon Stir Bars</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>14-512-125</td>
			<td>length: 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BTNEO2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>9.4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings

बैक्टीरियल रोगजनकों लगातार दुनिया भर में खाद्य सुरक्षा प्रणालियों को चुनौती देते हैं। गर्मी और सैनिटाइजर-प्रतिरोधी बैक्टीरिया के उद्भव के बारे में बढ़ती चिंताओं के साथ, उपन्यास जीवाणुरोधी एजेंटों की तत्काल आवश्यकता है। एक बैक्टीरियोफेज-आधारित बायोकंट्रोल रणनीति कृषि सेटिंग्स में जीवाणु रोगजनकों को नियंत्रित करने के लिए फेज का चिकित्सीय उपयोग है। फेज बायोकंट्रोल को तेजी से एक स्थायी तकनीक के रूप में स्वीकार किया जाता है, जो खाद्य जनित रोगजनकों को दूषित करने में प्रभावी है। प्रभावी जैव नियंत्रण परिणामों को सुनिश्चित करने के लिए, आवश्यक पर्यावरणीय परिस्थितियों में लक्षित बैक्टीरिया के खिलाफ फेज संयोजनों की व्यवस्थित स्क्रीनिंग महत्वपूर्ण है। फेज कॉकटेल की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता फेज जेनेरा और संयोजन, लक्षित जीवाणु उपभेदों, संक्रमण की बहुलता, तापमान और समय से प्रभावित हो सकती है। बेहतर प्रभावकारिता के साथ एक फेज कॉकटेल तैयार करने के लिए, प्रस्तावित विधि लक्षित परिस्थितियों में खाद्यजनित जीवाणु रोगजनकों को मारने में व्यक्तिगत फेज और फेज कॉकटेल की प्रभावशीलता का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करना था। वांछित तापमान और अवधि पर ऑप्टिकल घनत्व को मापकर बैक्टीरियल हत्या प्रभावकारिता की निगरानी की गई थी। सुपीरियर फेज प्रभावकारिता को जीवाणु विकास के पूर्ण निषेध द्वारा निर्धारित किया गया था। प्रस्तावित विधि बेहतर जीवाणुरोधी प्रभावकारिता के साथ फेज कॉकटेल तैयार करने की सुविधा के लिए एक मजबूत, साक्ष्य-आधारित दृष्टिकोण है।

