Name: bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC 디스커버리 그랜트, RGPIN-2019-04384), 캐나다 혁신 재단 (프로젝트 # 38710), 주요 혁신 기금, 앨버타에 의해 지원되었습니다. 원고를 편집해 주신 존 카슬릭 박사에게 감사드립니다.

1. 버퍼 및 시약 준비
<ol><li>500mL의 트립틱 대두 국물(TSB) (TSB 파우더 15g, 초순수 500mL)와 오토클레이브를 만듭니다. 참고: 최대 3개월 동안 실온또는 최대 6개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>500mL의 트립틱 대두 화루(TSA) (TSA 분말 20g, 초순수 500mL)와 오토클레이브를 만듭니다. 참고: 최대 3개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>500mL의 인산염 완충식 살린(PBS; NaCl 4g, KCl 0.1g, Na2HPO4 0.77g, KH2PO4 0.12g, 초순수 500mL)을 25°C에서 0.± 2로 측정하고 조정합니다. 참고: 최대 6개월 동안 4°C에 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>1M MgSO4 (49.294g 및 초순수 200mL)의 200mL를 만들고 0.22 μm 폴레테르술폰 필터를 통해 살균한다.</li>
	<li>10m MgSO4 (mTSB; TSB 분말 15 g, 초순수 500mL, 1 M MgSO4의 5mL)와 오토클레이브로 TSB 500mL를 만듭니다. 오토클레이브 미디어를 실온으로 식힙니다. 무균 기술을 적용합니다. 세로지학적 파이펫을 사용하여, 1 M MgSO4의 5.0mL를 신중하게 전송; 부드럽게 소용돌이하여 섞습니다.</li>
</ol>2. 세균 배양 준비
<ol><li>세균 연구소 문화 (BRLC)를 준비하려면, 냉동고 재고에서 글리세롤 주식 바이알 (들)을 제거하고 실험실로 전송.</li>
	<li>일회용 접종 루프 또는 동등한 것을 사용하여 바이알에 담그고, 접종 (냉동 슬러시)의 긁기를 제거하고, 레벨 II 생물학적 안전 캐비닛 내에서 TSA 플레이트 또는 동등한 에 줄무늬. 플레이트를 37 ± 2°C에서 15-18h의 배양합니다.</li>
	<li>준비된 BRLC 플레이트를 가방에 넣고 4°C에 보관하십시오. 참고: BRLC의 일반 만료 기간: 세대 후 4°C에서 14일.</li>
	<li>BRLC 플레이트로부터 각 대장균 O157 균주의 단일 콜로니를 접종하여 10mL의 TSB에서 테스트하고 18h에 대해 37°C에서 정전기 배양하여 9log10 CFU/mL에 도달한다.</li>
	<li>4-5 log10 CFU/ml(또는 다른 원하는 접종 수준)를 달성하기 위해 MgSO4의 10mMM를 함유한 mTSB를 사용하여 야간 배양(다음 날 아침) 각 대장균 O157 균주의 직렬 희석을 준비한다.</li>
	<li>세균 혼합물을 준비하기 위해 각 변형의 야간 배양물의 동일한 양을 혼합하여 4-5 log10 CFU/mL을 총(또는 원하는 대로)을 달성한다.</li>
	<li>희석된 세균 배양을 4°C에 즉시 배치하여 사용 보류시.</li>
	<li>격리된 식민지를 얻기 위해 TSA 플레이트에 이러한 희석의 접종 배양 10 또는 100배 및 플레이트 0.1 mL 알리쿼트를 희석한다.</li>
</ol>3. 파지 작업 솔루션 준비
<ol><li>표준 방법4를 따라 각 파지(≥108 PFU/mL)에 대해 고음판 작업 주식을 전파합니다. 참고: 파지 주식의 일반적인 만료 기간은 세대 후 4°C에서 플라스틱 병에 3개월입니다.</li>
	<li>용해 운동학에 대한 ~108 PFU/mL의 원하는 티터를 달성하기 위해 MgSO4의 10mMMMM을 함유한 mTSB로 개별 파지 제제를 희석시한다. 각 작업 스톡의 동일한 볼륨을 동일한 티터와 혼합하여 파지 칵테일을 준비합니다.</li>
</ol>4. 개별 파지 및 파지 칵테일을위한 체외 용해 운동 제고
<ol><li>소독 96웰 마이크로 플레이트에서 각 파지의 10배 희석제는 마이크로플레이트 분석법을 설정합니다. 참고: 1개의 세균성 균주에 대하여 4개의 파지는 각 접시에, 인접한 열에서, 복제로 시험될 수 있습니다. 나머지 네 개의 열은 파지가 없는 컨트롤과 mTSB 공백(그림 1)입니다.</li>
	<li>96웰 마이크로플레이트의 1~12개 기둥에서 우물에 180μL의 mTSB를 놓습니다.</li>
	<li>희석된 개별 파지 또는 파지 칵테일(~108 PFU/mL)을 20μL에 추가하여 마이크로플레이트(Row A)의 상단 행 1-8에 우물을 넣습니다.</li>
	<li>파지 프리 및 블랭크 컨트롤의 경우 컬럼 9, 10 및 11의 상단 우물에 20 μL의 mTSB를 추가합니다.</li>
	<li>12채널 파이펫으로 플레이트를 희석시다. 행에서 행으로 20 μL을 전송합니다. 부드럽고 반복된 포부, 배출(최소 5회) 및 희석 사이의 팁 변경으로 잘 섞는다. 마지막 행(행 H)에서 20 μL을 제거합니다. 참고: 필터가 있는 팁을 사용하여 교차 오염을 방지하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>각 스트레인에 대한 저장소를 설정하고 1mL 파이펫을 사용하여 희석 된 배양의 2-3 mL을 저수지로 옮기다. 컬럼 1-10의 경우 멀티채널 파이펫을 사용하여 희석된 세균 배양의 20 μL을 각 우물에 추가합니다. 각 추가 사항 간에 팁을 변경합니다.</li>
	<li>원하는 조건에서 마이크로플레이트를 덮고 배양한다(예: 10시간 동안 37°C 또는 22h용 22°C).</li>
