Name: bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

Это исследование было поддержано Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), Канадским фондом инноваций (проект No 38710) и Крупным инновационным фондом Альберты. Мы благодарим д-ра Джона Кастелича за редактирование рукописи.

1. Подготовка буфера и реагентов
<ol><li>Внесите 500 мл триптического соевого бульона (TSB) (15 г порошка TSB и 500 мл сверхчистой воды) и автоклав. ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить при комнатной температуре до 3 месяцев или при 4 °C до 6 месяцев.</li>
	<li>Сделайте 500 мл триптического соевого агара (TSA) (20 г порошка TSA и 500 мл сверхчистой воды) и автоклав. ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев.</li>
	<li>Сделайте 500 мл фосфатного буферизованного физиологического раствора (PBS; 4 г NaCl, 0,1 г KCl, 0,77 г Na2HPO4 и 0,12 г KH2PO4, 500 мл сверхчистой воды), измерьте и отрегулируйте рН до 7,2 ± 0,2 при 25 °C и автоклаве. ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.</li>
	<li>Сделать 200 мл 1 M MgSO4 (49,294 г и 200 мл сверхчистой воды) и стерилизовать через фильтр полиэфирсульфона 0,22 мкм.</li>
	<li>Сделать 500 мл БСЭ с 10 мМ MgSO4 (mTSB; 15 г порошка TSB, 500 мл сверхчистой воды и 5 мл 1 M MgSO4) и автоклавом; дайте автоклавной среде остыть до комнатной температуры. Примените асептическую технику. Используя серологическую пипетку, осторожно переложить 5,0 мл 1 М MgSO4; осторожно закрутите, чтобы перемешать.</li>
</ol>2. Подготовка бактериальной культуры
<ol><li>Чтобы подготовить бактериальную исследовательскую лабораторную культуру (BRLC), удалите флакон (флаконы) с глицериновым запасом из морозильной камеры и передайте в лабораторию.</li>
	<li>Используйте одноразовую петлю для прививки или эквивалент, окуните во флакон, удалите соскоб инокулята (замороженной слякоти) и нанесите полосу на пластину TSA или эквивалент в шкафу биологической безопасности уровня II. Инкубируют пластину при 37 ± 2 °C в течение 15−18 ч.</li>
	<li>Упакованные пластины BRLC можно упаковать и хранить при температуре 4 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Общий срок действия BRLC: 14 дней при 4 °C после генерации.</li>
	<li>Инокулируют одну колонию каждого штамма E. coli O157 из пластин BRLC для тестирования в 10 мл TSB и статически инкубируют при 37 °C в течение 18 ч до достижения 9 log10 КОЕ/мл.</li>
	<li>Подготовьте серийное разведение ночных культур (на следующее утро) каждого штамма E. coli O157 с использованием mTSB, содержащего 10 мМ MgSO4 , для достижения 4-5 log10 КОЕ/мл (или другого желаемого уровня инокулята).</li>
	<li>Смешайте равный объем ночной культуры каждого штамма для получения 4-5 log10 КОЕ/мл в общей сложности (или по желанию) для приготовления бактериальной смеси.</li>
	<li>Немедленно поместите разбавленную бактериальную культуру при 4 °C для ожидающего использования.</li>
	<li>Разбавляют культуру инокулята в 10 или 100 раз и пластину 0,1 мл аликвот этих разведений на пластинах TSA для получения изолированных колоний.</li>
</ol>3. Приготовление фаговых рабочих растворов
<ol><li>Размножайте высокотитерные рабочие запасы для каждого фага, подлежащего скринингу (≥108 PFU/мл), следуя стандартным методам4. ПРИМЕЧАНИЕ: Общий срок годности фаговых запасов составляет 3 месяца в пластиковой бутылке при 4 °C после генерации.</li>
	<li>Для достижения желаемого титра, например, ~108 ПФЕ/мл для кинетики лизиса, разбавляют отдельные фаговые препараты mTSB, содержащим 10 мМ MgSO4. Готовьте фаговые коктейли, смешивая равные объемы каждого рабочего материала с одним и тем же титром во всех возможных комбинациях.</li>
</ol>4. Подготовка кинетики лизиса in vitro для отдельных фаговых и фаговых коктейлей
<ol><li>Подготовьте серийные 10-кратные разведения каждого фага в колонках 1-8 в стерильных 96-луночных микропластинах для настройки микропластинчатого анализа. ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре фага против одного бактериального штамма могут быть протестированы в двух экземплярах, в соседних колонках, на каждой пластине. Остальные четыре столбца предназначены для элементов управления, которые не имеют фагов, а также mTSB blank (рисунок 1).</li>
	<li>Поместите 180 мкл mTSB в скважины от колонн 1 до 12 микропластины из 96 скважин.</li>
