Name: bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), la Fundación Canadiense para la Innovación (Proyecto # 38710) y major Innovation Fund, Alberta. Agradecemos al Dr. John Kastelic por editar el manuscrito.

1. Preparación de tampón y reactivos
<ol><li>Hacer 500 mL de caldo de soja tríptico (TSB) (15 g de TSB en polvo y 500 mL de agua ultrapura) y autoclave. NOTA: Esto se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 3 meses o a 4 °C durante un máximo de 6 meses.</li>
	<li>Hacer 500 mL de agar de soja tríptico (TSA) (20 g de polvo de TSA y 500 ml de agua ultrapura) y autoclave. NOTA: Esto se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.</li>
	<li>Hacer 500 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 4 g de NaCl, 0.1 g de KCl, 0.77 g de Na2HPO4 y 0.12 g de KH2PO4, 500 mL de agua ultrapura), medir y ajustar el pH a 7.2 ± 0.2 a 25 ° C y autoclave. NOTA: Se puede conservar a 4 °C durante un máximo de 6 meses.</li>
	<li>Hacer 200 mL de 1 M MgSO4 (49.294 g y 200 mL de agua ultrapura) y esterilizar mediante un filtro de polietersulfona de 0,22 μm.</li>
	<li>Hacer 500 mL de TSB con 10 mM MgSO4 (mTSB; 15 g de TSB en polvo, 500 mL de agua ultrapura y 5 mL de 1 M MgSO4) y autoclave; deje que el medio en autoclave se enfríe a temperatura ambiente. Aplicar la técnica aséptica. Usando una pipeta serológica, transfiera cuidadosamente 5.0 mL de 1 M MgSO4; girar suavemente para mezclar.</li>
</ol>2. Preparación del cultivo bacteriano
<ol><li>Para preparar el cultivo de laboratorio de investigación bacteriana (BRLC), retire los viales de glicerol del inventario del congelador y transfiéralos al laboratorio.</li>
	<li>Use un lazo de inoculación desechable o equivalente, sumerja en el vial, retire un raspado de inóculo (granizado congelado) y raye en una placa TSA o equivalente dentro de un gabinete de seguridad biológica de nivel II. Incubar la placa a 37 ± 2 °C durante 15−18 h.</li>
	<li>Embolse las placas BRLC preparadas y guárdelas a 4 °C. NOTA: Período de caducidad general para BRLC: 14 días a 4 °C después de la generación.</li>
	<li>Inocular una sola colonia de cada cepa de E. coli O157 de las placas BRLC para ser probada en 10 mL de TSB e incubar estáticamente a 37 °C durante 18 h para alcanzar 9 log10 UFC/mL.</li>
	<li>Prepare una dilución en serie de los cultivos nocturnos (a la mañana siguiente), cada cepa de E. coli O157 utilizando mTSB que contenga 10 mM de MgSO4 para lograr 4-5 log10 UFC / ml (u otro nivel de inóculo deseado).</li>
	<li>Mezcle un volumen igual de un cultivo nocturno de cada cepa para lograr 4-5 log10 UFC/ml en total (o según se desee) para preparar la mezcla bacteriana.</li>
	<li>Coloque inmediatamente el cultivo bacteriano diluido a 4 °C para su uso pendiente.</li>
	<li>Diluir el cultivo de inóculo 10 o 100 veces y envasar 0,1 mL alícuotas de estas diluciones en las placas TSA para obtener las colonias aisladas.</li>
</ol>3. Preparación de soluciones de trabajo de fagos
<ol><li>Propagar las existencias de trabajo de alto título para cada fago a cribar (≥108 PFU/ml) siguiendo los métodos estándar4. NOTA: El período de caducidad general para las existencias de fagos es de 3 meses en una botella de plástico a 4 °C después de la generación.</li>
	<li>Para lograr el título deseado de, por ejemplo, ~ 108 PFU / ml para la cinética de lisis, diluya las preparaciones de fagos individuales con mTSB que contenga 10 mM de MgSO4. Prepare cócteles de fagos mezclando volúmenes iguales de cada material de trabajo con el mismo título en todas las combinaciones posibles.</li>
</ol>4. Preparación de cinética de lisis in vitro para fagos individuales y cócteles de fagos
<ol><li>Prepare diluciones seriadas de 10 veces de cada fago en las columnas 1-8 en microplacas estériles de 96 pocillos para configurar el ensayo de microplacas. NOTA: Cuatro fagos contra una cepa bacteriana se pueden probar por duplicado, en columnas adyacentes, en cada placa. Las cuatro columnas restantes son para controles, que no tienen fagos, así como mTSB en blanco (Figura 1).</li>
	<li>Coloque 180 μL de mTSB en los pozos de las columnas 1 a 12 de la microplaca de 96 pocillos.</li>
	<li>Agregue 20 μL de fagos individuales diluidos o cócteles de fagos (~ 108 PFU / ml) a los pocillos 1-8 de la fila superior de la microplaca (fila A).</li>
	<li>Para el control libre de fagos y en blanco, agregue 20 μL de mTSB al pozo superior de las columnas 9, 10 y 11.</li>