प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, विभिन्न फेज संयोजनों, तापमान, समय और एमओआई के साथ एंटी-ओ 157 फेज प्रभावकारिता की तुलना की गई थी। इनक्यूबेशन तापमान और समय के प्रभाव, MOIs, फेज, और जीवाणु उपभेदों विरोधी ई कोलाई O157 प्रभावकारिता को बढ़ाने पर इस्तेमाल किया तालिका 1 (बाधाओं अनुपात तालिका) 9 में प्रस्तुत किया गया है। ऑप्टिकल टर्बिडिटी माप के प्रतिशत (%) ≤ 0.01 उपज का विश्लेषण प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के तहत प्रत्येक फेज तैयारी द्वारा किया गया था। इस विश्लेषण के आधार पर, एंटी-O157 फेज प्रभावकारिता को 22 डिग्री सेल्सियस (पी < 0.001) और एमओआई = 1000 (पी < 0.001) पर इनक्यूबेशन के 14, 16, या 18 घंटे के बाद अधिकतम किया गया था, जिसमें क्रमशः फेज-उपचारित संस्कृति के विकास का 75% और 89% पूरी तरह से बाधित किया गया था। सामान्य तौर पर, 11 फेज की तैयारियों के बीच, T1, T4 और rV5 का कॉकटेल O157 के खिलाफ सबसे प्रभावी (पी < 0.05) था। इसके अलावा, इनक्यूबेशन तापमान, समय, एमओआई और फेज का परीक्षण किया गया, फेज के प्रति संवेदनशीलता अलग-अलग थी, जिसमें O157 उपभेदों ने तनाव CO281-31N के साथ परीक्षण किया था, जो सबसे अधिक संवेदनशील (पी < 0.001) और 3081 (पी < 0.001) फेज के प्रति कम से कम संवेदनशील था।
परीक्षण किए गए प्रत्येक जीवाणु तनाव के फेज-हत्या कैनेटीक्स को समझने के लिए, OD600 मूल्य को प्रत्येक इनक्यूबेशन तापमान पर प्रत्येक नमूना समय, MOIs और फेज उपचार के खिलाफ प्लॉट किया गया था। 37 डिग्री सेल्सियस पर ई कोलाई O157 3081 के खिलाफ फेज की प्रभावकारिता से प्रतिनिधि परिणाम चित्र 2 में दिखाए गए हैं। यह सुनिश्चित किया जाता है कि फेज-मुक्त नियंत्रण संस्कृति का विकास वक्र फेज-उपचारित संस्कृति के विकास वक्र के निषेध का आकलन करने से पहले सामान्य है। चित्रा 2 के अनुसार, टी 4 के समावेश ने 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया के विकास को पूरी तरह से रोक दिया, प्रत्येक नमूना समय में एक एमओआई में 1 के रूप में कम। यह देखने के लिए कि कैसे फेज ने एमओआई के बावजूद विभिन्न तापमानों पर समय के साथ जीवाणु विकास को कैसे बाधित किया, सभी एमओआई (एमओआई > 0) से औसत औसत औसत OD600nm मूल्य को प्रत्येक नमूना समय और फेज उपचार (चित्रा 3) के खिलाफ प्लॉट किया गया था। 37 डिग्री सेल्सियस की तुलना में, विशेष फेज हत्या प्रभावकारिता, उदाहरण के लिए, फेज टी 4 और टी 1 + टी 4, को 22 डिग्री सेल्सियस से अधिक बढ़ाया गया था। फेज के बीच समग्र विरोधी O157 प्रभावशीलता को संक्षेप में प्रस्तुत करने और तुलना करने के लिए एक और दृष्टिकोण तालिका 2 और तालिका 39 में दिखाया गया है। OD600 मान प्रत्येक नमूना समय और MOI से औसत किया गया था और उच्चतम (ए) से सबसे कम (एफ: 37 डिग्री सेल्सियस और डी: 22 डिग्री सेल्सियस) तक फेज प्रभावकारिता को रैंक किया गया था। यह तालिका सबसे अच्छा फेज उपचार की पहचान की सुविधा प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, तनाव 3081 के लिए, फेज T4 और T5 + T4 (पैनल ए) 37 डिग्री सेल्सियस पर सबसे प्रभावी उपचार थे, जबकि फेज टी 4 के अलावा, फेज टी 1 + टी 4, टी 1 + टी 4 + आरवी 5, और 4 फेज कॉकटेल (पैनल ए) 22 डिग्री सेल्सियस पर सबसे प्रभावी उपचार थे।