	<li>Добавьте 20 мкл разбавленных отдельных фагов или фаговых коктейлей (~108 ПФЕ/мл) в лунки 1-8 верхнего ряда микропластины (ряд А).</li>
	<li>Для элемента управления без фагов и Blank добавьте 20 мКЛ mTSB в верхнюю скважину столбцов 9, 10 и 11.</li>
	<li>С помощью 12-канальной пипетки разбавьте пластину. Перенос 20 мкл из строки в строку. Перемешайте содержимое лунки путем мягкой, многократной аспирации, выброса (не менее пяти раз) и смены кончиков между разведениями. Удалите 20 мкл из последней строки (строка H). ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать наконечники с фильтрами для предотвращения перекрестного загрязнения.</li>
	<li>Установите резервуар для каждого штамма, используйте пипетку 1 мл для переноса 2-3 мл разбавленной культуры в резервуар. Для колонн 1-10 используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 20 мкл разбавленной бактериальной культуры в каждую лунку. Меняйте подсказки между каждым добавлением.</li>
	<li>Накройте и инкубируйте микропластинку в желаемых условиях (например, 37 °C в течение 10 ч или 22 °C в течение 22 ч).</li>
	<li>Через 2 ч или через другие желаемые интервалы извлеките микропластины из инкубатора.</li>
</ol>5. Определение оптической плотности
<ol><li>Проверьте оптическую плотность при 600 нм (OD600 нм) с помощью считывателя микропластин. ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется настроить и сохранить протокол анализа в программе перед подготовкой тестовой пластины.</li>
	<li>Включите считыватель микропластин и откройте программу.</li>
	<li>Выберите Простой режим в окне Параметры запуска и выберите Создать новый протокол в диспетчере задач (Дополнительный рисунок 1a,b).</li>
	<li>В окне Выбор типа пластины выберите 96 Скважинная плита из раскрывающегося списка (Дополнительный рисунок 2).</li>
	<li>Выберите «Поглощение » для метода обнаружения, параметр «Конечная точка/кинетическая» для типа считывания и «Монохроматоры» для типа оптики. Нажмите OK (Дополнительный рисунок 3).</li>
	<li>В поле Шаг чтения введите 600 нм для длин волн и выберите Нормальный для скорости чтения. Нажмите OK (дополнительный рисунок 4).</li>
	<li>Чтобы установить температуру для анализа, установите флажок Инкубация и выберите Инкубатор Вкл. Введите желаемую температуру в поле Температура . Нажмите OK. Чтобы предотвратить конденсацию на крышке пластины во время инкубации, установите градиент температуры, введя значение (1-3) в поле «Градиент ». Нажмите OK (дополнительный рисунок 5a). ПРИМЕЧАНИЕ: Установите флажок Предварительный нагрев перед продолжением следующего шага для температуры инкубации 37 °C. Этот шаг не требуется для условий испытания при 22 °C (RT).</li>
	<li>Затем установите флажок Kinetic , чтобы открыть Kinetic Setup. Установите время работы в течение 10 ч для инкубации при температуре 37 °C или 22 ч для RT. Введите 2 ч для интервала считывания. Нажмите OK (дополнительный рисунок 5b).</li>
	<li>Установите флажок Встряхнуть в окне Процедура , чтобы при необходимости настроить состояние встряхивания для каждого кинетического считывания (дополнительный рисунок 6a).</li>
	<li>Выберите Линейный для режимов встряхивания и измените длительность на 30 с. Установите значение линейной частоты равным 731 cpm (2 мм), а затем нажмите OK (дополнительный рисунок 6b).</li>
	<li>В диалоговом окне «Сводка протокола» щелкните «Макет пластины» и выберите «Пробелы», «Элементы управления анализом» и «Образцы». Нажмите далее (дополнительный рисунок 7). ПРИМЕЧАНИЕ: Введите 1 в число различных типов элементов управления для отрицательного элемента управления.</li>
	<li>После определения настроек для каждого типа скважины нажмите кнопку Готово.</li>
	<li>Выберите идентификатор скважины в левом интерфейсе, а затем назначьте его матрице, показанной в макете пластины вдовы. Нажмите OK (дополнительный рисунок 8).</li>
	<li>Нажмите кнопку Read Plate , сохраните протокол в виде файла .prt и нажмите Save (Дополнительный рисунок 9).</li>
	<li>Вставьте пластину и нажмите OK.</li>
	<li>После завершения эксперимента сохраните эксперимент в виде файла .xpt и нажмите кнопку Сохранить (дополнительный рисунок 10).</li>
	<li>Экспортируйте данные в Excel, нажав на кнопку Yes в окне окна сообщения для дальнейшего анализа (дополнительный рисунок 11).</li>
	<li>Нажмите на выбор Сохранить Да/Нет и флажок Не спрашивать снова , чтобы сохранить настройки.</li>
</ol>6. Анализ данных