	<li>Con una pipeta de 12 canales, diluya la placa. Transfiera 20 μL de fila a fila. Mezcle el contenido del pozo mediante aspiración suave y repetida, eyección (al menos cinco veces) y cambio de puntas entre diluciones. Retire 20 μL de la última fila (fila H). NOTA: Se recomienda el uso de puntas con filtros para evitar la contaminación cruzada.</li>
	<li>Configure un depósito para cada cepa, use una pipeta de 1 ml para transferir 2-3 ml del cultivo diluido al reservorio. Para las columnas 1-10, use una pipeta multicanal para agregar 20 μL del cultivo bacteriano diluido a cada pozo. Cambie las puntas entre cada adición.</li>
	<li>Cubra e incube la microplaca en las condiciones deseadas (por ejemplo, 37 °C durante 10 h o 22 °C durante 22 h).</li>
	<li>A las 2 h u otros intervalos deseados, retire las microplacas de la incubadora.</li>
</ol>5. Determinación de la densidad óptica
<ol><li>Examine la densidad óptica a 600 nm (OD600nm) utilizando un lector de microplacas. NOTA: Se recomienda configurar y guardar el protocolo de ensayo en el programa antes de la preparación de la placa de prueba.</li>
	<li>Encienda el lector de microplacas y abra el programa.</li>
	<li>Seleccione el modo Simple en la ventana Opciones de inicio y seleccione Crear un nuevo protocolo en el Administrador de tareas (Figura suplementaria 1a,b).</li>
	<li>En la ventana Seleccionar tipo de placa , elija 96 well Plate en la lista desplegable (Figura suplementaria 2).</li>
	<li>Seleccione Absorbancia para el método de detección, la opción Punto final/cinético para el tipo de lectura y Monocromadores para el tipo de óptica. Haga clic en Aceptar (Figura suplementaria 3).</li>
	<li>En Read Step (Paso de lectura), introduzca 600 nm para longitudes de onda y seleccione Normal para velocidad de lectura. Haga clic en Aceptar (Figura suplementaria 4).</li>
	<li>Para establecer la temperatura para el ensayo, haga clic en la casilla de verificación Incubar y seleccione Incubadora encendida. Introduzca la temperatura deseada en el cuadro Temperatura . Haga clic en Aceptar. Para evitar la condensación en la tapa de la placa durante la incubación, establezca un gradiente de temperatura introduciendo un valor (1-3) en el cuadro Degradado . Haga clic en Aceptar (Figura suplementaria 5a). NOTA: Haga clic en la casilla de verificación Precalentar antes de continuar con el siguiente paso para la temperatura de incubación de 37 °C. Este paso no es necesario para la condición de prueba a 22 °C (RT).</li>
	<li>A continuación, haga clic en la casilla de verificación Kinetic para abrir Kinetic Setup. Establezca el tiempo de ejecución para 10 h para la incubación de 37 °C o 22 h para RT. Introduzca 2 h para el intervalo de lectura. Haga clic en Aceptar (Figura suplementaria 5b).</li>
	<li>Haga clic en la casilla de verificación Agitación en la ventana Procedimiento para configurar la condición de agitación, si es necesario, para cada lectura cinética (Figura suplementaria 6a).</li>
	<li>Seleccione Lineal para los modos de agitación y cambie la Duración a 30 s. Establezca el valor de frecuencia lineal en 731 cpm (2 mm) y luego haga clic en Aceptar (Figura suplementaria 6b).</li>
	<li>En la ventana Diálogo de resumen de protocolo, haga clic en Diseño de placa y seleccione Espacios en blanco, Controles de ensayo y Muestras. Haga clic en Siguiente (Figura suplementaria 7). NOTA: Introduzca 1 en Número de tipos de control diferentes para el control negativo.</li>
	<li>Después de definir la configuración para cada tipo de pozo, haga clic en Finalizar.</li>
	<li>Seleccione un ID de pozo en la interfaz del lado izquierdo y, a continuación, asígnelo a la matriz que se muestra en la viuda de diseño de placa. Haga clic en Aceptar (Figura suplementaria 8).</li>
	<li>Haga clic en el botón Leer placa y guarde el protocolo como un archivo .prt y haga clic en Guardar (Figura suplementaria 9).</li>
	<li>Inserte la placa y haga clic en Aceptar.</li>
	<li>Una vez completado el experimento, guarde el experimento como un archivo .xpt y haga clic en Guardar (Figura suplementaria 10).</li>
	<li>Exporte datos a Excel haciendo clic en el botón Sí en el cuadro de la ventana de mensaje para un análisis más detallado (Figura suplementaria 11).</li>
	<li>Haga clic en la selección Guardar sí/no y en la casilla de verificación No volver a preguntar para guardar la preferencia.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Repita al menos dos experimentos independientes como se describió anteriormente. Compilar los resultados de todos los ensayos independientes. Calcular la desviación media y estándar del OD600 de cada cultivo tratado con fagos y libre.</li>
