Name: bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), Canada Foundation for Innovation (Prosjekt # 38710) og Major Innovation Fund, Alberta. Vi takker dr. John Kastelic for at han redigerte manuskriptet.

1. Utarbeidelse av buffer og reagenser
<ol><li>Lag 500 ml tryptisk soyabuljong (TSB) (15 g TSB pulver og 500 ml ultrarent vann) og autoklav. MERK: Dette kan oppbevares ved romtemperatur i opptil 3 måneder eller ved 4 °C i opptil 6 måneder.</li>
	<li>Lag 500 ml tryptisk soya agar (TSA) (20 g TSA pulver og 500 ml ultrapure vann) og autoklav. MERK: Dette kan oppbevares ved 4 °C i opptil 3 måneder.</li>
	<li>Lag 500 ml fosfatbufret saltvann (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,77 g Na2HPO4 og 0,12 g KH2PO4, 500 ml ultrarent vann), måler og justerer pH til 7,2 ± 0,2 ved 25 °C og autoklaver. MERK: Dette kan oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.</li>
	<li>Lag 200 ml 1 M MgSO4 (49,294 g og 200 ml ultrarent vann) og steriliser via 0,22 μm polyethersulfonfilter.</li>
	<li>Lag 500 ml TSB med 10 mM MgSO4 (mTSB; 15 g TSB pulver, 500 ml ultrarent vann og 5 ml 1 M MgSO4) og autoklav; la de autoklamerte mediene avkjøles til romtemperatur. Påfør den aseptiske teknikken. Bruk en serologisk pipette, overfør forsiktig 5,0 ml 1 M MgSO4; virvle forsiktig for å blande.</li>
</ol>2. Forberedelse av bakteriekultur
<ol><li>For å forberede bakteriell forskningslaboratoriumskultur (BRLC), fjern glyserol lager hetteglass (er) fra fryselageret og overfør til laboratoriet.</li>
	<li>Bruk en engangs inokulasjonssløyfe eller tilsvarende, dypp i hetteglasset, fjern en skraping av inokulum (frossen slush), og strek på en TSA-plate eller tilsvarende i et biologisk sikkerhetsskap på nivå II. Inkuber platen ved 37 ± 2 °C i 15–18 timer.</li>
	<li>Bag de tilberedte BRLC-platene og oppbevar ved 4 °C. MERK: Generell utløpstid for BRLC: 14 dager ved 4 °C etter generasjon.</li>
	<li>Inokuler en enkelt koloni av hver E. coli O157-stamme fra BRLC-platene som skal testes i 10 ml TSB og inkuberes statisk ved 37 °C i 18 timer for å nå 9 log10 CFU/ml.</li>
	<li>Forbered en seriell fortynning av nattkulturene (neste morgen), hver E. coli O157-stamme ved hjelp av mTSB som inneholder 10 mM MgSO4 for å oppnå 4-5 log10 CFU / ml (eller annet ønsket inokulumnivå).</li>
	<li>Bland et likt volum av en nattkultur av hver stamme for å oppnå 4-5 log10 CFU / ml totalt (eller etter ønske) for å forberede bakterieblandingen.</li>
	<li>Plasser umiddelbart den fortynnede bakteriekulturen ved 4 °C for ventende bruk.</li>
	<li>Fortynn inokulumkulturen 10 eller 100 ganger og tallerken 0,1 ml aliquots av disse fortynningene på TSA-platene for å oppnå de isolerte koloniene.</li>
</ol>3. Utarbeidelse av phage arbeidsløsninger
<ol><li>Forplante høytitreringsbestander for hver phage som skal screenes (≥108 PFU/ml) ved å følge standardmetodene4. MERK: Den generelle utløpsperioden for phage-lagrene er 3 måneder i en plastflaske ved 4 °C etter generering.</li>
	<li>For å oppnå ønsket titer av for eksempel ~ 108 PFU / ml for lysis kinetikk, fortynn individuelle phagepreparater med mTSB som inneholder 10 mM MgSO4. Forbered phage cocktails ved å blande like store mengder av hver arbeidsbestand med samme titer i alle mulige kombinasjoner.</li>
</ol>4. Tilberedning av in-vitro lysis kinetikk for individuell phage og phage cocktails
<ol><li>Forbered serielle 10 ganger fortynning av hver phages i kolonne 1-8 i sterile 96-brønns mikroplater for å sette opp mikroplateanalysen. MERK: Fire phages mot en bakteriestamme kan testes i duplikat, i tilstøtende kolonner, på hver plate. De resterende fire kolonnene er for kontroller, som er uten phage, samt mTSB blank (figur 1).</li>
	<li>Plasser 180 μL mTSB til brønner fra kolonne 1 til 12 i mikroplaten på 96 brønner.</li>
	<li>Tilsett 20 μL fortynnede individuelle phages eller phage cocktails (~108 PFU/ml) i brønnene 1-8 av den øverste raden på mikroplaten (rad A).</li>
	<li>For phage-fri og Blank kontroll, legg 20 μL mTSB til toppbrønnen i kolonne 9, 10 og 11.</li>
	<li>Med en 12-kanals pipette, fortynn ned platen. Overfør 20 μL fra rad til rad. Bland brønninnholdet med mild, gjentatt aspirasjon, utkastelse (minst fem ganger), og endre tips mellom fortynning. Fjern 20 μL fra den siste raden (rad H). MERK: Bruk av tips med filtre anbefales for å forhindre krysskontaminering.</li>