इस प्रोटोकॉल ने हमें लक्षित विभिन्न जीवाणु उपभेदों के खिलाफ फेज प्रभावकारिता की तुलना करने और फेज तैयारी को अनुकूलित करने में भी सक्षम बनाया। उदाहरण के लिए, फेज का चयन करते समय, 37 डिग्री सेल्सियस पर, तनाव 3081 को छोड़कर, फेज टी 1 + टी 4 + आरवी 5 में उनके फेज प्रकारों की परवाह किए बिना, अन्य सभी उपभेदों के खिलाफ सबसे महत्वपूर्ण प्रभावशीलता थी। 22 डिग्री सेल्सियस पर, 4-फेज कॉकटेल परीक्षण किए गए सभी उपभेदों के खिलाफ सबसे प्रभावी था। सर्वश्रेष्ठ MOIs के परिणामस्वरूप पूर्ण lysis (OD600 ≤ 0.01) हुआ, जिसने प्रयोगात्मक परिस्थितियों (तालिका 2 और तालिका 3) के तहत संभावित बेहतर प्रभावकारिता की आवश्यकता थी।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg"> चित्रा 1: 96-अच्छी तरह से microplate परख का सुझाव दिया लेआउट. प्रत्येक फेज के सीरियल 10-गुना dilutions बाँझ 96-अच्छी तरह से microplates के कॉलम 1-8 में तैयार कर रहे हैं। एक जीवाणु तनाव के खिलाफ चार फेज का परीक्षण डुप्लिकेट में, आसन्न स्तंभों में, प्रत्येक प्लेट पर किया जा सकता है। शेष स्तंभ नियंत्रणों के लिए हैं. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg"> चित्रा 2: ई कोलाई O157 तनाव 3081 के विकास घटता 37 डिग्री सेल्सियस पर इलाज किया और प्रत्येक MOIs पर फेज के साथ इलाज नहीं किया। डेटा को दो स्वतंत्र परीक्षणों से संकलित किया गया था। सलाखों मानक विचलन प्रस्तुत करते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg"> चित्र 3: ई कोलाई O157 स्ट्रेन 3081 उपभेदों की वृद्धि वक्र( A) 37 °C पर विकास वक्र (B) 22 °C पर विकास वक्र। प्रत्येक वक्र व्यक्तिगत और मिश्रित संस्कृतियों का प्रतिनिधित्व करता है, जिसका इलाज किया जाता है और एमओआई में फेज के साथ इलाज नहीं किया जाता है। डेटा को दो स्वतंत्र परीक्षणों से संकलित किया गया था। सलाखों माध्य की मानक त्रुटि प्रस्तुत (अनुमति के साथ संदर्भ9 से अनुकूलित). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
तालिका 1: ऑड्स अनुपात ई. कोलाई O157 के खिलाफ बेहतर फेज प्रभावकारिता की संभावना की तुलना इनक्यूबेशन तापमान पर, इनक्यूबेशन बार, MOIs, फेज, और ई. कोलाई O157 के उपभेदों (अनुमति के साथ संदर्भ9 से अनुकूलित) पर। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
तालिका 2: 37 डिग्री सेल्सियस पर ई कोलाई O157 के खिलाफ समग्र फेज प्रभावकारिता (अनुमति के साथ संदर्भ9 से अनुकूलित)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a> 
तालिका 3: 22 डिग्री सेल्सियस पर ई कोलाई O157 के खिलाफ समग्र फेज प्रभावकारिता (अनुमति के साथ संदर्भ 9 से अनुकूलित)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a> 
अनुपूरक आंकड़े 1-11: माइक्रोप्लेट रीडर ऑपरेशन और प्रक्रियाओं के स्नैपशॉट्स। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियोफेज कॉकटेल की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता को स्क्रीन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए एक मजबूत विधि का वर्णन करता है।