	<li>Realizar la raíz cuadrada de los valores de OD a 600 nm y analizarlos utilizando un modelo estadístico apropiado para cada cepa bacteriana y temperatura. NOTA: Para el software SAS, se seleccionan el modelo MIXED y los mínimos cuadrados para diferenciar las medias (P < 0.05). Para cada cepa, asigne paneles A-G a cada tratamiento de fagos cuya eficacia general anti-O157 a lo largo del tiempo y los MOI difirió (P < 0,05).</li>
	<li>Definir la eficacia superior de los fagos en función del valor de OD600nm ≤ 0,01 correspondiente a ningún crecimiento bacteriano detectable (límite de detección: 300 UFC/ml).<ol>
<li>Analizar los efectos del tiempo, la temperatura de incubación, las cepas de E. coli O157, los MOI y los tipos de fagos sobre la eficacia de los fagos utilizando un modelo estadístico apropiado. NOTA: Para el software SAS, utilice GLIMMIX con medidas aleatorias.</li>
		<li>Calcule Odds Ratios para comparar la eficacia superior para diferentes factores ambientales y biológicos de interés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections.">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li><li>Czaplewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+antibiotics-a+pipeline+portfolio+review.">Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).</li><li>Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. 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D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing.">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), (2018).</li><li>Ly-Chatain, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factors+affecting+effectiveness+of+treatment+in+phages+therapy.">The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy.</a> Frontiers in Microbiololgy. 5, 51 (2014).</li><li>Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. 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A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+bacteriophage+T5virus+on+growth+of+Shiga+toxigenic+Escherichia+coli+and+Salmonella+strains+in+individual+and+mixed+cultures.">Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures.</a> Virology Journal. 17, 3 (2020).</li><li>Br&#252;ssow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+needed+for+phage+therapy+to+become+a+reality+in+Western+medicine.">What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine.</a> Virology. 434 (2), 138-142 (2012).</li><li>Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+cocktails+and+the+future+of+phage+therapy.">Phage cocktails and the future of phage therapy.</a> Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).</li><li>Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+therapy:+developments+and+directions.">Bacteriophage therapy: developments and directions.</a> Antibiotics. 9 (3), 135 (2020).</li><li>Niu, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+range+and+lytic+capability+of+four+bacteriophages+against+bovine+and+clinical+human+isolates+of+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli+O157:H7.">Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).</li></ol>

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Este protocolo describió un enfoque robusto para evaluar sistemáticamente la eficacia de los fagos contra patógenos transmitidos por los alimentos, incluidos STEC9 y Salmonella10. Un paso crítico es cuando se diluye el cultivo nocturno de bacterias, se recomienda usar un medio preenfriado y manipular la dilución con un cubo de hielo para minimizar el crecimiento bacteriano potencial. Además, se preparó la dilución de fagos antes de diluir el cultivo bacteriano. La etapa de enumeración 2.8 proporcionó números reales de inóculo bacteriano para el cálculo del MOI final aplicado. Para la preparación de fagos, generalmente se utilizan lisados de fagos crudos preparados por fagos de filtro infectados en 4-6 h de cultivo bacteriano. El paso crítico asociado con la infectividad de los fagos es siempre utilizar existencias de trabajo de fagos preparadas dentro de los 3 meses. El pipeteo extremadamente preciso (especialmente cuando se utiliza una pipeta multicanal) y la uniformidad del enfoque también son esenciales para obtener resultados comparables e interpretables. Se utilizó TSB modificado suplementado con 10 mM de Mg2+ para diluir fagos, cultivo bacteriano y medio base para optimizar la adsorción e infección de fagos.
