Name: bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

Denna forskning stöddes av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), Canada Foundation for Innovation (Project # 38710) och Major Innovation Fund, Alberta. Vi tackar dr John Kastelic för att han redigerade manuskriptet.

1. Beredning av buffert och reagenser
<ol><li>Gör 500 ml tryptisk sojabuljong (TSB) (15 g TSB-pulver och 500 ml ultrapurvatten) och autoklav. OBS: Detta kan förvaras i rumstemperatur i upp till 3 månader eller vid 4 °C i upp till 6 månader.</li>
	<li>Gör 500 ml tryptisk sojaagar (TSA) (20 g TSA-pulver och 500 ml ultrapurvatten) och autoklav. OBS: Detta kan förvaras vid 4 °C i upp till 3 månader.</li>
	<li>Gör 500 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,77 g Na2HPO4 och 0,12 g KH2PO4, 500 ml ultrapurvatten), mät och justera pH-värdet till 7,2 ± 0,2 vid 25 °C och autoklav. OBS: Detta kan förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.</li>
	<li>Gör 200 ml 1 M MgSO4 (49.294 g och 200 ml ultrapure vatten) och sterilisera via 0,22 μm polyethersulfone filter.</li>
	<li>Gör 500 ml TSB med 10 mM MgSO4 (mTSB; 15 g TSB-pulver, 500 ml ultrapurvatten och 5 ml 1 M MgSO4) och autoklav; låt det autoklaverade mediet svalna till rumstemperatur. Använd den aseptiska tekniken. Använd en serologisk pipett och överför försiktigt 5,0 ml 1 M MgSO4; virvla försiktigt för att blanda.</li>
</ol>2. Beredning av bakteriekultur
<ol><li>För att förbereda bakteriell forskningslaboratorium kultur (BRLC), ta bort glycerol lager injektionsflaska(er) från frys inventeringen och överföra till laboratoriet.</li>
	<li>Använd en engångsinglinga eller motsvarande, doppa i injektionsflaskan, ta bort en skrapning av inokulat (frusen slask) och strimla på en TSA-platta eller motsvarande inom ett biologiskt säkerhetsskåp på nivå II. Inkubera plattan vid 37 ± 2 °C i 15−18 timmar.</li>
	<li>Packa de beredda BRLC-plattorna och förvara vid 4 °C. OBS: Allmän utgångsperiod för BRLC: 14 dagar vid 4 °C efter generation.</li>
	<li>Inokulera en enda koloni av varje E. coli O157 stam från BRLC plattorna som ska testas i 10 ml TSB och statiskt inkubera vid 37 °C för 18 h för att nå 9 log10 CFU/mL.</li>
	<li>Förbered en seriell utspädning av nattkulturerna (följande morgon), varje E. coli O157-stam med mTSB innehållande 10 mM MgSO4 för att uppnå 4-5 log10 CFU/ml (eller annan önskad inokulatnivå).</li>
	<li>Blanda en lika stor volym av en nattkultur av varje stam för att uppnå 4-5 log10 CFU/ml totalt (eller efter önskemål) för att förbereda bakterieblandningen.</li>
	<li>Placera omedelbart den utspädda bakteriekulturen vid 4 °C för väntande användning.</li>
	<li>Späd inokulatkulturen 10 eller 100 gånger och plätera 0,1 ml alikvoter av dessa utspädningar på TSA-plattorna för att erhålla de isolerade kolonierna.</li>
</ol>3. Förberedelse av fagarbetslösningar
<ol><li>Föröka arbetslager med hög titer för varje som ska screenas (≥108 PFU/ml) genom att följa standardmetoderna4. OBS: Den allmänna utgångsperioden för faglagren är 3 månader i en plastflaska vid 4 °C efter generation.</li>
	<li>För att uppnå önskad titer på t.ex. ~108 PFU/ml för lyskinetik, späd ut enskilda fagerpreparat med mTSB som innehåller 10 mM MgSO4. Förbered fagcocktails genom att blanda lika volymer av varje arbetslager med samma titer i alla möjliga kombinationer.</li>
</ol>4. Beredning av in vitro-lyskinetik för individuell fagen- och fagencocktails
<ol><li>Förbered seriella 10-faldiga utspädningar av varje i kolumnerna 1-8 i sterila 96-brunnsmikroplattor för att ställa in mikroplattans analys. OBS: Fyra fager mot en bakteriestam kan testas i duplikat, i angränsande kolonner, på varje platta. De återstående fyra kolumnerna är för kontroller, som är utan faage, samt mTSB-tom (bild 1).</li>
	<li>Placera 180 μL mTSB på brunnar från kolonn 1 till 12 på mikroplattan med 96 brunnar.</li>
	<li>Tillsätt 20 μL utspädda individuella fager eller fagercocktails (~108 PFU/ml) till brunnarna 1-8 på mikroplattans översta rad (rad A).</li>
	<li>För den fagfria och tomma kontrollen, tillsätt 20 μL mTSB i den övre brunnen i kolumnerna 9, 10 och 11.</li>
	<li>Späd ner plattan med en 12-kanals pipett. Överför 20 μL från rad till rad. Blanda brunnsinnehållet genom skonsam, upprepad aspiration, utmatning (minst fem gånger) och byte av spetsar mellan utspädningar. Ta bort 20 μL från den sista raden (rad H). OBS: Användning av tips med filter rekommenderas för att förhindra korskontaminering.</li>