	<li>2h 또는 기타 원하는 간격에서 인큐베이터에서 마이크로 플레이트를 제거합니다.</li>
</ol>5. 광학 밀도의 결정
<ol><li>마이크로 플레이트 리더를 사용하여 600 nm (OD600nm)에서 광학 밀도를 검사합니다. 참고: 테스트 플레이트 준비 전에 프로그램에 분석 프로토콜을 설정하고 저장하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>마이크로 플레이트 판독기 및 개방형 프로그램을 켭니다.</li>
	<li>시작 옵션 창에서 간단한 모드를 선택하고 작업 관리자에서 새 프로토콜 만들기를 선택합니다(추가 그림 1a,b).</li>
	<li>플레이트 유형 선택 창에서 드롭다운 목록에서 96 웰 플레이트를 선택합니다(보조 도 2).</li>
	<li>감지 방법, 읽기 유형에 대한 엔드포인트/운동 옵션 및 광학 유형에 대한 단색도를 선택합니다. 확인을 클릭합니다(보충 도 3).</li>
	<li>읽기 단계의 경우 파장에 대해 600nm 를 입력하고 읽기 속도를 위해 노멀 을 선택합니다. 확인 을 클릭합니다(보충 도 4).</li>
	<li>분석의 온도를 설정하려면 인큐베이션 확인란을 클릭하고 인큐베이터 On을 선택합니다. 온도 상자에 원하는 온도를 입력합니다. 확인을 클릭합니다. 인큐베이션 중 플레이트 뚜껑의 응축을 방지하려면 그라데이션 상자에 값(1-3)을 입력하여 온도 그라데이션을 설정합니다. 확인을 클릭합니다(보충 도 5a). 참고: 37°C 인큐베이션 온도 에 대한 다음 단계 확인란을 계속하기 전에 예열을 클릭합니다. 이 단계는 22°C(RT)에서의 시험 조건에 필요하지 않습니다.</li>
	<li>다음으로 Kinetic 확인란을 클릭하여 Kinetic 설정을 엽니다. 37°C 인큐베이션용 10시간 또는 RT의 경우 22h로 런타임을 설정합니다. 확인 을 클릭합니다(보충 도 5b).</li>
	<li>절차 창의 쉐이크 확인란을 클릭하여 필요한 경우 각 운동 읽기(추가 그림 6a)에 대해 흔들림 조건을 설정합니다.</li>
	<li>쉐이크 모드의 선형 을 선택하고 기간을 30초로 변경한 다음 선형 주파수 값을 731 cpm(2mm)으로 설정한 다음 확인(추가 그림 6b)을 클릭합니다.</li>
	<li>프로토콜 요약 대화 창에서 플레이트 레이아웃을 클릭하고 공백, 분석 컨트롤 및 샘플을 선택합니다. 다음을 클릭합니다(추가 그림 7). 참고: 음수 제어를 위해 다른 컨트롤 유형 수에 1을 입력합니다.</li>
	<li>각 웰 유형에 대한 설정을 정의한 후 마무리를 클릭 합니다.</li>
	<li>왼쪽 인터페이스에서 Well ID 를 선택한 다음 플레이트 레이아웃 과부에 표시된 행렬에 할당합니다. 확인 을 클릭합니다(보충 도 8).</li>
	<li>읽기 플레이트 버튼을 클릭하고 프로토콜을 .prt 파일로 저장하고 저장(추가 그림 9)을 클릭합니다.</li>
	<li>접시를 삽입하고 확인을 클릭 합니다.</li>
	<li>실험이 완료되면 실험을 .xpt 파일로 저장하고 저장 (추가 그림 10)을 클릭합니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해 메시지 창 상자의 예 버튼을 클릭하여 Excel로 데이터를 내보냅니다(추가 그림 11).</li>
	<li>저장 예/아니요 선택 영역을 클릭하고 다시 묻지 마세요 확인란을 클릭하여 기본 설정을 저장합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>위에서 설명한 바와 같이 적어도 두 개의 독립적인 실험을 반복합니다. 모든 독립적인 시험에서 결과를 컴파일합니다. 각 파지 처리 및-무료 문화에서 OD600 의 평균 및 표준 편차를 계산합니다.</li>
	<li>600 nm에서 OD 값의 제곱근을 수행하고 각 세균균 균주와 온도에 대한 적절한 통계 모델을 사용하여 분석합니다. 참고: SAS 소프트웨어의 경우 혼합 모델과 최소 사각형이 선택되어 의미(P < 0.05)를 구분합니다. 각 균주에 대해, 패널 A-G를 시간에 걸쳐 전반적인 항 O157 효능을 각 파지 치료에 할당하고 MOI가 다르다(P < 0.05).</li>
	<li>검출 가능한 세균 성장(검출 제한:300 CFU/mL)에 대응하는 OD600nm 값 ≤ 0.01에 기초한 우수한 파지 효능을 정의합니다.<ol>
<li>적절한 통계 모델을 사용하여 파지 효능에 대한 시간, 인큐베이션 온도, 대장균 O157 균주, MOI 및 파지 유형의 효과를 분석합니다. 참고: SAS 소프트웨어의 경우 임의의 측정값으로 GLIMMIX를 사용합니다.</li>
		<li>확률 비율을 계산하여 다양한 환경 및 생물학적 관심 요인에 대한 우수한 효능을 비교합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections.">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li><li>Czaplewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+antibiotics-a+pipeline+portfolio+review.">Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).</li><li>Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. 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저자는 연구가 잠재적 인 이해 충돌로 해석 될 수있는 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 수행되었다고 선언합니다.