	<li>Sett opp et reservoar for hver stamme, bruk 1 ml pipette for å overføre 2-3 ml av den fortynnede kulturen inn i reservoaret. For kolonne 1-10, bruk en flerkanals pipette for å legge til 20 μL av den fortynnede bakteriekulturen til hver brønn. Endre tips mellom hvert tillegg.</li>
	<li>Dekk til og inkuber mikroplaten under ønskede forhold (f.eks. 37 °C i 10 timer eller 22 °C i 22 timer).</li>
	<li>Ved 2 timers eller andre ønskede intervaller, fjern mikroplatene fra inkubatoren.</li>
</ol>5. Bestemmelse av optisk tetthet
<ol><li>Undersøk optisk tetthet ved 600 nm (OD600nm) ved hjelp av en mikroplateleser. MERK: Det anbefales å sette opp og lagre analyseprotokollen i programmet før klargjøring av testplaten.</li>
	<li>Slå på mikroplateleseren og åpne programmet.</li>
	<li>Velg enkel modus i vinduet Oppstartsalternativer , og velg Opprett en ny protokoll i Oppgavebehandling (Tilleggsfigur 1a,b).</li>
	<li>I vinduet Velg platetype velger du 96 Brønnplate fra rullegardinlisten (Tilleggsfigur 2).</li>
	<li>Velg Absorbans for deteksjonsmetode, endepunkt/kinetisk alternativ for lesetype og monokromoatorer for optikktype. Klikk på OK (supplerende figur 3).</li>
	<li>For Lesetrinn angir du 600 nm for bølgelengder og velger Normal for lesehastighet. Klikk på OK (tilleggs figur 4).</li>
	<li>Hvis du vil stille inn temperaturen for analysen, klikker du på avmerkingsboksen Inkuber og velger Inkubator på. Angi ønsket temperatur i Temperatur-boksen . Klikk på OK. For å unngå kondens på platelokket under inkubasjon, still inn en temperaturgradient ved å skrive inn en verdi (1-3) i Gradient-boksen. Klikk på OK (Supplerende figur 5a). MERK: Klikk på forvarmingen før du fortsetter med neste trinn for 37 °C inkubasjonstemperatur. Dette trinnet er ikke nødvendig for testtilstanden ved 22 °C (RT).</li>
	<li>Deretter klikker du på Kinetic-avmerkingsboksen for å åpne Kinetic Setup. Still inn operasjonstiden for 10 timer for inkubasjon på 37 °C eller 22 timer for RT. Angi 2 timer for leseintervall. Klikk på OK (Tilleggs figur 5b).</li>
	<li>Klikk på Rist-avkrysningsruten i Prosedyre-vinduet for å sette opp ristetilstanden, om nødvendig, for hver kinetisk lesing (Tilleggsfigur 6a).</li>
	<li>Velg Lineær for ristemoduser, og endre Varighet til 30 s. Sett lineær frekvensverdi til 731 cpm (2 mm), og klikk deretter på OK (Tilleggsfigur 6b).</li>
	<li>I vinduet Protokollsammendragsdialog klikker du på Plateoppsett og velger Emner, Analysekontroller og Eksempler. Klikk på Neste (supplerende figur 7). MERK: Skriv inn 1 i Antall forskjellige kontrolltyper for negativ kontroll.</li>
	<li>Etter å ha definert innstillingene for hver brønntype, klikker du på Fullfør.</li>
	<li>Velg en brønn-ID i grensesnittet til venstre, og tilordne den deretter til matrisen som vises i plateoppsettenke. Klikk på OK (supplerende figur 8).</li>
	<li>Klikk på Les plate-knappen og lagre protokollen som en PRT-fil og klikk på Lagre (tilleggsfigur 9).</li>
	<li>Sett inn platen og klikk på OK.</li>
	<li>Når eksperimentet er fullført, lagrer du eksperimentet som en XPT-fil og klikker på Lagre (tilleggsfigur 10).</li>
	<li>Eksporter data til Excel ved å klikke ja-knappen i meldingsvindusboksen for videre analyse (tilleggsfigur 11).</li>
	<li>Klikk på Lagre ja / nei-valget og ikke spør igjen for å lagre preferansen.</li>
</ol>6. Dataanalyser
<ol><li>Gjenta minst to uavhengige eksperimenter som beskrevet ovenfor. Kompilere resultater fra alle uavhengige forsøk. Beregn gjennomsnittlig og standardavvik for OD600 fra hver phage-behandlet og -fri kultur.</li>
	<li>Utfør kvadratroten av OD-verdiene ved 600 nm og analyser dem ved hjelp av en passende statistisk modell for hver bakteriestamme og temperatur. MERK: For SAS-programvare velges MIXED-modellen og minste kvadraters for å differensiere midler (P < 0,05). For hver stamme, tilordne paneler A-G til hver phage behandling av hvilken samlet anti-O157 effekt over tid og MOIer forskjellig (P < 0,05).</li>
	<li>Definer overlegen phage effekt basert på OD600nm verdi ≤ 0,01 tilsvarende ingen påviselig bakterievekst (grense for deteksjon: 300 CFU / ml).<ol>
<li>Analysere effekter av tid, inkubasjonstemperatur, E. coli O157-stammer, MOIer og phage-typer på phage-effekt ved hjelp av en passende statistisk modell. MERK: For SAS-programvare, bruk GLIMMIX med tilfeldige tiltak.</li>