A medida que las bacterias proliferan durante la fase de registro, incluso por debajo de la temperatura de la incubadora, se recomienda utilizar el cultivo diluido durante la noche en lugar del cultivo en fase logarítmica, para minimizar el crecimiento bacteriano potencial.
El protocolo propuesto tiene limitaciones. Primero, debido a que la microplaca solo puede contener 200 μL, la incubación prolongada puede causar una evaporación sustancial y no se recomienda. En este caso, el ensayo puede no ser adecuado para bacterias de crecimiento lento. En segundo lugar, el protocolo propuesto no fue capaz de monitorear la amplificación de los fagos. En tercer lugar, este protocolo no pudo monitorear el desarrollo de resistencia a fagos a lo largo del tiempo, un factor crítico que determina el resultado del tratamiento con fagos11,12. Se requieren experimentos de seguimiento para evaluar el rendimiento posterior del cóctel más influyente en el cribado para prevenir la aparición de mutantes antiphage en un extenso sistema de cultivo de caldo y otras matrices biológicas.
A diferencia de los antimicrobianos convencionales, la naturaleza biológica de los fagos afecta la complejidad del biocontrol y el uso terapéutico en entornos prácticos. Convencionalmente, la selección racional de cócteles de fagos se basa principalmente en la actividad lítica y la gama de fagos huéspedes. A menudo se recomiendan candidatos a fagos con la actividad lítica más fuerte y el rango de huésped más amplio13,14. Sin embargo, según el estudio actual, los fagos como rV5 y T1, aunque por sí solos no son tan virulentos como T4 y T5, facilitaron en gran medida el resultado general del biocontrol cuando se combinaron con T4 y / o T5. En consecuencia, para lograr una eficacia superior de los cócteles de fagos, se recomienda el cribado sistémico de la actividad antibacteriana de posibles combinaciones de fagos contra cepas del huésped objetivo en las condiciones ambientales deseadas. Además, la determinación de receptores para fagos candidatos y la inclusión de fagos con diversos receptores pueden prevenir la competencia por la unión del huésped, frustrar el rápido desarrollo de mutantes antifagos y mejorar los resultados del biocontrol13.
Este método permitió una cuantificación precisa de la cinética de lisis de fagos en un formato de alto rendimiento. Además, permitió la evaluación sistemática de diversos factores biológicos y ambientales sobre la eficacia antibacteriana de una variedad de fagos, facilitando así la formulación de cócteles de fagos con resultados optimizados. Se supone que las futuras aplicaciones y desarrollos del método implican el monitoreo in situ de la eficacia de cada fago dentro de los cócteles de fagos mediante el etiquetado de fluorescencia de los fagos. Además del protocolo propuesto, la comprensión de los determinantes genéticos que promueven efectos sinérgicos y facilitados entre fagos al coinfectar a un huésped facilitaría la formulación de cócteles de fagos apropiados con una eficacia superior.

Los bacteriófagos (fagos) son virus que invaden naturalmente las células bacterianas, interrumpiendo el metabolismo bacteriano y causando la lisis de la bacteria. A diferencia de los antimicrobianos convencionales (por ejemplo, antibióticos), los espectros de fagos huésped son relativamente estrechos, solo capaces de infectar un conjunto específico de especies o cepas bacterianas y, por lo tanto, deben minimizar los efectos colaterales sobre la microbiota que benefician la salud animal y humana. Con el aumento de la resistencia a los antimicrobianos (RAM), los fagos y sus derivados conducen a antimicrobianos alternativos para controlar las enfermedades infecciosas bacterianas, incluidas las infecciones bacterianas por RAM en humanos y animales1,2. Los fagos tienen un potencial terapéutico confirmado contra >20 patógenos bacterianos que causan infecciones superficiales e infecciones del sistema respiratorio superior y del tracto gastrointestinal de los seres humanos3.