이 프로토콜은 STEC9 및 살모넬라10을 포함하여 식인성 병원체에 대하여 체계적으로 파지 효험을 평가하기 위한 강력한 접근을 기술했습니다. 한 가지 중요한 단계는 박테리아의 하룻밤 문화를 희석하고, 미리 냉각된 매체를 사용하고, 얼음 양동이로 희석을 조작하는 것이 잠재적인 세균 성장을 최소화하는 것이 좋습니다. 또한, 파지 희석은 세균 배양을 희석하기 전에 제조되었다. 열거 단계 2.8은 적용된 최종 MOI의 계산을 위한 세균 성 무큐럼의 실제 수를 제공했다. 파지 제제를 위해, 세균 배양의 4-6 h에 감염된 필터 파지에 의해 제조된 조질 파지 용액이 일반적으로 사용된다. 파지 감염과 관련된 중요한 단계는 항상 3 개월 이내에 준비 된 파지 작업 주식을 사용하는 것입니다. 매우 정확한 파이펫팅(특히 멀티채널 파이펫을 사용하는 경우)과 균일성 도 유사하고 해석 가능한 결과를 얻는 데 필수적입니다. Mg2+의 10mMM로 보충된 수정된 TSB는 파지, 세균 배양 및 기본 매체를 희석하여 파지의 흡착 및 감염을 최적화하는 데 사용되었습니다.
로그 단계에서 박테리아가 증식함에 따라 인큐베이터 온도 보다 낮더라도 잠재적인 세균 성장을 최소화하기 위해 로그 상 배양 대신 희석된 하룻밤 문화를 사용하는 것이 좋습니다.
제안된 프로토콜에는 제한이 있습니다. 첫째, 마이크로 플레이트는 200 μL만 보유할 수 있기 때문에 장기간 배양되어 상당한 증발을 일으킬 수 있으며 권장되지 않습니다. 이 경우, 분석체는 천천히 성장하는 박테리아에 적합하지 않을 수 있습니다. 둘째, 제안된 프로토콜은 파지의 증폭을 모니터링할 수 없었다. 셋째, 이 프로토콜은 파지 치료의 결과를 결정하는 중요한 인자인 시간이 지남에 따라 파지 저항의 발달을 모니터링할 수 없었다11,12. 광범위한 국물 배양 시스템 및 기타 생물학적 행렬에서 파지 돌연변이체의 출현을 방지하는 스크리닝에서 가장 영향력 있는 칵테일의 추가 성능을 평가하기 위해서는 후속 실험이 필요합니다.
기존의 항균제와는 달리, 파지의 생물학적 특성은 실용적인 환경에서 생체 제어 및 치료 사용의 복잡성에 영향을 미칩니다. 종래의 파지 칵테일의 합리적 선택은 주로 리틱 활동과 파지의 호스트 범위를 기반으로합니다. 가장 강한 lytic 활동과 가장 넓은 호스트 범위를 가진 파지 후보는 종종 권장13,14. 그러나, 현재 연구에 따라, rV5 및 T1과 같은 파지는 T4 및 T5와 같은 악성은 아니지만 T4 및/또는 T5와 결합될 때 전반적인 생체 제어 결과를 크게 촉진시켰습니다. 따라서 파지 칵테일의 우수한 효능을 달성하기 위해 원하는 환경 조건하에서 표적 숙주 균에 대한 잠재적 파지 조합의 항균 활성의 전신 스크리닝을 권장합니다. 또한, 파지 후보에 대한 수용체의 결정과 다양한 수용체와 파지의 포함은 호스트 부착에 대한 경쟁을 방지하고, 항파지 돌연변이체의 급속한 발달을 저지하고, 생물통제 결과를 향상시킬 수 있다13.
이 방법을 사용하면 고처리량 형식으로 파지 용해 역학의 정확한 정량화를 가능하게 했습니다. 더욱이, 파지의 구색의 항균 효능에 대한 다양한 생물학적 및 환경적 요인을 체계적으로 평가하여 최적화된 결과를 통해 파지 칵테일의 제형을 용이하게 하였다. 이 방법의 향후 응용 프로그램 및 개발은 파지의 형광 라벨링에 의해 파지 칵테일 내각 파지의 효능 을 모니터링하는 데 관여하는 것으로 가정됩니다. 제안된 프로토콜 이외에, 한 호스트를 공동 감염시킬 때 파지 간의 시너지 효과및 촉진효과를 촉진하는 유전 결정자를 이해하면 우수한 효능을 가진 적절한 파지 칵테일의 제형을 용이하게 할 것이다.