<ol><li>Повторите по крайней мере два независимых эксперимента, как описано выше. Соберите результаты всех независимых испытаний. Рассчитайте среднее и стандартное отклонение OD600 от каждой обработанной фагом и свободной от фагов культуры.</li>
	<li>Выполните квадратный корень из значений OD при 600 нм и проанализируйте их, используя соответствующую статистическую модель для каждого бактериального штамма и температуры. ПРИМЕЧАНИЕ: Для программного обеспечения SAS выбирается модель MIXED и наименьшие квадраты для дифференциации средних (P < 0,05). Для каждого штамма назначают панели A−G для каждой фаговой обработки, общая эффективность анти-O157 во времени и MOI различалась (P < 0,05).</li>
	<li>Определить превосходную эффективность фагов на основе значения OD600 нм ≤ 0,01, соответствующего отсутствию обнаруживаемого роста бактерий (предел обнаружения: 300 КОЕ/мл).<ol>
<li>Анализ влияния времени, температуры инкубации, штаммов E. coli O157, MOI и типов фагов на эффективность фагов с использованием соответствующей статистической модели. ПРИМЕЧАНИЕ: Для программного обеспечения SAS используйте GLIMMIX со случайными мерами.</li>
		<li>Рассчитайте коэффициенты шансов, чтобы сравнить превосходную эффективность для различных экологических и биологических факторов, представляющих интерес.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections.">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li><li>Czaplewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+antibiotics-a+pipeline+portfolio+review.">Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).</li><li>Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+therapy+in+bacterial+infections+treatment:+one+hundred+years+after+the+discovery+of+bacteriophages.">Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Escherichia+coli+O157+on+beef+at+37,+22+and+4&#176;C+by+T5-,+T1-,+T4-and+O1-like+bacteriophages.">Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4&#176;C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages.</a> Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).</li><li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing.">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), (2018).</li><li>Ly-Chatain, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factors+affecting+effectiveness+of+treatment+in+phages+therapy.">The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy.</a> Frontiers in Microbiololgy. 5, 51 (2014).</li><li>Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-based+biocontrol+strategies+and+their+application+in+agriculture+and+aquaculture.">Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).</li><li>Bourdin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coverage+of+diarrhoea-associated+Escherichia+coli+isolates+from+different+origins+with+two+types+of+phage+cocktails.">Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails.</a> Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).</li><li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+individual+bacteriophages+does+not+predict+efficacy+of+bacteriophage+cocktails+for+control+of+Escherichia+coli+O157.">Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157.</a> Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712 (2021).</li><li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+bacteriophage+T5virus+on+growth+of+Shiga+toxigenic+Escherichia+coli+and+Salmonella+strains+in+individual+and+mixed+cultures.">Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures.</a> Virology Journal. 17, 3 (2020).</li><li>Br&#252;ssow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+needed+for+phage+therapy+to+become+a+reality+in+Western+medicine.">What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine.</a> Virology. 434 (2), 138-142 (2012).</li><li>Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+cocktails+and+the+future+of+phage+therapy.">Phage cocktails and the future of phage therapy.</a> Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).</li><li>Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+therapy:+developments+and+directions.">Bacteriophage therapy: developments and directions.</a> Antibiotics. 9 (3), 135 (2020).</li><li>Niu, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+range+and+lytic+capability+of+four+bacteriophages+against+bovine+and+clinical+human+isolates+of+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli+O157:H7.">Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).</li></ol>