En entornos agrícolas, una estrategia de biocontrol basada en fagos es el uso terapéutico de fagos para controlar patógenos bacterianos. El biocontrol de fagos es bien aceptado como una tecnología verde, eficaz para descontaminar patógenos transmitidos por los alimentos (por ejemplo, Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC), Salmonella y Listeria) en varios alimentos4,5. Además, los fagos se pueden usar como desinfectantes para desinfectar superficies de procesamiento de alimentos y pieles de animales, que se pueden integrar en sistemas antimicrobianos convencionales (por ejemplo, productos químicos, vapor y pasteurización de agua caliente) para mejorar los resultados deseados y reducir los impactos ambientales. El uso de fagos para reducir las bacterias zoonóticas en animales también es prometedor1. Sin embargo, existe la necesidad de abordar los desafíos técnicos para mejorar los resultados del enfoque de biocontrol de fagos que se aplicará popularmente en diversos sistemas de producción de alimentos. El principal desafío es la eficacia deteriorada de los fagos debido al desarrollo de mutantes resistentes a las bacterias5 y los cambios en la fisiología bacteriana debido a la exposición a factores estresantes ambientales6.
Para minimizar el riesgo de resistencia a los fagos, se proponen cócteles de fagos (es decir, una combinación de múltiples fagos) que han mejorado la potencia de biocontrol en entornos agrícolas y acuícolas7. Sin embargo, a partir de varios estudios, se ha demostrado que los cócteles de fagos no siempre ofrecían una mejor efectividad que la administración de un solo fago. Por ejemplo, un cóctel de 3 fagos similares a T4 tenía un rango de huésped más estrecho contra las cepas de E. coli8. Además, AKFV33, miembro del Tequintavirus, tuvo mayor eficacia que un cóctel de cuatro fagos en la eliminación de E. coli O157 de la carne de vacuno, a pesar de las temperaturas de incubación aplicadas4. Recientemente, se ha informado que la efectividad de los fagos individuales no predice la eficacia de los cócteles de fagos para el control de O1579, ya que las interacciones entre múltiples fagos pueden alterar la eficacia. Lo más importante es que numerosos factores, como los géneros y combinaciones de fagos, las cepas específicas y los MOI, y las temperaturas y tiempos de incubación, pueden afectar las interacciones entre los fagos. Por lo tanto, la detección cuidadosa de combinaciones de fagos contra bacterias específicas para evaluar la sinergia o facilitación de fagos, o al menos para garantizar un antagonismo mínimo de fagos en condiciones ambientales específicas, es de vital importancia para obtener resultados óptimos. Aquí, se describe un método para evaluar sistemáticamente la eficacia de varias combinaciones de fagos contra patógenos transmitidos por los alimentos en una variedad de condiciones ambientales. El beneficio de este enfoque es permitir la detección de todos los posibles factores bióticos y abióticos que se predice que afectan la eficacia antibacteriana de los fagos en entornos naturales. En el protocolo, STEC O157 y sus fagos infecciosos se emplean como ejemplo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essential supplies, reagents, and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374361</td>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Diameter: 100 mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17013808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips RT LTS 1000&#181;L FL 768A/8-low retention</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 20&#181;L F 960A/5</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 300&#181;L 768A/4</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005867</td>
			<td>no filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>168055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar (TSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105458-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105459-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Shaped Cell Spreaders</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76299-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Microbiological Incubators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50125590H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer Hotplates</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-889-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon Stir Bars</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>14-512-125</td>
			<td>length: 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BTNEO2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>9.4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings

Los patógenos bacterianos desafían continuamente los sistemas de seguridad alimentaria en todo el mundo. Con la creciente preocupación por la aparición de bacterias resistentes al calor y a los desinfectantes, se necesitan urgentemente nuevos agentes antibacterianos. Una estrategia de biocontrol basada en bacteriófagos es el uso terapéutico de fagos para controlar patógenos bacterianos en entornos agrícolas. El biocontrol de fagos es cada vez más aceptado como una tecnología sostenible, eficaz para descontaminar patógenos transmitidos por los alimentos. Para garantizar resultados de biocontrol efectivos, es crucial el cribado sistemático de combinaciones de fagos contra bacterias específicas en las condiciones ambientales requeridas. La eficacia antibacteriana de los cócteles de fagos puede verse afectada por los géneros de fagos y la combinación, las cepas bacterianas dirigidas, la multiplicidad de la infección, la temperatura y el tiempo. Para formular un cóctel de fagos con una eficacia superior, el método propuesto fue evaluar sistemáticamente la efectividad de los fagos individuales y los cócteles de fagos para matar los patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos en condiciones específicas. La eficacia de la matanza bacteriana se monitoreó midiendo la densidad óptica a las temperaturas y duraciones deseadas. La eficacia superior de los fagos se determinó mediante la inhibición completa del crecimiento bacteriano. El método propuesto es un enfoque robusto y basado en la evidencia para facilitar la formulación de cócteles de fagos con una eficacia antibacteriana superior.