박테리오파지(파지)는 세균세포를 자연적으로 침범하여 세균대사를 방해하고 박테리아의 리시스를 유발하는 바이러스입니다. 기존의 항균제(예: 항생제)와 는 달리 파지 숙주 스펙트럼은 상대적으로 좁고, 표적 세균종 이나 균주를 감염시킬 수 있으며, 따라서 동물과 인간의 건강에 유익한 미생물에 대한 부수적 효과를 최소화해야 한다. 항균 저항의 상승으로 (AMR), 파지와 그들의 유도체는 인간과 동물에 있는 AMR 세균성 감염을 포함하여 세균성 전염병을 통제하는 대체 항균제로 이끌어 1,2. 파지는 >20 인체의 상부 호흡기 및 위장관감염의 피상적 감염및 감염을 유발하는 세균성 병원체에 대한 치료 잠재력을 확인했습니다3.
농업 환경에서 파지 기반 생물 통제 전략은 박테리아 병원균을 제어하기 위해 파지의 치료 사용입니다. 파지 생물 제어는 다양한 식품4,5에서 식인성 병원균(예: 시가 독소 생산 에샤리치아 대장균(STEC), 살모넬라 및 리스테리아를 오염시키는 데 효과적이며, 친환경 기술로 잘 받아들여진다. 또한, 파지는 식품 가공 표면및 동물 가죽을 소독하기 위해 소독제로 사용될 수 있으며, 이는 기존의 항균 시스템(예: 화학물질, 증기 및 온수 저온 살균)에 통합되어 원하는 결과를 향상시키고 환경 적 영향을 줄일 수 있습니다. 동물에 있는 zoonotic 박테리아를 감소시키기 위하여 파지의 사용은 또한 유망합니다1. 그러나 다양한 식품 생산 시스템에 널리 적용될 파지 바이오 컨트롤 접근 방식의 결과를 개선하기 위한 기술적 과제를 해결해야 합니다. 주요 과제는 박테리아 내성 돌연변이의 발달로 인한 파지의 손상된 효과5 및 환경 스트레스 요인에 노출로 인한 세균 생리학의 변화입니다6.
파지 저항의 위험을 최소화하기 위해 파지 칵테일 (즉, 여러 파지의 조합)이 제안되고 농업 및 양식 환경에서 생물 제어 효능을 향상시게됩니다7. 그러나, 여러 연구에서, 그것은 파지 칵테일 항상 단일 파지의 관리 보다 더 나은 효과 제공 하지 않은 입증 되었습니다. 예를 들어, 3 T4 와 같은 파지의 칵테일은 대장균 균주에 대한 좁은 호스트 범위를 했다8. 또한, TEquintavirus의 회원인 AKFV33은 인큐베이션 온도가 적용되어 있음에도 불구하고 쇠고기에서 대장균 O157을 제거하는 데 4개의 파지칵테일보다 더 큰 효능을 보였습니다4. 최근에는 개별 파지의 효과가 O1579의 제어를 위한 파지 칵테일의 효능을 예측하지 못하는 것으로 보고되었으며, 여러 파지 간의 상호 작용이 효능을 변화시킬 수 있기 때문에. 가장 중요한 것은 파지 제네라와 조합, 표적 균주와 MOI, 인큐베이션 온도 및 시간과 같은 수많은 요인이 파지 간의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 따라서 파지 시너지 또는 촉진을 평가하기 위해 특정 박테리아에 대한 파지 조합을 신중하게 선별하거나 특정 환경 조건하에서 최소한의 파지 길항증을 보장하기 위해서는 최적의 결과를 위해 매우 중요합니다. 여기서, 다양한 환경 조건 하에서 식인성 병원균에 대한 다양한 파지 조합의 효능을 체계적으로 평가하는 방법이 기재되어 있다. 이 접근법의 장점은 자연 설정에서 파지의 항균 효능에 영향을 미칠 것으로 예상되는 모든 가능한 생체 및 비생물 인자의 스크리닝을 가능하게 하는 것입니다. 프로토콜에서 STEC O157 및 감염 파지는 예로 사용됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essential supplies, reagents, and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374361</td>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Diameter: 100 mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17013808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips RT LTS 1000&#181;L FL 768A/8-low retention</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 20&#181;L F 960A/5</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 300&#181;L 768A/4</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005867</td>
			<td>no filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>168055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar (TSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105458-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105459-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Shaped Cell Spreaders</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76299-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Microbiological Incubators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50125590H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer Hotplates</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-889-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon Stir Bars</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>14-512-125</td>
			<td>length: 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BTNEO2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>9.4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings