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Этот протокол описывал надежный подход к системной оценке эффективности фагов против патогенов пищевого происхождения, включая STEC9 и Salmonella10. Одним из важнейших шагов является разбавление ночной культуры бактерий, использование предварительно охлажденной среды и манипулирование разбавлением с помощью ведра со льдом рекомендуются для минимизации потенциального роста бактерий. Кроме того, разбавление фагов готовили перед разбавлением бактериальной культуры. На этапе перечисления 2.8 были приведены фактические количества бактериального инокулята для расчета конечного примененного МВД. Для приготовления фагов обычно используют сырые фаговые лизаты, приготовленные фильтрующим фагом, инфицированным через 4-6 ч бактериальной культуры. Критическим шагом, связанным с инфекционностью фагов, всегда является использование фаговых рабочих запасов, подготовленных в течение 3 месяцев. Чрезвычайно точное пипетирование (особенно при использовании многоканальной пипетки) и единообразие подхода также имеют важное значение для получения сопоставимых и интерпретируемых результатов. Модифицированный TSB, дополненный 10 мМ Mg2+, использовали для разбавления фагов, бактериальной культуры и базовой среды для оптимизации адсорбции и инфицирования фагов.
Поскольку бактерии размножаются во время фазы бревна, даже ниже температуры инкубатора, рекомендуется использовать разбавленную ночную культуру вместо культуры логарифмической фазы, чтобы свести к минимуму потенциальный рост бактерий.
Предлагаемый протокол имеет ограничения. Во-первых, поскольку микропластина может вместить только 200 мкл, длительная инкубация может вызвать значительное испарение и не рекомендуется. В этом случае анализ может не подходить для медленно растущих бактерий. Во-вторых, предложенный протокол не смог контролировать амплификацию фагов. В-третьих, этот протокол не мог контролировать развитие устойчивости к фагам с течением времени, что является критическим фактором, определяющим исход лечения фагами11,12. Необходимы последующие эксперименты для оценки дальнейшей эффективности наиболее влиятельного коктейля в скрининге в предотвращении появления антифаговых мутантов в обширной системе бульонных культур и других биологических матрицах.
В отличие от обычных противомикробных препаратов, биологическая природа фагов влияет на сложность биоконтроля и терапевтического использования в практических условиях. Условно рациональный подбор фаговых коктейлей в первую очередь основывается на литической активности и хозяине диапазона фагов. Часто рекомендуются фаговые кандидаты с самой сильной литической активностью и самым широким диапазоном хозяев13,14. Однако, основываясь на текущем исследовании, фаги, такие как rV5 и T1, хотя сами по себе не такие вирулентные, как T4 и T5, значительно облегчали общий результат биоконтроля в сочетании с T4 и / или T5. Следовательно, для достижения превосходной эффективности фаговых коктейлей рекомендуется системный скрининг антибактериальной активности потенциальных комбинаций фагов против целевых штаммов хозяина в желаемых условиях окружающей среды. Кроме того, определение рецепторов для фаговых кандидатов и включение фагов с различными рецепторами может предотвратить конкуренцию за прикрепление хозяина, помешать быстрому развитию антифаговых мутантов и улучшить результаты биоконтроля13.
Этот метод позволил точно количественно оценить кинетику фагового лизиса в формате с высокой пропускной способностью. Кроме того, это позволило систематизировать оценку различных биологических и экологических факторов антибактериальной эффективности ассортимента фагов, тем самым облегчая формулирование фаговых коктейлей с оптимизированными результатами. Предполагается, что будущие применения и развитие метода будут включать в себя мониторинг in situ эффективности каждого фага в фаговых коктейлях путем флуоресцентной маркировки фагов. В дополнение к предлагаемому протоколу, понимание генетических детерминант, которые способствуют синергетическим и облегченным эффектам между фагами при совместном заражении одного хозяина, облегчит разработку соответствующих фаговых коктейлей с превосходной эффективностью.