Siguiendo el protocolo, se realizó una comparación de la eficacia del fago anti-O157 con varias combinaciones de fagos, temperaturas, tiempos y MOIs. Los impactos de la temperatura y los tiempos de incubación, los MOI, los fagos y las cepas bacterianas utilizadas para mejorar la eficacia anti-E. coli O157 se presentan en la Tabla 1 (tabla de odds ratio)9. El porcentaje (%) de medición de turbidez óptica ≤ 0,01 producido fue analizado por cada preparación de fagos bajo cada condición experimental. Sobre la base de este análisis, la eficacia de los fagos anti-O157 se maximizó después de 14, 16 o 18 h de incubación a 22 °C (P < 0,001) y MOI = 1000 (P < 0,001), con un 75% y un 89% del crecimiento del cultivo tratado con fagos completamente inhibido, respectivamente. En general, entre 11 preparaciones de fagos, un cóctel de T1, T4 y rV5 fue más efectivo (P < 0,05) contra O157. Además, a través de las temperaturas de incubación, los tiempos, los MOI y los fagos probados, la sensibilidad a los fagos varió, siendo las cepas de O157 probadas con la cepa CO281-31N las más sensibles (P < 0.001) y 3081 (P < 0.001) siendo las menos sensibles a los fagos.
Para comprender la cinética de eliminación de fagos de cada cepa bacteriana probada, se trazó el valor de OD600 contra cada tiempo de muestreo, MOI y tratamiento de fagos a cada temperatura de incubación. Los resultados representativos de la eficacia de los fagos contra E. coli O157 3081 a 37 °C se muestran en la Figura 2. Se asegura que la curva de crecimiento del cultivo de control libre de fagos es normal antes de evaluar la inhibición de la curva de crecimiento del cultivo tratado con fagos. De acuerdo con la Figura 2, la inclusión de T4 inhibió completamente el crecimiento bacteriano a 37 °C, en cada momento de muestreo en un MOI tan bajo como 1. Para obtener una visión general de cómo los fagos inhibieron el crecimiento bacteriano a lo largo del tiempo a varias temperaturas, independientemente de los MOI, el valor medio de OD600nm promediado de todos los MOI (MOI > 0) se trazó contra cada tiempo de muestreo y tratamiento de fagos (Figura 3). En comparación con 37 ° C, la eficacia particular para matar fagos, por ejemplo, fagos T4 y T1 + T4, se mejoró a más de 22 ° C. Otro enfoque para resumir y comparar la efectividad general anti-O157 entre los fagos se muestra en la Tabla 2 y la Tabla 39. El valor de OD600 se promedió a partir de cada tiempo de muestreo y MOI y se clasificó la eficacia de los fagos de mayor (A) a menor (F: 37 ° C y D: 22 ° C). Esta tabla facilita la identificación del mejor tratamiento de fagos. Por ejemplo, para la cepa 3081, los fagos T4 y T5 + T4 (Panel A) fueron el tratamiento más efectivo a 37 °C, mientras que además del fago T4, los fagos T1 + T4, T1 + T4 + rV5 y los cócteles de 4 fagos (Panel A) fueron el tratamiento más efectivo a 22 °C.