세균 병원균은 전 세계적으로 식품 안전 시스템에 지속적으로 도전합니다. 열 및 소독제 내성 박테리아의 출현에 대한 우려가 증가함에 따라 새로운 항균제는 긴급하게 필요합니다. 박테리오파지 기반 의 생물 통제 전략은 농업 환경에서 세균 병원균을 제어하기 위해 파지의 치료 사용입니다. 파지 생물 통제는 점점 더 지속 가능한 기술로 받아들여지고, 식인성 병원체를 오염시키는 데 효과적이다. 효과적인 바이오 컨트롤 결과를 보장하기 위해 필요한 환경 조건하에서 표적 박테리아에 대한 파지 조합의 체계적인 선별이 중요합니다. 파지 칵테일의 항균 효능은 파지 제네라와 조합, 표적 세균균 균주, 감염의 복합성, 온도 및 시간에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 뛰어난 효능을 가진 파지 칵테일을 제조하기 위해, 제안된 방법은 표적 조건하에서 식인성 세균병원균을 죽이는 개별 파지 및 파지 칵테일의 효과를 체계적으로 평가하는 것이었습니다. 세균성 살상 효능은 원하는 온도와 지속 시간에 광학 밀도를 측정하여 모니터링하였다. 우수한 파지 효능은 세균 성장의 완전한 억제에 의해 결정되었다. 제안된 방법은 우수한 항균 효능을 가진 파지 칵테일을 제조하는 것을 용이하게 하는 강력하고 증거 기반의 접근법입니다.