		<li>Beregn oddsforhold for å sammenligne overlegen effekt for ulike miljømessige og biologiske faktorer av interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections.">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li><li>Czaplewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+antibiotics-a+pipeline+portfolio+review.">Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).</li><li>Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+therapy+in+bacterial+infections+treatment:+one+hundred+years+after+the+discovery+of+bacteriophages.">Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Escherichia+coli+O157+on+beef+at+37,+22+and+4&#176;C+by+T5-,+T1-,+T4-and+O1-like+bacteriophages.">Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4&#176;C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages.</a> Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).</li><li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing.">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), (2018).</li><li>Ly-Chatain, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factors+affecting+effectiveness+of+treatment+in+phages+therapy.">The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy.</a> Frontiers in Microbiololgy. 5, 51 (2014).</li><li>Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-based+biocontrol+strategies+and+their+application+in+agriculture+and+aquaculture.">Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).</li><li>Bourdin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coverage+of+diarrhoea-associated+Escherichia+coli+isolates+from+different+origins+with+two+types+of+phage+cocktails.">Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails.</a> Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).</li><li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+individual+bacteriophages+does+not+predict+efficacy+of+bacteriophage+cocktails+for+control+of+Escherichia+coli+O157.">Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157.</a> Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712 (2021).</li><li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+bacteriophage+T5virus+on+growth+of+Shiga+toxigenic+Escherichia+coli+and+Salmonella+strains+in+individual+and+mixed+cultures.">Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures.</a> Virology Journal. 17, 3 (2020).</li><li>Br&#252;ssow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+needed+for+phage+therapy+to+become+a+reality+in+Western+medicine.">What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine.</a> Virology. 434 (2), 138-142 (2012).</li><li>Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+cocktails+and+the+future+of+phage+therapy.">Phage cocktails and the future of phage therapy.</a> Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).</li><li>Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+therapy:+developments+and+directions.">Bacteriophage therapy: developments and directions.</a> Antibiotics. 9 (3), 135 (2020).</li><li>Niu, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+range+and+lytic+capability+of+four+bacteriophages+against+bovine+and+clinical+human+isolates+of+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli+O157:H7.">Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).</li></ol>

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kunne tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Denne protokollen beskrev en robust tilnærming for systemisk evaluering av fôreffekt mot matbårne patogener, inkludert STEC9 og Salmonella10. Et kritisk skritt er når du fortynner nattkulturen av bakterier, bruker kjølt medium og manipulerer fortynning med en isbøtte, anbefales å minimere potensiell bakterievekst. I tillegg ble phage fortynning tilberedt før fortynning av bakteriekultur. Opplistingstrinnet 2.8 ga faktiske antall bakterielle inokulum for beregning av den endelige MOI-anvendt. For fôrpreparat brukes vanligvis rå phage lysater fremstilt av filter phage infisert i 4-6 h bakteriekultur. Det kritiske trinnet forbundet med phage infectivity er alltid å bruke phage arbeidsbestander utarbeidet innen 3 måneder. Ekstremt nøyaktig pipettering (spesielt ved bruk av en flerkanals pipette) og ensartethet av tilnærming er også avgjørende for å oppnå sammenlignbare og tolkelige resultater. Modifisert TSB supplert med 10 mM Mg2+ ble brukt til å fortynne phages, bakteriekultur og basismedium for å optimalisere adsorpsjon og infeksjon av phages.