	<li>Ställ upp en reservoar för varje stam, använd 1 ml pipett för att överföra 2-3 ml av den utspädda kulturen till behållaren. För kolumnerna 1-10, använd en flerkanalspipett för att tillsätta 20 μL av den utspädda bakteriekulturen till varje brunn. Ändra tips mellan varje tillägg.</li>
	<li>Täck och inkubera mikroplattan under önskade förhållanden (t.ex. 37 °C för 10 h eller 22 °C i 22 timmar).</li>
	<li>Vid 2 h eller andra önskade intervall, ta bort mikroplattorna från inkubatorn.</li>
</ol>5. Bestämning av optisk densitet
<ol><li>Undersök för optisk densitet vid 600 nm (OD600nm) med hjälp av en mikroplatta läsare. OBS: Det rekommenderas att ställa in och spara analysprotokollet i programmet innan provplattan förbereds.</li>
	<li>Slå på mikroplattans läsare och öppna programmet.</li>
	<li>Välj enkelt läge i fönstret Startalternativ och välj Skapa ett nytt protokoll i Aktivitetshanteraren (kompletterande figur 1a,b).</li>
	<li>I fönstret Välj plåttyp väljer du 96 brunnsplatta i listrutan (kompletterande figur 2).</li>
	<li>Välj Absorbans för detektionsmetod, alternativet Slutpunkt/Kinetisk för lästyp och Monokromatorer för optiktyp. Klicka på OK (kompletterande figur 3).</li>
	<li>För Lässteg anger du 600 nm för våglängder och väljer Normal för läshastighet. Klicka på OK (kompletterande figur 4).</li>
	<li>Om du vill ställa in temperaturen för analysen klickar du på kryssrutan Inkubation och väljer Inkubator på. Ange önskad temperatur i rutan Temperatur . Klicka på OK. För att förhindra kondens på plåtlocket under inkubation, ställ in en temperaturgradient genom att ange ett värde (1-3) i rutan Gradient . Klicka på OK (kompletterande figur 5a). OBS: Klicka på kryssrutan Förvärmning innan du fortsätter med nästa steg för inkubationstemperaturen på 37 °C. Detta steg krävs inte för provningstillståndet vid 22 °C (RT).</li>
	<li>Klicka sedan på kryssrutan Kinetic för att öppna kinetisk installation. Ställ in körtiden på 10 h för 37 °C inkubation eller 22 timmar för RT. Ange 2 h för läsintervall. Klicka på OK (kompletterande figur 5b).</li>
	<li>Klicka i kryssrutan Skaka i procedurfönstret för att ställa in skakningsförhållandet, om det behövs, för varje kinetisk läsning (kompletterande figur 6a).</li>
	<li>Välj Linjär för skakningslägen och ändra varaktigheten till 30 s. Ställ in linjärt frekvensvärde till 731 cpm (2 mm) och klicka sedan på OK (kompletterande bild 6b).</li>
	<li>I fönstret Protokollsammanfattningsdialog klickar du på Plåtlayout och väljer Ämnen, Analyskontroller och Exempel. Klicka på Nästa (Kompletterande figur 7). Ange 1 i Antal olika kontrolltyper för negativ kontroll.</li>
	<li>När du har definierat inställningarna för varje brunnstyp klickar du på Slutför.</li>
	<li>Välj ett Well ID i vänstergränssnitt och tilldela det sedan till matrisen som visas i plattlayout änkan. Klicka på OK (kompletterande figur 8).</li>
	<li>Klicka på knappen Läsplatta och spara protokollet som en .prt-fil och klicka på Spara (kompletterande figur 9).</li>
	<li>Sätt i plattan och klicka på OK.</li>
	<li>När experimentet är klart sparar du experimentet som en XPT-fil och klickar på Spara (kompletterande bild 10).</li>
	<li>Exportera data till Excel genom att klicka på ja-knappen i rutan meddelandefönster för vidare analys (kompletterande bild 11).</li>
	<li>Klicka på markeringen Spara ja/nej och kryssrutan Fråga inte igen för att spara inställningar.</li>
</ol>6. Dataanalyser
<ol><li>Upprepa minst två oberoende experiment enligt beskrivningen ovan. Kompilera resultat från alla oberoende försök. Beräkna den genomsnittliga och standardavvikelsen för OD600 från varje fagenbehandlad och fri kultur.</li>
	<li>Utför kvadratroten av OD-värdena vid 600 nm och analysera dem med hjälp av en lämplig statistisk modell för varje bakteriestam och temperatur. OBS: För SAS-programvara väljs MIXED-modellen och de minst rutor för att differentiera medel (P < 0,05). För varje stam, tilldela panelerna A−G till varje fagbehandling, varav den totala effekten mot O157 över tid och MOI skilde sig åt (P < 0, 05).</li>
	<li>Definiera överlägsen fagereffekt baserat på OD600nm-värde ≤ 0, 01 motsvarande ingen detekterbar bakterietillväxt (detektionsgränsen:300 CFU/ml).<ol>
<li>Analysera effekter av tid, inkubationstemperatur, E. coli O157 stammar, MOI och fagtyper på fageffekt med hjälp av en lämplig statistisk modell. OBS: För SAS programvara, använd GLIMMIX med slumpmässiga mått.</li>