Бактериофаги (фаги) – это вирусы, которые естественным образом вторгаются в бактериальные клетки, нарушая бактериальный метаболизм и вызывая лизис бактерии. В отличие от обычных противомикробных препаратов (например, антибиотиков), спектры фаговых хозяев относительно узки, способны заражать только целевой набор бактериальных видов или штаммов и, таким образом, должны минимизировать побочные эффекты на микробиоту, которые приносят пользу здоровью животных и человека. С ростом устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) фаги и их производные приводят к созданию альтернативных противомикробных препаратов для борьбы с бактериальными инфекционными заболеваниями, включая бактериальные инфекции УПП у людей и животных1,2. Фаги обладают подтвержденным терапевтическим потенциалом в отношении бактериальных возбудителей >20, вызывающих поверхностные инфекции и инфекции верхних дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта человека3.
В сельскохозяйственных условиях стратегия биоконтроля на основе фагов заключается в терапевтическом использовании фагов для контроля бактериальных патогенов. Биоконтроль фагов хорошо принят как зеленая технология, эффективная при дезактивации патогенов пищевого происхождения (например, шига-токсин, продуцирующих Escherichia coli (STEC), сальмонелл и листерий) в различных продуктах питания4,5. Кроме того, фаги могут использоваться в качестве дезинфицирующих средств для дезинфекции поверхностей пищевой промышленности и шкур животных, которые могут быть интегрированы в обычные антимикробные системы (например, химические вещества, пар и пастеризация горячей водой) для улучшения желаемых результатов и снижения воздействия на окружающую среду. Использование фагов для уменьшения зоонозных бактерий у животных также является перспективным1. Тем не менее, существует необходимость в решении технических проблем для улучшения результатов подхода к биоконтролю фагов, который будет широко применяться в различных системах производства продуктов питания. Основной проблемой является снижение эффективности фагов из-за развития устойчивых к бактериям мутантов5 и изменения бактериальной физиологии из-за воздействия стрессоров окружающей среды6.
Для минимизации риска устойчивости к фагам предложены фаговые коктейли (т.е. комбинация нескольких фагов), которые улучшают эффективность биоконтроля в сельском хозяйстве и аквакультуре7. Однако из нескольких исследований было доказано, что фаговые коктейли не всегда предлагали лучшую эффективность, чем введение одного фага. Например, коктейль из 3 Т4-подобных фагов имел более узкий диапазон хозяев против штаммов E. coli8. Кроме того, AKFV33, член Теквинтавируса, имел большую эффективность, чем коктейль из четырех фагов, в удалении E. coli O157 из говядины, несмотря на применяемые температуры инкубации4. Недавно сообщалось, что эффективность отдельных фагов не предсказывает эффективность фаговых коктейлей для контроля O1579, поскольку взаимодействия между несколькими фагами могут изменять эффективность. Самое главное, что многочисленные факторы, такие как роды и комбинации фагов, целевые штаммы и MOI, а также температуры и время инкубации, могут влиять на взаимодействие между фагами. Поэтому тщательный скрининг комбинаций фагов против конкретных бактерий для оценки синергизма или облегчения фагов или, по крайней мере, для обеспечения минимального антагонизма фагов в конкретных условиях окружающей среды жизненно важен для оптимальных результатов. Здесь описан метод систематической оценки эффективности различных комбинаций фагов против патогенов пищевого происхождения в различных условиях окружающей среды. Преимущество этого подхода заключается в том, чтобы обеспечить скрининг всех возможных биотических и абиотических факторов, которые, по прогнозам, повлияют на антибактериальную эффективность фагов в естественных условиях. В протоколе в качестве примера используются STEC O157 и их заражающие фаги.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essential supplies, reagents, and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374361</td>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Diameter: 100 mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17013808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips RT LTS 1000&#181;L FL 768A/8-low retention</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 20&#181;L F 960A/5</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 300&#181;L 768A/4</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005867</td>
			<td>no filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>168055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar (TSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105458-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105459-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Shaped Cell Spreaders</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76299-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Microbiological Incubators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50125590H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer Hotplates</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-889-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon Stir Bars</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>14-512-125</td>
			<td>length: 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BTNEO2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>9.4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings

Бактериальные патогены постоянно бросают вызов системам безопасности пищевых продуктов во всем мире. В связи с растущей обеспокоенностью по поводу появления устойчивых к теплу и дезинфицирующим средствам бактерий срочно необходимы новые антибактериальные средства. Стратегия биоконтроля на основе бактериофагов заключается в терапевтическом использовании фагов для контроля бактериальных патогенов в сельскохозяйственных условиях. Биоконтроль фагов все чаще принимается в качестве устойчивой технологии, эффективной для дезактивации патогенов пищевого происхождения. Для обеспечения эффективных результатов биоконтроля решающее значение имеет систематический скрининг комбинаций фагов против целевых бактерий в требуемых условиях окружающей среды. На антибактериальную эффективность фаговых коктейлей могут влиять роды и комбинации фагов, целевые бактериальные штаммы, множественность инфекции, температура и время. Чтобы сформулировать фаговый коктейль с превосходной эффективностью, предложенный метод заключался в систематической оценке эффективности отдельных фагов и фаговых коктейлей в уничтожении пищевых бактериальных патогенов в целевых условиях. Эффективность уничтожения бактерий контролировали путем измерения оптической плотности при желаемых температурах и продолжительности. Превосходная фаговая эффективность определялась полным ингибированием роста бактерий. Предлагаемый метод представляет собой надежный, основанный на фактических данных подход к облегчению формулирования фаговых коктейлей с превосходной антибактериальной эффективностью.