프로토콜에 따라, 다양한 파지 조합, 온도, 시간 및 MOI를 가진 안티 O157 파지 효능의 비교가 수행되었다. 항대장균 O157 효능 향상에 사용되는 인큐베이션 온도 및 시간, MOI, 파지 및 세균균의 영향은 표 1 (확률 비율 표)9에 제시된다. 광학 탁도 측정의 백분율(%) ≤ 0.01산출은 각 실험 조건하에서 각 파지 제제에 의해 분석되었다. 이러한 분석에 기초하여, 안티-O157 파지 효능은 22°C(P < 0.001)와 MOI =1000(P < 0.001)에서 14, 16 또는 18h의 배큐베이션 후 최대화되었으며, 파지 처리 배양의 성장의 75%와 89%가 각각 완전히 억제되었다. 일반적으로, 11 파지 준비 중, T1, T4 및 rV5의 칵테일은 O157에 대해 가장 효과적이었다 (P < 0.05). 또한, 배양 온도, 시간, MOI 및 파지 전반에 걸쳐, 파지에 대한 민감도는 다양하며, O157 균주는 균주 CO281-31N으로 가장 민감(P < 0.001) 및 3081(P < 0.001)으로 테스트되어 파지에 가장 민감합니다.
각 세균균의 파지 죽이는 역학을 이해하기 위해, OD600 값은 각 배양 온도에서 각 샘플링 시간, MOI 및 파지 치료에 대해 플롯되었다. 37°C에서 대장균 O157 3081에 대한 파지의 효능으로부터 대표적인 결과가 도 2에 도시된다. 파지 처리 배양의 성장 곡선을 평가하기 전에 파지 없는 대조군 배양의 성장 곡선이 정상임을 보장한다. 도 2에 따르면, T4의 포함은 37°C에서 세균 성장을 완전히 억제하고, 각 샘플링 시간에 1이하의 MOI를 한다. 파지가 다양한 온도에서 시간이 지남에 따라 세균 성장을 억제하는 방법을 개요하기 위해, 모든 MOI에서 평균 OD600nm 값 (MOI > 0) 각 샘플링 시간 및 파지 치료에 대해 플롯되었다 (도 3). 37°C에 비해, 특정 파지 살루 효능, 예를 들어, 파지 T4 및 T1 + T4, 22°C 이상 향상되었다. 파지 중 전반적인 안티-O157 효과를 요약하고 비교하는 또 다른 방법은 표 2 및 표 39에 표시됩니다. OD600 값은 각 샘플링 시간과 MOI에서 평균화되었으며 가장 높은(A)에서 가장 낮은(F: 37°C 및 D: 22°C)까지 파지 효능을 평가하였다. 이 표는 최고의 파지 치료의 식별을 용이하게합니다. 예를 들어, 변형3081의 경우, 파지 T4 및 T5 + T4(패널 A)는 37°C에서 가장 효과적인 치료법이었으며, 파지 T4 외에, 파지 T1 + T4, T1 + T4 + T4 + rV5, 및 4 파지 칵테일(Panel A)이 22°C에서 가장 효과적인 치료법이었다.
이 프로토콜은 또한 우리가 표적으로 한 각종 세균성 긴장에 대하여 파지 효험을 비교하고 파지 준비를 사용자 정의하는 가능하게 했습니다. 예를 들어, 파지를 선택할 때, 37°C에서 균주 3081을 제외하고, 파지 T1 + T4 + rV5는 파지 유형에 관계없이 다른 모든 균주에 대해 가장 중요한 효과를 가졌다. 22°C에서 4파지 칵테일은 테스트된 모든 균주에 대해 가장 효과적이었다. 최고의 MOI는 완전한 용해 (OD600 ≤ 0.01)를 초래했으며, 이는 실험 조건 (표 2 및 표 3)에서 잠재적 인 우수한 효능을 보증했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg"> 그림 1: 96웰 마이크로플레이트 분석의 제안 된 레이아웃. 각 파지의 직렬 10배 희석제는 멸균 96웰 마이크로플레이트의 1-8럼에 제조된다. 1개의 세균성 균주에 대하여 4개의 파지는 각 접시에, 인접한 열에서, 복제로 시험될 수 있습니다. 나머지 열은 컨트롤용입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg"> 도 2: 대장균 O157 균주 3081에서 37°C의 성장 곡선을 치료하고 각 MOI에서 파지로 처리되지 않습니다. 데이터는 두 개의 독립적인 시험에서 컴파일되었습니다. 막대에는 표준 편차가 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg"> 도 3: 대장균 O157 균주 3081 균주의 성장 곡선. (A) 성장 곡선37°C. (B) 성장 곡선 22°C. 각 곡선은 개별 및 혼합 배양을 나타내며, 치료되고 MOI 전반에 걸쳐 파지로 처리되지 않습니다. 데이터는 두 개의 독립적인 시험에서 컴파일되었습니다. 막대에는 평균의 표준 오류가 표시됩니다(권한으로 참조9 에서 조정). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 인큐베이션 온도에서 대장균 O157에 대한 우수한 파지 효능의 가능성을 비교하는 확률 비율, 인큐베이션 시간, MOI, 파지 및 E. coli O157의 균주(권한으로 Reference9에서 조정). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank"></a>
표 2: 대장균 O157에 대한 전체 파지 효능 37°C(권한 있는 참조9에서 조정). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank"></a>
표 3: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank"></a>22°C에서 대장균 O157에 대한 전반적인 파지 효능(권한으로 Reference9에서 조정). 
보충 수치 1-11: 마이크로 플레이트 판독기 작업 및 절차의 스냅샷. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank"></a>