		<li>Beräkna oddskvoter för att jämföra överlägsen effekt för olika miljömässiga och biologiska faktorer av intresse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections.">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li><li>Czaplewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+antibiotics-a+pipeline+portfolio+review.">Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).</li><li>Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+therapy+in+bacterial+infections+treatment:+one+hundred+years+after+the+discovery+of+bacteriophages.">Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Escherichia+coli+O157+on+beef+at+37,+22+and+4&#176;C+by+T5-,+T1-,+T4-and+O1-like+bacteriophages.">Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4&#176;C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages.</a> Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).</li><li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing.">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), (2018).</li><li>Ly-Chatain, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factors+affecting+effectiveness+of+treatment+in+phages+therapy.">The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy.</a> Frontiers in Microbiololgy. 5, 51 (2014).</li><li>Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-based+biocontrol+strategies+and+their+application+in+agriculture+and+aquaculture.">Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).</li><li>Bourdin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coverage+of+diarrhoea-associated+Escherichia+coli+isolates+from+different+origins+with+two+types+of+phage+cocktails.">Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails.</a> Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).</li><li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+individual+bacteriophages+does+not+predict+efficacy+of+bacteriophage+cocktails+for+control+of+Escherichia+coli+O157.">Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157.</a> Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712 (2021).</li><li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+bacteriophage+T5virus+on+growth+of+Shiga+toxigenic+Escherichia+coli+and+Salmonella+strains+in+individual+and+mixed+cultures.">Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures.</a> Virology Journal. 17, 3 (2020).</li><li>Br&#252;ssow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+needed+for+phage+therapy+to+become+a+reality+in+Western+medicine.">What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine.</a> Virology. 434 (2), 138-142 (2012).</li><li>Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+cocktails+and+the+future+of+phage+therapy.">Phage cocktails and the future of phage therapy.</a> Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).</li><li>Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+therapy:+developments+and+directions.">Bacteriophage therapy: developments and directions.</a> Antibiotics. 9 (3), 135 (2020).</li><li>Niu, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+range+and+lytic+capability+of+four+bacteriophages+against+bovine+and+clinical+human+isolates+of+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli+O157:H7.">Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).</li></ol>

Författarna förklarar att forskningen utfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Detta protokoll beskrev en robust metod för systemiskt utvärdera effekt mot livsmedelsburna patogener, inklusive STEC9 och Salmonella10. Ett viktigt steg är att vid utspädning av bakteriers över natten, med förkylt medium och manipulera utspädningen med en ishink rekommenderas för att minimera potentiell bakterietillväxt. Dessutom bereddes fagutspädning innan bakteriekulturen späddes ut. Uppräkningssteg 2,8 gav det faktiska antalet bakteriellt inokulat för beräkning av den slutliga MOI som tillämpades. För fagberedning används i allmänhet råa lysater som framställs av filterfag infekterad i 4-6 h bakteriekultur. Det kritiska steget i samband med faginfektivitet är alltid att använda fagarbetslager som är förberedda inom 3 månader. Extremt noggrann pipettering (särskilt vid användning av en flerkanalspipett) och enhetlighet i tillvägagångssättet är också avgörande för att uppnå jämförbara och tolkningsbara resultat. Modifierad TSB kompletterad med 10 mM Mg2 + användes för att späda fager, bakteriekultur och basmedium för att optimera adsorption och infektion av fager.