По протоколу было проведено сравнение эффективности фагов анти-O157 с различными комбинациями фагов, температурами, временем и MOI. Влияние температуры и времени инкубации, MOI, фагов и бактериальных штаммов, используемых для повышения эффективности анти-E. coli O157, представлено в таблице 1 (таблица отношения шансов)9. Процент (%) измерения оптической мутности ≤ 0,01 было проанализировано каждым фаговым препаратом при каждом экспериментальном условии. Основываясь на этом анализе, эффективность фагов анти-O157 была максимизирована после 14, 16 или 18 ч инкубации при 22 °C (P < 0,001) и MOI = 1000 (P < 0,001), при этом 75% и 89% роста культуры, обработанной фагами, были полностью ингибированы соответственно. В целом, среди 11 фаговых препаратов коктейль из T1, T4 и rV5 был наиболее эффективен (P < 0,05) против O157. Кроме того, в зависимости от температуры инкубации, времени, MOI и протестированных фагов чувствительность к фагам варьировалась, причем штаммы O157, протестированные со штаммами CO281-31N, были наиболее чувствительными (P < 0,001) и 3081 (P < 0,001), которые были наименее чувствительны к фагам.
Для понимания кинетики уничтожения фагов каждого тестируемого бактериального штамма значение OD600 было построено по каждому времени отбора проб, MOI и обработке фагов при каждой температуре инкубации. Репрезентативные результаты эффективности фагов в отношении E. coli O157 3081 при 37 °C показаны на фиг.2. Гарантируется, что кривая роста бесфаговой контрольной культуры является нормальной до оценки ингибирования кривой роста культуры, обработанной фагами. Согласно рисунку 2, включение Т4 полностью ингибировало рост бактерий при 37 °C, при каждом времени отбора проб при MOI всего 1. Чтобы увидеть, как фаг ингибировал рост бактерий с течением времени при различных температурах, независимо от MOI, среднее значение OD600 нм, усредненное по всем MOI (MOI > 0), было построено по каждому времени отбора проб и обработке фагом (рисунок 3). По сравнению с 37 °C, особая эффективность уничтожения фагов, например, фагов T4 и T1 + T4, была повышена более чем на 22 °C. Другой подход к обобщению и сравнению общей эффективности анти-O157 среди фагов показан в таблице 2 и таблице 39. Значение OD600 усредняли за каждое время отбора проб и MOI и ранжировали эффективность фага от самого высокого (A) до самого низкого (F: 37 ° C и D: 22 ° C). Эта таблица облегчает определение наилучшего фагового лечения. Например, для штамма 3081 наиболее эффективным лечением были фаги Т4 и Т5 + Т4 (панель А), тогда как в дополнение к фагу Т4 наиболее эффективным лечением были фаги Т1 + Т4, Т1 + Т4 + rV5 и 4 фаговых коктейля (группа А) были наиболее эффективным лечением при 22 °C.