Ettersom bakterier sprer seg under loggfasen, selv under inkubatortemperatur, anbefales det å bruke fortynnet nattkultur i stedet for loggfasekultur, for å minimere potensiell bakterievekst.
Den foreslåtte protokollen har begrensninger. For det første, fordi mikroplate bare kan holde 200 μL, kan langvarig inkubasjon forårsake betydelig fordampning og anbefales ikke. I dette tilfellet kan analysen ikke være egnet for langsomt voksende bakterier. For det andre var den foreslåtte protokollen ikke i stand til å overvåke forsterkning av phages. For det tredje kunne denne protokollen ikke overvåke utviklingen av phage resistance over tid, en kritisk faktor som bestemmer utfallet av phage behandling11,12. Oppfølgingseksperimenter er nødvendig for å vurdere den videre ytelsen til den mest innflytelsesrike cocktailen i screeningen for å forhindre fremveksten av anti-phage mutanter i et omfattende buljongkultursystem og andre biologiske matriser.
I motsetning til konvensjonelle antimikrobielle midler påvirker phagens biologiske natur kompleksiteten i biokontroll og terapeutisk bruk i praktiske omgivelser. Konvensjonelt er rasjonelt utvalg av phage cocktails først og fremst basert på lytisk aktivitet og vertsspekteret av phages. Phage-kandidater med sterkest lytisk aktivitet og bredeste vertssortiment anbefales ofte13,14. Men basert på den nåværende studien la phages som rV5 og T1, men alene ikke så virulente som T4 og T5, sterkt til rette for generelt biokontrollresultat kombinert med T4 og / eller T5. Følgelig, for å oppnå overlegen effekt av phage cocktails, anbefales systemisk screening av antibakteriell aktivitet av potensielle phage-kombinasjoner mot målrettede vertsstammer under ønskede miljøforhold. I tillegg kan bestemmelse av reseptorer for phagekandidater og inkludering av phages med ulike reseptorer forhindre konkurranse om vertsfeste, hindre rask utvikling av anti-phage mutanter og forbedre biokontrollresultatene13.
Denne metoden muliggjorde nøyaktig kvantifisering av phage lysis kinetikk i et format med høy gjennomstrømning. Videre tillot det systematisk evaluering av ulike biologiske og miljømessige faktorer på den antibakterielle effekten av et utvalg av phages, og dermed lette formuleringen av phage cocktails med optimaliserte resultater. Metodens fremtidige anvendelser og utvikling antas å innebære in situ overvåking av effekten av hver phages innen phage cocktails ved fluorescens merking av phages. I tillegg til den foreslåtte protokollen, vil forståelse av genetiske determinanter som fremmer synergistiske og tilrettelagte effekter mellom phages når man co-infiserer en vert lette formuleringen av passende phage cocktails med overlegen effekt.

Bakteriofager (phages) er virus som naturlig invaderer bakterieceller, forstyrrer bakteriell metabolisme og forårsaker lysis av bakterien. I motsetning til konvensjonelle antimikrobielle midler (f.eks. antibiotika), er fektvertspekter relativt smale, bare i stand til å infisere et målrettet sett med bakterielle arter eller stammer og bør dermed minimere sikkerhetseffekter på mikrobiota som kommer dyr og menneskers helse til gode. Med fremveksten av antimikrobiell resistens (AMR) fører fekter og deres derivater til alternative antimikrobielle midler for å kontrollere bakterielle smittsomme sykdommer, inkludert AMR-bakterielle infeksjoner hos mennesker og dyr1,2. Phages har bekreftet terapeutisk potensial mot >20 bakterielle patogener som forårsaker overfladiske infeksjoner og infeksjoner i øvre luftveier og mage-tarmkanalen hos mennesker3.