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Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

이 프로토콜은 박테리오파지 칵테일의 항균 효능을 선별하기 위해 고처리량 설정을 사용하는 강력한 방법을 설명합니다.

높은 처리량 설정을 통해 평가된 식인성 병원체의 생물통제에 대한 박테리오파지 효과

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

이 프로토콜을 수행하기 쉬운 프로토콜은 높은 처리량 설정에서 다양한 조건 하에서 파지 칵테일이라고도 하는 다양한 박테리오파지 조합의 항균 효능을 평가합니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 환경 조건하에서 파지 효능에 영향을 줄 수 있는 온도와 같은 다양한 생체 제제 및 비생물인자를 스트리밍하는 능력입니다. 이 방법은 생체 제어 및 치료 결과를 향상시키고 세균 성 호스트와 박테리오파지 사이의 상호 작용을 결정하기 위해 적절한 파지 칵테일의 설계를 용이하게 할 수 있습니다.먼저 교차 오염을 방지하기 위해 필터링된 팁을 사용하여 마이크로플레이트 분석기를 설정합니다. 먼저, 96웰 마이크로플레이트 의 1~12개의 컬럼에 180마이크로리터를 추가한 다음, 멸균 96웰 마이크로플레이트의 1~8개 기둥에 각 파지의 연속 10배 희석제를 준비하여 분석법을 설정한다. 마이크로 플레이트의 상단 행 A의 1~8개 에 개별 파지 또는 파지 칵테일 20마이크로리터를 추가합니다.파지 프리 및 빈 컨트롤의 경우 9~12개의 열 상단에 20마이크로리터의 mTSB를 추가합니다. 파이펫팅하는 동안, 적어도 다섯 번 부드럽고 반복 된 포부와 희석 사이의 팁을 변경잘 내용을 혼합. 마지막 행 H에서 20 마이크로리터를 제거한 다음 희석 된 배양의 2 ~3 밀리리터를 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 저수지로 이송하여 테스트 된 세균 균주에 대한 저장소를 설정합니다.멀티채널 파이펫을 사용하여 각 첨가물 사이의 팁을 변경하면서 1~10개의 컬럼에 희석된 세균 배양의 마이크로리터 20개를 추가합니다. 마이크로 플레이트를 덮고 섭씨 37도에서 배양합니다. 2 시간 간격으로 인큐베이터에서 마이크로 플레이트를 제거하고 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 읽습니다.또는 마이크로 플레이트 판독기에서 플레이트를 배양하고 시간이 지남에 따라 읽습니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 600 나노미터의 광학 밀도를 검사하려면 마이크로 플레이트 판독기에서 프로그램을 엽니다. 시작 옵션 창에서 간단한 모드를 선택한 다음 작업 관리자에서 새 프로토콜 만들기를 선택합니다.플레이트 유형 선택 창에서 드롭다운 목록에서 96웰 플레이트를 선택합니다. 감지 방법으로 읽기 유형에 대한 흡광도를 선택하고, 광학 유형에 대한 끝점/운동 옵션을 선택하고, 단색로미터를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 읽기 단계의 경우, 파장에 대한 600 나노미터를 입력, 읽기 속도에 대한 일반을 선택하고 분석에 대한 온도를 설정 OK.To 클릭, 인큐베이터 확인란을 클릭하고 인큐베이터 를 선택 On.온도 상자에 원하는 온도를 입력한 다음 확인을 클릭합니다. 섭씨 22도의 시험 조건에는 옵션이 필요하지 않지만 섭씨 37도 의 다음 단계 확인란으로 계속하기 전에 예열을 클릭하십시오. 인큐베이션 중에 플레이트 뚜껑의 응축을 방지하려면 그라데이션 상자에 값을 입력하여 온도 그라데이션을 설정한 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로 Kinetic 확인란을 클릭하여 운동 설정을 엽니다.