खाद्यजनित रोगजनकों के बायोकंट्रोल के लिए बैक्टीरियोफेज प्रभावशीलता उच्च-थ्रूपुट सेटिंग्स के माध्यम से मूल्यांकन किया गया

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

प्रोटोकॉल करने के लिए यह आसान विविध बैक्टीरियोफेज संयोजनों की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता का मूल्यांकन करता है, जिसे फेज कॉकटेल के रूप में भी जाना जाता है, एक उच्च-थ्रूपुट सेटिंग में अलग-अलग परिस्थितियों में। तकनीक के मुख्य लाभ विभिन्न बायोटिक्स और अजैविक कारकों को स्ट्रीम करने की क्षमता है, जैसे कि तापमान, जो पर्यावरणीय स्थितियों की एक श्रृंखला के तहत फेज प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकता है। यह विधि बायोकंट्रोल और चिकित्सीय परिणामों को बढ़ाने और बैक्टीरिया के मेजबानों और बैक्टीरियोफेज के बीच बातचीत को निर्धारित करने के लिए उपयुक्त फेज कॉकटेल के डिजाइन की सुविधा प्रदान कर सकती है।के साथ शुरू करने के लिए, पार संदूषण से बचने के लिए फ़िल्टर किए गए युक्तियों का उपयोग करके माइक्रोप्लेट परख सेट करें। सबसे पहले, कॉलम के कुओं में एमटीएसबी के 180 माइक्रोलीटर जोड़ें 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के एक से 12 तक, फिर कॉलम में प्रत्येक फेज के सीरियल दस गुना कमजोर पड़ने की तैयारी करें एक से आठ बाँझ 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट परख स्थापित करने के लिए। माइक्रोप्लेट की शीर्ष पंक्ति ए के एक से आठ कुओं में व्यक्तिगत फेज या फेज कॉकटेल के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें।फेज-मुक्त और रिक्त नियंत्रण के लिए, नौ से 12 कॉलम के शीर्ष कुएं में एमटीएसबी के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। पिपेटिंग करते समय, कम से कम पांच बार कोमल और दोहराए गए आकांक्षा के साथ अच्छी तरह से सामग्री को मिलाएं और कमजोर पड़ने के बीच युक्तियों को बदलें। अंतिम पंक्ति एच से 20 माइक्रोलीटर को हटा दें, फिर एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके जलाशय में पतला संस्कृति के दो से तीन मिलीलीटर को स्थानांतरित करके परीक्षण किए गए जीवाणु तनाव के लिए एक जलाशय स्थापित करें।एक multichannel पिपेट का उपयोग करते हुए, प्रत्येक जोड़ के बीच युक्तियों को बदलते हुए कॉलम में प्रत्येक अच्छी तरह से पतला जीवाणु संस्कृति के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोप्लेट को कवर और इनक्यूबेट करें। दो घंटे के अंतराल पर, इनक्यूबेटर से माइक्रोप्लेट को हटा दें और माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके प्लेट को पढ़ें।वैकल्पिक रूप से, प्लेट को माइक्रोप्लेट रीडर में इनक्यूबेट करें और समय के साथ इसे पढ़ें। माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व की जांच करने के लिए, एक माइक्रोप्लेट रीडर पर प्रोग्राम खोलें। स्टार्टअप विकल्प विंडो में सरल मोड का चयन करें और उसके बाद कार्य प्रबंधक में एक नया प्रोटोकॉल बनाएँका चयन करें।प्लेट प्रकार का चयन करें विंडो से, ड्रॉपडाउन सूची से 96-वेल प्लेट चुनें. डिटेक्शन विधि के रूप में, पठन प्रकार के लिए Absorbance का चयन करें, प्रकाशिकी प्रकार के लिए समापन बिंदु/काइनेटिक विकल्प का चयन करें, मोनोक्रोमेटर्स का चयन करें, और तब ठीक क्लिक करें. पठन चरण के लिए, तरंग दैर्ध्य के लिए 600 नैनोमीटर दर्ज करें, पढ़ने की गति के लिए सामान्य का चयन करें और परख के लिए तापमान सेट OK.To क्लिक करें, इनक्यूबेट चेक बॉक्स पर क्लिक करें और तापमान बॉक्स में वांछित तापमान दर्ज करें इनक्यूबेटर On.Enter का चयन करें और फिर ठीक क्लिक करें। अगले चरण के साथ जारी रखने से पहले प्रीहीट पर क्लिक करें 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन तापमान के लिए चेक बॉक्स, हालांकि 22 डिग्री सेल्सियस पर परीक्षण की स्थिति के लिए विकल्प की आवश्यकता नहीं है। इनक्यूबेशन दौरान प्लेट ढक्कन पर संघनन को रोकने के लिए, ग्रेडिएंट बॉक्स में कोई मान दर्ज करके तापमान ग्रेडिएंट सेट करें, और तब ठीक क्लिक करें. अगला, काइनेटिक सेटअप खोलने के लिए काइनेटिक चेक बॉक्स पर क्लिक करें।37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन या कमरे के तापमान के लिए 22 घंटे के लिए 10 घंटे के लिए रन टाइम सेट करें और पढ़ने के अंतराल के रूप में दो घंटे दर्ज करें, फिर ठीक पर क्लिक करें। प्रत्येक गतिज पठन के लिए आवश्यक होने पर शेक स्थिति सेट करने के लिए प्रक्रिया विंडो में शेक चेक बॉक्स पर क्लिक करें। शेक मोड के रूप में रैखिक का चयन करें और अवधि को 30 सेकंड में बदलें। रैखिक आवृत्ति मान प्रति मिनट 731 चक्रों पर सेट करें, और उसके बाद प्रोटोकॉल सारांश संवाद विंडो OK.In पर क्लिक करें, प्लेट लेआउट पर क्लिक करें, रिक्त स्थान, परख नियंत्रण, और नमूने का चयन करें, और अगलाक्लिक करें।