I landbruksmiljøer er en phage-basert biokontrollstrategi terapeutisk bruk av phages for å kontrollere bakterielle patogener. Phage biocontrol er godt akseptert som en grønn teknologi, effektiv til dekontaminering av matbårne patogener (f.eks. Shiga-toksinproduserende Escherichia coli (STEC), Salmonella og Listeria) i ulike matvarer4,5. I tillegg kan pher brukes som rensemidler for å desinfisere matbehandlingsflater og dyreskinn, som kan integreres i konvensjonelle antimikrobielle systemer (f.eks. kjemikalier, damp og varmtvannspasning) for å forbedre ønskede resultater og redusere miljøpåvirkninger. Bruken av phages for å redusere zoonotiske bakterier hos dyr er også lovende1. Det er imidlertid behov for å ta tak i de tekniske utfordringene for å forbedre resultatene fra phage biocontrol-tilnærmingen som skal brukes populært i ulike matproduksjonssystemer. Hovedutfordringen er nedsatt effektivitet av phages på grunn av utvikling av bakterieresistente mutanter5 og endringer i bakteriell fysiologi på grunn av eksponering for miljøstressorer6.
For å minimere risikoen for fôrmotstand foreslås phage cocktails (dvs. en kombinasjon av flere phages) og har forbedret biokontrollstyrken i landbruket og akvakulturmiljøer7. Fra flere studier har det imidlertid vist seg at phage cocktails ikke alltid ga bedre effektivitet enn administrasjon av en enkelt phage. For eksempel hadde en cocktail av 3 T4-lignende phages et smalere vertsområde mot E. coli-stammer8. Videre hadde AKFV33, et medlem av Tequintavirus, større effekt enn en cocktail på fire phages i å fjerne E. coli O157 fra biff, til tross for inkubasjonstemperaturene som ble brukt4. Nylig har det blitt rapportert at effektiviteten av individuelle phages ikke forutsier effekten av phage cocktails for kontroll av O1579, da interaksjoner mellom flere phages kan endre effekten. Viktigst av alt, mange faktorer, for eksempel phage genera og kombinasjoner, målrettede stammer og MOIer, og inkubasjonstemperaturer og tider, kan påvirke interaksjoner mellom phages. Derfor er nøye screening av kombinasjoner av phages mot spesifikke bakterier for å vurdere phage synergy eller tilrettelegging, eller i det minste for å sikre minimal phage antagonisme under spesifikke miljøforhold, viktig for optimale resultater. Her beskrives en metode for systematisk å vurdere effekten av ulike fôrkombinasjoner mot matbårne patogener under en rekke miljøforhold. Fordelen med denne tilnærmingen er å muliggjøre screening av alle mulige biotiske og abiotiske faktorer som forventes å påvirke den antibakterielle effekten av phages i naturlige omgivelser. I protokollen brukes STEC O157 og deres smittende phages som et eksempel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essential supplies, reagents, and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374361</td>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Diameter: 100 mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17013808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips RT LTS 1000&#181;L FL 768A/8-low retention</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 20&#181;L F 960A/5</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 300&#181;L 768A/4</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005867</td>
			<td>no filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>168055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar (TSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105458-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105459-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Shaped Cell Spreaders</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76299-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Microbiological Incubators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50125590H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer Hotplates</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-889-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon Stir Bars</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>14-512-125</td>
			<td>length: 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BTNEO2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>9.4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings

Bakterielle patogener utfordrer kontinuerlig matsikkerhetssystemer over hele verden. Med økende bekymringer om fremveksten av varme- og desinfiseringsresistente bakterier, er det presserende behov for nye antibakterielle midler. En bakteriofagebasert biokontrollstrategi er terapeutisk bruk av phages for å kontrollere bakterielle patogener i landbruksmiljøer. Phage biocontrol aksepteres i økende grad som en bærekraftig teknologi, effektiv til å dekontaminere matbårne patogener. For å sikre effektive biokontrollresultater er systematisk screening av fôrkombinasjoner mot målrettede bakterier under nødvendige miljøforhold avgjørende. Antibakteriell effekt av phage cocktails kan påvirkes av phage genera og kombinasjon, målrettede bakteriestammer, mangfoldet av infeksjon, temperatur og tid. For å formulere en phage cocktail med overlegen effekt, var den foreslåtte metoden systematisk å evaluere effektiviteten av individuelle phages og phage cocktails i å drepe matbårne bakterielle patogener under målrettede forhold. Bakteriell drapseffekt ble overvåket ved å måle optisk tetthet ved ønskede temperaturer og varigheter. Overlegen fôreffekt ble bestemt ved fullstendig hemming av bakterievekst. Den foreslåtte metoden er en robust, evidensbasert tilnærming for å lette formulering av phage cocktails med overlegen antibakteriell effekt.