Este protocolo también nos permitió comparar la eficacia de los fagos con varias cepas bacterianas dirigidas y personalizar la preparación de los fagos. Por ejemplo, al seleccionar fagos, a 37 °C, excluyendo la cepa 3081, el fago T1 + T4 + rV5 tuvo la efectividad más significativa contra todas las demás cepas, independientemente de sus tipos de fagos. A 22 °C, el cóctel de 4 fagos fue el más efectivo contra todas las cepas probadas. Los mejores MOI dieron como resultado una lisis completa (OD600 ≤ 0,01), lo que garantizó una eficacia potencial superior en condiciones experimentales (Tabla 2 y Tabla 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg"> Figura 1: Diseño sugerido del ensayo de microplacas de 96 pocillos. Las diluciones seriales de 10 veces de cada fago se preparan en las columnas 1-8 de microplacas estériles de 96 pocillos. Cuatro fagos contra una cepa bacteriana se pueden probar por duplicado, en columnas adyacentes, en cada placa. Las columnas restantes son para controles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg"> Figura 2: Curvas de crecimiento de E. coli O157 cepa 3081 a 37 °C tratadas y no tratadas con fagos en cada MOIs. Los datos se compilaron a partir de dos ensayos independientes. Las barras presentan desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg"> Figura 3: Curvas de crecimiento de cepas de E. coli O157 cepa 3081. (A) Curvas de crecimiento a 37 °C. (B) Curvas de crecimiento a 22 °C. Cada curva representa cultivos individuales y mixtos, tratados y no tratados con fagos a través de MOI. Los datos se compilaron a partir de dos ensayos independientes. Las barras presentan el error estándar de la media (adaptado de Reference9 with permission). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Odds ratios que comparan la probabilidad de una eficacia superior de los fagos contra E. coli O157 a temperaturas de incubación, tiempos de incubación, MOIs, fagos y cepas de E. coli O157 (adaptado de Reference9 con permiso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta Tabla.</a>
Tabla 2: Eficacia global de los fagos contra E. coli O157 a 37 °C (adaptado de Reference9 con permiso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta Tabla.</a>
Tabla 3: Eficacia global de los fagos contra E. coli O157 a 22 °C (adaptado de Reference9 con permiso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta Tabla.</a>
Figuras complementarias 1-11: Instantáneas del funcionamiento y los procedimientos del lector de microplacas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

Este protocolo describe un método robusto para usar configuraciones de alto rendimiento para evaluar la eficacia antibacteriana de los cócteles de bacteriófagos.

Eficacia de los bacteriófagos para el biocontrol de patógenos transmitidos por los alimentos evaluados a través de configuraciones de alto rendimiento

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

Este protocolo fácil de realizar evalúa la eficacia antibacteriana de diversas combinaciones de bacteriófagos, también conocidas como cócteles de fagos, en condiciones variables en un entorno de alto rendimiento. Las principales ventajas de la técnica es la capacidad de transmitir diferentes bióticos y factores abióticos, como la temperatura, que pueden afectar la eficacia de los fagos en una variedad de condiciones ambientales. Este método puede facilitar el diseño de cócteles de fagos apropiados para mejorar el biocontrol y los resultados terapéuticos y determinar la interacción entre los huéspedes bacterianos y los bacteriófagos.Para empezar, configure el ensayo de microplacas utilizando puntas filtradas para evitar la contaminación cruzada. Primero, agregue 180 microlitros de mTSB en los pozos de las columnas uno a 12 de la microplaca de 96 pocillos, luego prepare diluciones de diez veces en serie de cada fago en columnas de una a ocho de las microplacas estériles de 96 pocillos para configurar el ensayo. Agregue 20 microlitros de fagos individuales o cócteles de fagos a los pocillos del uno al ocho de la fila superior A de la microplaca.Para un control sin fagos y en blanco, agregue 20 microlitros de mTSB al pozo superior de las columnas nueve a 12. Mientras pipetea, mezcle el contenido del pozo con una aspiración suave y repetida al menos cinco veces y cambie las puntas entre diluciones. Retire 20 microlitros de la última fila H, luego configure un reservorio para la cepa bacteriana probada transfiriendo de dos a tres mililitros del cultivo diluido al reservorio usando una pipeta de un mililitro.Usando una pipeta multicanal, agregue 20 microlitros del cultivo bacteriano diluido a cada pozo en columnas del uno al 10 mientras cambia las puntas entre cada adición. Cubra e incube la microplaca a 37 grados centígrados. A intervalos de dos horas, retire la microplaca de la incubadora y lea la placa con un lector de microplacas.Alternativamente, incube la placa en un lector de