प्रत्येक अच्छी तरह से प्रकार के लिए सेटिंग्स को परिभाषित करने के बाद, समाप्त पर क्लिक करें। बाएं हाथ की ओर इंटरफ़ेस में एक अच्छी तरह से आईडी का चयन करें, इसे प्लेट लेआउट विंडो में दिखाए गए मैट्रिक्स को असाइन करें, फिर ठीक पर क्लिक करें। रीड प्लेट बटन पर क्लिक करें, प्रोटोकॉल को पीआरटी फ़ाइल के रूप में सहेजें और सहेजें पर क्लिक करें। प्लेट डालें और ठीक पर क्लिक करें। एक बार प्रयोग पूरा हो जाने के बाद, प्रयोग को एक xpt फ़ाइल के रूप में सहेजें और सहेजें पर क्लिक करें।आगे के विश्लेषण के लिए संदेश विंडो बॉक्स में हाँ बटन पर क्लिक करके Excel को डेटा निर्यात करें. पर क्लिक करें हाँ / नहीं चयन सहेजें और वरीयता को बचाने के लिए फिर से मत पूछो चेक बॉक्स। प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, विभिन्न फेज संयोजनों, तापमान, समय और संक्रमण, या एमओआई की बहुलता के साथ फेज प्रभावकारिता की तुलना की गई थी।इस विश्लेषण के आधार पर, एंटी-O157 फेज प्रभावकारिता को 14, 16, या 18 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद 22 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम किया गया था। बैक्टीरिया के फेज मारने कैनेटीक्स को समझने के लिए, 600 नैनोमीटर पर ओडी मूल्यों को नमूना समय, एमओआई और फेज उपचार के खिलाफ प्लॉट किया गया था। 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिनिधि जीवाणु वृद्धि घटता का इलाज दिखाया गया है।T4 पूरी तरह से कम MOI पर भी प्रत्येक नमूना समय पर जीवाणु विकास को रोक दिया. फेज ने बैक्टीरिया के विकास को बाधित करने का विश्लेषण करने के लिए, सभी एमओआई से औसत ओडी मूल्यों को प्रत्येक नमूना समय और फेज उपचार के खिलाफ प्लॉट किया गया था। दो तापमानों पर प्रतिनिधि रेखांकन से पता चला कि फेज हत्या प्रभावकारिता, उदाहरण के लिए, टी 1 प्लस टी 4 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस की तुलना में 22 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाया गया था।समग्र फेज प्रभावशीलता की तुलना दिखाई गई है, जो सर्वोत्तम चरण उपचार की पहचान करने की सुविधा प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, Escherichia coli तनाव 3081 के लिए, फेज T4 और T5 प्लस T4 के साथ उपचार 37 डिग्री सेल्सियस पर सबसे प्रभावी उपचार था। हालांकि, 22 डिग्री सेल्सियस पर, टी 4 के अलावा, फेज टी 1 प्लस टी 4, टी 1 प्लस टी 4 प्लस आरवी 5, और चार फेज कॉकटेल प्रभावी थे।इस प्रक्रिया को करते समय, बेहद सटीक पिपेटिंग, विशेष रूप से जब एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग किया जाता है और दृष्टिकोण की एकरूपता तुलनीय और व्याख्यायोग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक होती है। स्क्रीनिंग में सबसे प्रभावशाली कॉकटेल के आगे के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए अनुवर्ती प्रयोगों की आवश्यकता होती है, जो एक व्यापक शोरबा संस्कृति प्रणाली और अन्य जैविक आव्यूहों में एंटीफेज म्यूटेंट के उद्भव को रोकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

इन्फ्लुएंजा वायरस के लिए उच्च throughput जांच विधि

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

मात्रात्मक उच्च throughput टी कोशिकाओं के लिए एकल कक्ष cytotoxicity परख

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

आरएनए वायरस के व्यापक स्पेक्ट्रम रासायनिक inhibitors के लिए उच्च throughput प्रदर्शन

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

बृहतभक्षककोशिका Phagocytosis और actin polymerization के आकलन के लिए उच्च Throughput Fluorometric तकनीक

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

उच्च throughput जीन टैगिंग में<em&gt; Trypanosoma ब्रुसे</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

नेनो पीसीआर द्वारा पशु नमूनों में श्वसन रोगज़नक़ों के उच्च throughput जांच

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

एक प्रतिदीप्ति आधारित लिम्फोसाइट परख छोटे अणुओं के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

साल्मोनेला एसपीपी की स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च प्रवाह मंच./शिगेला एसपीपी.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

एक उच्च थ्र्रपुट शिगेला-विशिष्ट जीवाणुनाशक परख

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...