Этот протокол также позволил нам сравнить эффективность фагов против различных бактериальных штаммов, нацеленных на них, и настроить фаговой препарат. Например, при выборе фагов при 37 °C, исключая штамм 3081, фаг T1 + T4 + rV5 имел наиболее значительную эффективность против всех других штаммов, независимо от их типов фагов. При 22 °C коктейль из 4 фагов был наиболее эффективным против всех протестированных штаммов. Наилучшие MOI приводили к полному лизису (OD600 ≤ 0,01), что гарантировало потенциальную превосходную эффективность в экспериментальных условиях (таблица 2 и таблица 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg"> Рисунок 1: Предлагаемая компоновка анализа микропластин из 96 скважин. Серийные 10-кратные разведения каждого фага готовят в колонках 1-8 стерильных 96-луночных микропластин. Четыре фага против одного бактериального штамма могут быть протестированы в двух экземплярах, в соседних колонках, на каждой пластине. Остальные столбцы предназначены для элементов управления. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg"> Рисунок 2: Кривые роста штамма E. coli O157 3081 при 37 °C, обработанные и не обработанные фагами на каждом MOI. Данные были собраны из двух независимых испытаний. Бары представляют стандартное отклонение. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg"> Рисунок 3: Кривые роста штамма E. coli O157 штамма 3081. (A) Кривые роста при 37 °C. (B) Кривые роста при 22 °C. Каждая кривая представляет отдельные и смешанные культуры, обработанные и не обработанные фагами через MOI. Данные были собраны из двух независимых испытаний. Столбцы представляют стандартную погрешность среднего значения (адаптировано из Reference9 с разрешения). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1: Отношение шансов, сравнивающее вероятность повышения эффективности фагов с E. coli O157 при температурах инкубации, времени инкубации, MOI, фагах и штаммах E. coli O157 (адаптировано из Reference9 с разрешения). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 2: Общая эффективность фагов против E. coli O157 при 37 °C (адаптировано из Reference9 с разрешения). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 3: Общая эффективность фагов против E. coli O157 при 22 °C (адаптировано из Reference9 с разрешения). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Дополнительные рисунки 1-11: Снимки работы и процедур считывателя микропластин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

Этот протокол описывает надежный метод использования высокопроизводительных настроек для скрининга антибактериальной эффективности коктейлей бактериофагов.

Эффективность бактериофагов для биоконтроля патогенов пищевого происхождения, оцененная с помощью высокопроизводительных настроек

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

Этот простой в исполнении протокол оценивает антибактериальную эффективность различных комбинаций бактериофагов, также известных как фаговые коктейли, в различных условиях в условиях высокой пропускной способности. Основными преимуществами метода является способность передавать различные биотики и абиотические факторы, такие как температура, которые могут влиять на эффективность фагов в различных условиях окружающей среды. Этот метод может облегчить разработку соответствующих фаговых коктейлей для усиления биоконтроля и терапевтических результатов и определения взаимодействия между бактериальными хозяевами и бактериофагами.Для начала настройте анализ микропластины с использованием отфильтрованных наконечников, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Сначала добавляют 180 микролитров mTSB в колодцы колонн от одной до 12 из 96-луночной микропластины, затем готовят последовательные десятикратные разбавления каждого фага в колоннах от одной до восьми стерильных 96-луночных микропластин для настройки анализа. Добавьте 20 микролитров отдельных фагов или фаговых коктейлей в колодцы от одного до восьми верхнего ряда А микропластины.Для бесфагового и пустого контроля добавьте 20 микролитров mTSB в верхнюю скважину колонн с девяти до 12. Во время пипетки смешайте содержимое лунки с мягким и повторным аспирацией не менее пяти раз и меняйте наконечники между разведениями. Удалите 20 микролитров из последнего ряда H, затем создайте резервуар для испытуемого бактериального штамма, перенеся два-три миллилитра разбавленной культуры в резервуар с помощью одной миллилитровой пипетки.Используя многоканальную пипетку, добавьте 20 микролитров разбавленной бактериальной культуры в каждую лунку в колонках от одного до 10, меняя наконечники между каждым добавлением. Накройте и высиживайте микропластинку при температуре 37 градусов Цельсия. С интервалом в два часа извлеките микропластинку из инкубатора и считайте пластину с помощью считывателя микропластин.