런 타임을 섭씨 37도 인큐베이션으로 10시간 또는 실온22시간 동안 설정하고 판독 간격으로 2시간을 입력한 다음 OK를 클릭합니다. 각 운동 읽기에 필요한 경우 쉐이크 상태를 설정하려면 프로시저 창의 쉐이크 확인란을 클릭합니다. 리니어를 쉐이크 모드로 선택하고 지속 시간을 30초로 변경합니다. 선형 주파수 값을 분당 731사이클로 설정한 다음 프로토콜 요약 대화 창 OK.In 클릭하고, 플레이트 레이아웃을 클릭하고, 공백, 분석 컨트롤 및 샘플을 선택하고 다음을 클릭합니다.각 웰 유형에 대한 설정을 정의한 후 마무리를 클릭합니다. 왼쪽 인터페이스에서 잘 ID를 선택하고 플레이트 레이아웃 창에 표시된 행렬에 할당한 다음 확인을 클릭합니다. 읽기 플레이트 버튼을 클릭하고 프로토콜을 prt 파일로 저장하고 저장을 클릭합니다. 접시를 삽입하고 확인을 클릭합니다. 실험이 완료되면 실험을 XPt 파일로 저장하고 저장을 클릭합니다.추가 분석을 위해 메시지 창 상자의 예 단추를 클릭하여 데이터를 Excel로 내보냅니다. 저장 예/아니오 선택 영역을 클릭하고 기본 설정을 저장하려면 다시 확인란을 요청하지 마십시오. 프로토콜에 따라, 파지 효능의 비교는 다양한 파지 조합, 온도, 시간, 및 감염의 복합성, 또는 MOI, 수행되었다.이러한 분석에 기초하여, 항 O157 파지 효능은 섭씨 22도에서 14, 16 또는 18시간의 배양 후에 최대화되었다. 박테리아의 파지 죽이는 역학을 이해하기 위해 600 나노미터의 OD 값은 샘플링 시간, MOI 및 파지 치료에 대해 플롯되었습니다. 치료된 섭씨 37도에서 대표적인 세균 성장 곡선이 표시됩니다.T4는 낮은 MOI에서도 각 샘플링 시간에 세균 성장을 완전히 억제했습니다. 파지를 분석하여 세균 성장을 저해하고, 모든 MOI의 평균 OD 값이 각 샘플링 시간 및 파지 처리에 대해 플롯되었다. 두 온도에서 대표 그래프는 파지 살인 효능을 밝혀, 예를 들어, T1 플러스 T4에 대한 향상 된 22 섭씨 에 비해 섭씨 37 섭씨.전반적인 파지 효과의 비교는 최고의 위상 처리를 확인하는 것을 용이하게 하는 표시됩니다. 예를 들어, 대장균 균주 3081의 경우, 파지 T4 및 T5 플러스 T4를 가진 치료는 섭씨 37도에서 가장 효과적인 치료법이었다. 그러나, 22도에서, T4, 파지 T1 플러스 T4, T1 플러스 T4 플러스 rV5, 4 파지 칵테일 이외에도 효과적이었다.이 절차를 수행할 때, 특히 멀티채널 파이펫과 접근 방식의 균일성을 사용할 때 매우 정확한 파이펫팅은 비교되고 해석 가능한 결과를 얻기 위해 필수적입니다. 후속 실험은 광범위한 국물 배양 시스템 및 기타 생물학적 행렬에서 항식 돌연변이의 출현을 방지하여 스크리닝에서 가장 영향력 있는 칵테일의 추가 성능을 평가해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

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High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

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High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

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살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

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높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

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