Etter protokollen ble det utført en sammenligning av anti-O157 phage-effekten med ulike phage-kombinasjoner, temperaturer, tider og MOIer. Virkninger av inkubasjonstemperatur og -tider, MOIer, phages og bakteriestammer som brukes på å forbedre anti-E. coli O157-effekten, presenteres i tabell 1 (oddsforholdstabell)9. Prosentandelen (%) av optisk turbiditetsmåling ≤ 0,01 ga ble analysert av hvert fôrpreparat under hver eksperimentell tilstand. Basert på denne analysen ble effekten av anti-O157-phage maksimert etter 14, 16 eller 18 t inkubasjon ved 22 °C (P < 0,001) og MOI = 1000 (P < 0,001), med henholdsvis 75 % og 89 % av veksten av phagebehandlet kultur. Generelt, blant 11 phagepreparater, var en cocktail av T1, T4 og rV5 mest effektiv (P < 0,05) mot O157. I tillegg varierte på tvers av inkubasjonstemperaturer, tider, MOIer og phages testet, følsomheten for phages varierte, med O157-stammer testet med belastning CO281-31N som mest følsomme (P < 0,001) og 3081 (P < 0,001) er minst følsomme for phages.
For å forstå phage-drepende kinetikken til hver bakteriestamme som ble testet, ble OD600-verdien plottet mot hver prøvetakingstid, MOIer og fôrbehandling ved hver inkubasjonstemperatur. Representative resultater fra effekten av phages mot E. coli O157 3081 ved 37 °C er vist i figur 2. Det sikres at vekstkurven for phagefri kontrollkultur er normal før man vurderer hemming av vekstkurven til phagebehandlet kultur. Ifølge figur 2 hemmet inkluderingen av T4 fullstendig bakterievekst ved 37 °C, ved hver prøvetid ved en MOI så lav som 1. For å oversikt over hvordan phage hemmet bakterievekst over tid ved ulike temperaturer, uavhengig av MOIer, ble gjennomsnittlig OD600nm-verdi i gjennomsnitt fra alle MOI-ene (MOI > 0) plottet mot hver prøvetakingstid og fôrbehandling (figur 3). Sammenlignet med 37 °C ble særlig fôrdrepingseffekt, for eksempel phages T4 og T1 + T4, forbedret over 22 °C. En annen tilnærming for å oppsummere og sammenligne generell anti-O157-effektivitet blant phages er vist i tabell 2 og tabell 39. OD600-verdien ble gjennomsnittet fra hver prøvetid og MOI og rangerte phage-effekt fra høyeste (A) til laveste (F: 37 °C og D: 22 °C). Denne tabellen letter identifiseringen av den beste phage-behandlingen. For eksempel, for stamme 3081, var phages T4 og T5 + T4 (Panel A) den mest effektive behandlingen ved 37 °C, mens i tillegg til phage T4 var phages T1 + T4, T1 + T4 + rV5 og 4 phage cocktails (Panel A) den mest effektive behandlingen ved 22 °C.