В качестве альтернативы, инкубируйте пластину в считывателе микропластин и считывайте ее с течением времени. Чтобы исследовать оптическую плотность на 600 нанометров с помощью считывателя микропластин, откройте программу на микропластинчатом считывателе. Выберите Простой режим в окне параметров запуска, а затем выберите Создать новый протокол в диспетчере задач.В окне Выбор типа пластины выберите из раскрывающегося списка пластину с 96 лунками. В качестве метода обнаружения выберите «Поглощение» для типа считывания, выберите параметр «Конечная точка/кинетическая точка» для типа оптики, выберите «Монохроматоры» и нажмите кнопку «ОК». В поле Шаг чтения введите 600 нанометров для длин волн, выберите Нормальный для скорости считывания и нажмите OK.To установить температуру для анализа, установите флажок Инкубатор и выберите Инкубатор вкл.Введите желаемую температуру в поле температуры, а затем нажмите кнопку ОК. Нажмите на флажок Предварительный нагрев, прежде чем продолжить следующий шаг для температуры инкубации 37 градусов по Цельсию, хотя опция не требуется для условий испытаний при 22 градусах Цельсия. Чтобы предотвратить конденсацию на крышке пластины во время инкубации, установите градиент температуры, введя значение в поле градиента и нажмите кнопку ОК. Затем установите флажок Кинетический, чтобы открыть кинетическую установку.Установите время выполнения на 10 часов для инкубации 37 градусов Цельсия или 22 часа для комнатной температуры и введите два часа в качестве интервала считывания, затем нажмите OK. Установите флажок Встряхнуть в окне процедуры, чтобы настроить условие встряхивания, если это необходимо для каждого кинетического чтения. Выберите Линейный режим в режиме встряхивания и измените длительность на 30 секунд. Установите значение линейной частоты равным 731 циклу в минуту, а затем щелкните OK.In диалоговом окне Сводка протокола, щелкните Макет пластины, выберите Пробелы, Элементы управления анализом и Образцы и нажмите кнопку Далее.После определения настроек для каждого типа скважины нажмите кнопку Готово. Выберите идентификатор скважины в левом интерфейсе, назначьте его матрице, показанной в окне «Макет пластины», затем нажмите «ОК». Нажмите кнопку Read Plate, сохраните протокол в виде prt-файла и нажмите «Сохранить». Вставьте пластину и нажмите OK. После завершения эксперимента сохраните его в виде файла xpt и нажмите кнопку Сохранить.Экспортируйте данные в Excel, нажав кнопку Да в окне окна сообщения для дальнейшего анализа. Нажмите на выбор Сохранить Да/Нет и установите флажок Не спрашивать снова, чтобы сохранить настройки. Следуя протоколу, было проведено сравнение эффективности фагов с различными комбинациями фагов, температурой, временем и множественностью инфекций или MOI.Основываясь на этом анализе, эффективность фагов анти-O157 была максимизирована после 14, 16 или 18 часов инкубации при 22 градусах Цельсия. Для понимания кинетики бактерий, убивающей фаги, значения OD на уровне 600 нанометров были построены по времени отбора проб, MOI и обработке фагов. Показаны репрезентативные кривые роста бактерий при 37 градусах Цельсия.T4 полностью ингибировал рост бактерий в каждый раз отбора проб даже при низком MOI. Чтобы проанализировать фаговы, ингибирующие рост бактерий, средние значения OD из всех MOI были построены по каждому времени отбора проб и обработке фагом. Репрезентативные графики при двух температурах показали, что эффективность уничтожения фагов, например, для T1 плюс T4 была повышена при 22 градусах Цельсия по сравнению с 37 градусами Цельсия.Показано сравнение общей эффективности фагов, что облегчает определение наилучшей фазы лечения. Например, для штамма Escherichia coli 3081 лечение фагами Т4 и Т5 плюс Т4 было наиболее эффективным лечением при 37 градусах Цельсия. Однако при 22 градусах Цельсия, в дополнение к Т4, фаг Т1 плюс Т4, Т1 плюс Т4 плюс rV5 и четыре фаговых коктейля были эффективными.При выполнении этой процедуры чрезвычайно точное пипетирование, особенно при использовании многоканальной пипетки, и единообразие подхода имеют важное значение для получения сопоставимых и интерпретируемых результатов. Последующие эксперименты необходимы для оценки дальнейшей эффективности наиболее влиятельного коктейля в скрининге, предотвращая появление антифаговых мутантов в обширной системе культивирования бульона и других биологических матрицах.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Высокая техника Пропускная Флуорометрический по оценке фагоцитоз макрофагов и полимеризации актина

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Высокая пропускная способность гена Tagging в<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Высок объём шигеллезом-конкретные бактерицидной Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...