microplacas y léala con el tiempo. Para examinar la densidad óptica a 600 nanómetros utilizando un lector de microplacas, abra el programa en un lector de microplacas. Seleccione el Modo simple en la ventana de opciones de inicio y, a continuación, seleccione Crear un nuevo protocolo en el Administrador de tareas.En la ventana Seleccionar tipo de placa, elija placa de 96 pocillos en la lista desplegable. Como método de detección, seleccione Absorbancia para el tipo de lectura, seleccione La opción Extremo/cinética para el tipo de óptica, seleccione Monocromadores y, a continuación, haga clic en Aceptar. En Read Step (Paso de lectura), ingrese 600 nanómetros para longitudes de onda, seleccione Normal para la velocidad de lectura y haga clic en OK.To establecer la temperatura para el ensayo, haga clic en la casilla de verificación Incubar y seleccione Incubadora encendida.Ingrese la temperatura deseada en el cuadro de temperatura y luego haga clic en Aceptar. Haga clic en la casilla Precalentar antes de continuar con el siguiente paso para la temperatura de incubación de 37 grados Centígrados, aunque la opción no es necesaria para las condiciones de prueba a 22 grados Centígrados. Para evitar la condensación en la tapa de la placa durante la incubación, establezca el gradiente de temperatura introduciendo un valor en el cuadro de degradado y, a continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, haga clic en la casilla de verificación Cinética para abrir la configuración cinética.Establezca el tiempo de ejecución durante 10 horas para la incubación de 37 grados Celsius o 22 horas para la temperatura ambiente e ingrese dos horas como intervalo de lectura, luego haga clic en Aceptar. Haga clic en la casilla de verificación Agitar en la ventana de procedimiento para configurar la condición de agitación, si es necesario para cada lectura cinética. Seleccione Lineal como Modo de agitación y cambie la Duración a 30 segundos. Establezca el valor de frecuencia lineal en 731 ciclos por minuto y, a continuación, haga clic en OK.In la ventana Diálogo de resumen de protocolo, haga clic en Diseño de placa, seleccione Espacios en blanco, Controles de ensayo y Muestras, y haga clic en Siguiente.Después de definir la configuración para cada tipo de pozo, haga clic en Finalizar. Seleccione un ID de pozo en la interfaz del lado izquierdo, asígnelo a la matriz que se muestra en la ventana Diseño de placas y, a continuación, haga clic en Aceptar. Haga clic en el botón Leer placa, guarde el protocolo como un archivo prt y haga clic en Guardar. Inserte la placa y haga clic en Aceptar. Una vez completado el experimento, guarde el experimento como un archivo xpt y haga clic en Guardar.Exporte los datos a Excel haciendo clic en el botón Sí en el cuadro de la ventana de mensaje para un análisis más detallado. Haga clic en la selección Guardar sí /no y la casilla de verificación No volver a preguntar para guardar la preferencia. Siguiendo el protocolo, se realizó una comparación de la eficacia de los fagos con varias combinaciones de fagos, temperaturas, tiempos y multiplicidad de infecciones, o MOI.Sobre la base de este análisis, la eficacia de los fagos anti-O157 se maximizó después de 14, 16 o 18 horas de incubación a 22 grados centígrados. Para comprender la cinética de eliminación de fagos de las bacterias, los valores de OD a 600 nanómetros se trazaron contra el tiempo de muestreo, los MOI y el tratamiento con fagos. Se muestran las curvas de crecimiento bacteriano representativas a 37 grados centígrados tratados.T4 inhibió completamente el crecimiento bacteriano en cada momento de muestreo, incluso a bajo MOI. Para analizar el crecimiento bacteriano inhibido por fagos, se trazaron los valores medios de OD de todos los MOI contra cada tiempo de muestreo y tratamiento con fagos. Los gráficos representativos a dos temperaturas revelaron que la eficacia de la matanza de fagos, por ejemplo, para T1 más T4 se mejoró a 22 grados Celsius en comparación con 37 grados Celsius.Se muestra la comparación de la efectividad general de los fagos, lo que facilita la identificación de la mejor fase de tratamiento. Por ejemplo, para escherichia coli cepa 3081, el tratamiento con fagos T4 y T5 más T4 fue el tratamiento más efectivo a 37 grados centígrados. Sin embargo, a 22 grados Centígrados, además de T4, los fagos T1 más T4, T1 más T4 más rV5 y cuatro cócteles de fagos fueron efectivos.Al realizar este procedimiento, el pipeteo extremadamente preciso, particularmente cuando se utiliza una pipeta multicanal y la uniformidad del enfoque son esenciales para obtener resultados comparables e interpretables. Se requieren experimentos de seguimiento para evaluar el rendimiento posterior del cóctel más influyente en el cribado, previniendo la aparición de mutantes antífagos en un extenso sistema de cultivo de caldo y otras matrices biológicas.

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