Denne protokollen gjorde det også mulig for oss å sammenligne phage effekt mot ulike bakteriestammer målrettet og tilpasse phage forberedelse. For eksempel, når du velger phages, ved 37 °C, unntatt stamme 3081, hadde phage T1 + T4 + rV5 den viktigste effektiviteten mot alle andre stammer, uavhengig av phage-typer. Ved 22 °C var 4-phage cocktail den mest effektive mot alle stammer som ble testet. De beste MOIene resulterte i fullstendig lysis (OD600 ≤ 0,01), som garanterte potensiell overlegen effekt under eksperimentelle forhold (tabell 2 og tabell 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg"> Figur 1: Foreslått oppsett av 96-brønns mikroplateanalyse. Serielle 10 ganger fortynning av hver phage fremstilles i kolonne 1-8 av sterile 96-brønns mikroplater. Fire phages mot en bakteriestamme kan testes i duplikat, i tilstøtende kolonner, på hver plate. De gjenværende kolonnene er for kontroller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg"> Figur 2: Vekstkurver av E. coli O157 stamme 3081 ved 37 °C behandlet og ikke behandlet med phages ved hver MOIs. Dataene ble samlet fra to uavhengige forsøk. Stolper presenterer standardavvik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg"> Figur 3: Vekstkurver av E. coli O157 stamme 3081 stammer. (A) Vekstkurver ved 37 °C. (B) Vekstkurver ved 22 °C. Hver kurve representerer individuelle og blandede kulturer, behandlet og ikke behandlet med phages på tvers av MOIer. Dataene ble samlet fra to uavhengige forsøk. Stolper presenterer standardfeilen for gjennomsnittet (tilpasset fra Referanse9 med tillatelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: Oddsforhold som sammenligner sannsynligheten for overlegen phage-effekt mot E. coli O157 ved inkubasjonstemperaturer, inkubasjonstider, MOIer, phages og stammer av E. coli O157 (tilpasset fra Referanse9 med tillatelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank"></a>
Tabell 2: Generell phage effekt mot E. coli O157 ved 37 °C (tilpasset fra Referanse9 med tillatelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 3: Generell phage effekt mot E. coli O157 ved 22 °C (tilpasset fra Referanse9 med tillatelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende tall 1-11: Øyeblikksbilder av mikroplateleserens drift og prosedyrer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

Denne protokollen beskriver en robust metode for bruk av høy gjennomstrømningsinnstillinger for å screene den antibakterielle effekten av bakteriofage cocktailer.

Bakteriofage effektivitet for biokontroll av matbårne patogener evaluert via innstillinger for høy gjennomstrømning

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

Denne enkle å utføre protokollen evaluerer den antibakterielle effekten av forskjellige bakteriofagekombinasjoner, også kjent som phage cocktails, under varierende forhold i en høy gjennomstrømningsinnstilling. De viktigste fordelene ved teknikken er evnen til å streame forskjellige biotiske og abiotiske faktorer, for eksempel temperatur, som kan påvirke phage-effekten under en rekke miljøforhold. Denne metoden kan lette utformingen av passende phage cocktails for å forbedre biokontroll og terapeutiske resultater og bestemme samspillet mellom bakterielle verter og bakteriofager.Til å begynne med må du sette opp mikroplateanalysen ved hjelp av filtrerte spisser for å unngå krysskontaminering. Tilsett først 180 mikroliter mTSB i brønnene i kolonne 1 til 12 av mikroplaten på 96 brønner, og forbered deretter serielle tenfoldfortynninger av hver phage i kolonne en til åtte av de sterile 96-brønns mikroplatene for å sette opp analysen. Tilsett 20 mikroliter individuelle phages eller phage cocktails til brønner en til åtte av den øverste raden A av mikroplaten.For phage-fri og blank kontroll, legg til 20 mikroliter mTSB til toppbrønnen i kolonne ni til 12. Under pipettering blander du brønninnholdet med mild og gjentatt aspirasjon minst fem ganger og skifter spisser mellom fortynning. Fjern 20 mikroliter fra siste rad H, og sett deretter opp et reservoar for den testede bakteriestammen ved å overføre to til tre milliliter av den fortynnede kulturen inn i reservoaret ved hjelp av en en milliliter pipette.Bruk en flerkanals pipette, tilsett 20 mikroliter av den fortynnede bakteriekulturen til hver brønn i kolonne en til 10 mens du endrer tips mellom hvert tillegg. Dekk og inkuber mikroplaten ved 37 grader Celsius. Ved to timers mellomrom fjerner du mikroplaten fra inkubatoren og leser platen ved hjelp av en mikroplateleser.Alternativt kan du inkubere platen i en mikroplateleser og lese den over tid. For å undersøke den optiske tettheten ved 600 nanometer ved hjelp av en mikroplateleser, åpne programmet på en mikroplateleser. Velg Enkel modus i vinduet for oppstartsalternativer, og velg deretter Opprett en ny protokoll i Oppgavebehandling.I vinduet Velg platetype velger du 96-brønnsplate fra rullegardinlisten. Som gjenkjenningsmetode velger du Absorbans for lesetypen, velger Endepunkt/kinetisk alternativ for optikktype, velger Monokromoatorer og klikker deretter OK. For Lesetrinn skriver du inn 600 nanometer for bølgelengder, velger Normal for lesehastighet og klikker OK.To stiller inn temperaturen for analysen, klikker inkuberingsboksen og velger Inkubator On.Enter ønsket temperatur i temperaturboksen og klikker deretter OK. Klikk på Forvarming før du fortsetter med neste trinn for 37 grader Celsius inkubasjonstemperatur, selv om alternativet ikke er nødvendig for testforholdene ved 22 grader Celsius. Hvis du vil unngå kondens på platelokket under inkubasjon, angir du temperaturgradienten ved å skrive inn en verdi i graderingsboksen og klikker OK. Deretter klikker du på Kinetic-avmerkingsboksen for å åpne kinetisk oppsett.Still inn operasjonstiden for 10 timer for 37 grader Celsius inkubasjon eller 22 timer for romtemperatur og angi to timer som leseintervall, og klikk deretter på OK. Klikk på Shake-avmerkingsboksen i prosedyrevinduet for å sette opp ristetilstanden, om nødvendig for hver kinetisk lesing. Velg Lineær som ristemodus, og endre varighet til 30 sekunder. Sett Linear Frequency-verdien til 731 sykluser per minutt, og klikk deretter på OK.In vinduet Protokollsammendragsdialog, klikk på Plateoppsett, velg Emner, Analysekontroller og Eksempler, og klikk Neste.Etter å ha definert innstillingene for hver brønntype, klikker du på Fullfør. Velg en brønn-ID i venstre grensesnitt, tilordne den til matrisen som vises i Plateoppsett-vinduet, og klikk deretter på OK. Klikk på Les plate-knappen, lagre protokollen som en prt-fil og klikk på Lagre. Sett inn platen og klikk på OK. Når eksperimentet er fullført, lagrer du eksperimentet som en xpt-fil og klikker på Lagre.Eksporter dataene til Excel ved å klikke Ja-knappen i meldingsvinduboksen for videre analyse. Klikk på Lagre Ja / Nei-valget, og ikke spør igjen for å lagre preferansen. Etter protokollen ble det utført en sammenligning av phage-effekt med ulike phage-kombinasjoner, temperaturer, tider og mangfold av infeksjoner, eller MOIer.Basert på denne analysen ble anti-O157 phage-effekten maksimert etter 14, 16 eller 18 timers inkubasjon ved 22 grader Celsius. For å forstå phage-drepende kinetikk av bakterier, ble OD-verdier ved 600 nanometer plottet mot prøvetakingstid, MOIer og fôrbehandling. De representative bakterievekstkurvene ved 37 grader Celsius behandlet vises.T4 hemmet fullstendig bakterieveksten ved hver prøvetakingstid selv ved lav MOI. For å analysere phage hemmet bakterievekst, ble de gjennomsnittlige OD-verdiene fra alle MOIene plottet mot hver prøvetid og fôrbehandling. De representative grafene ved to temperaturer viste at phage drap effekt, for eksempel, for T1 pluss T4 ble forbedret på 22 grader Celsius sammenlignet med 37 grader Celsius.Sammenligningen av generell phage effektivitet er vist, noe som letter å identifisere den beste fasebehandlingen. For eksempel, for Escherichia coli stamme 3081, behandling med phages T4 og T5 pluss T4 var den mest effektive behandlingen ved 37 grader Celsius. Men ved 22 grader Celsius, i tillegg til T4, phage T1 pluss T4, T1 pluss T4 pluss rV5, og fire phage cocktails var effektive.Når du utfører denne prosedyren, er ekstremt nøyaktig pipettering, spesielt når du bruker en flerkanals pipette og ensartethet av tilnærming avgjørende for å oppnå sammenlignbare og tolkelige resultater. Oppfølgingseksperimenter er nødvendig for å vurdere den videre ytelsen til den mest innflytelsesrike cocktailen i screeningen, og forhindre fremveksten av antiphage mutanter i et omfattende buljongkultursystem og andre biologiske matriser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Høy gjennomstrømming encellede Cytotoksisitet analysen for T celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Høy gjennomstrømning Fluorometrisk Teknikk for Vurdering av Macrophage Fagocytose og Actin Polymerisering

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Høy throughput Gene Tagging i<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Høy throughput Påvisning av respiratoriske patogener i dyr eksemplarer av nanoskala PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En fluorescens-basert lymfocyttkontroll analyse Egnet for høy gjennomstrømming screening av små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høy gjennomstrømming Shigella-spesifikke bakteriedrepende analysen

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...