Eftersom bakterier förökar sig under loggfasen, även under inkubatorns temperatur, rekommenderas att använda utspädd nattkultur istället för logfaskultur, för att minimera potentiell bakterietillväxt.
Det föreslagna protokollet har begränsningar. För det första, eftersom mikroplattan endast kan rymma 200 μL, kan långvarig inkubation orsaka betydande avdunstning och rekommenderas inte. I detta fall kanske analysen inte är lämplig för långsamt växande bakterier. För det andra kunde det föreslagna protokollet inte övervaka förstärkningen av fager. För det tredje kunde detta protokoll inte övervaka utvecklingen av fagresistens över tid, en kritisk faktor som bestämmer resultatet av fagbehandling11,12. Uppföljande experiment krävs för att bedöma den fortsatta prestandan hos den mest inflytelserika cocktailen i screeningen för att förhindra uppkomsten av anti-faage mutanter i ett omfattande buljongkultursystem och andra biologiska matriser.
I motsats till konventionella antimikrobiella medel påverkar fagernas biologiska karaktär komplexiteten i biokontroll och terapeutisk användning i praktiska miljöer. Konventionellt är rationellt urval av faagecocktails främst baserat på lytisk aktivitet och värdutbudet av fager. Phage-kandidater med starkast lytisk aktivitet och bredaste värdintervall rekommenderas ofta13,14. Baserat på den aktuella studien underlättade dock fager som rV5 och T1, även om de inte är lika virulenta som T4 och T5, kraftigt det totala biokontrollresultatet i kombination med T4 och/eller T5. För att uppnå överlägsen effekt av fagercocktails rekommenderas därför systemisk screening av antibakteriell aktivitet av potentiella fagkombinationer mot riktade värdstammar under önskade miljöförhållanden. Dessutom kan bestämning av receptorer för fagkandidater och införande av fager med olika receptorer förhindra konkurrens om värdfäste, omintetgöra snabb utveckling av anti-faage mutanter och förbättra biokontroller resultaten13.
Denna metod möjliggjorde korrekt kvantifiering av faglys kinetik i ett höggenomströmningsformat. Dessutom möjliggjorde det systematisk utvärdering av olika biologiska och miljömässiga faktorer på den antibakteriella effekten av ett sortiment av fager, vilket underlättade formuleringen av faagecocktails med optimerade resultat. Metodens framtida tillämpningar och utveckling antas involvera in situ övervakning av effektiviteten hos varje fager inom faage cocktails genom fluorescensmärkning av fager. Utöver det föreslagna protokollet skulle förståelse av genetiska bestämningsfaktorer som främjar synergistiska och underlättade effekter mellan fager när de smittar en värd underlätta formuleringen av lämpliga faagecocktails med överlägsen effekt.

Bakteriofager (fager) är virus som naturligt invaderar bakterieceller, stör bakteriemetabolismen och orsakar lys av bakterien. Till skillnad från konventionella antimikrobiella medel (t.ex. antibiotika) är värdspektrumen för relativt smala, endast kan infektera en riktad uppsättning bakteriearter eller stammar och bör därför minimera sidoeffekter på mikrobiota som gynnar djurs och människors hälsa. Med ökningen av antimikrobiell resistens (AMR) leder fager och deras derivat till alternativa antimikrobiella medel för att kontrollera bakteriella infektionssjukdomar, inklusive AMR-bakterieinfektioner hos människor och djur1,2. Fager har bekräftat terapeutisk potential mot >20 bakteriella patogener som orsakar ytliga infektioner och infektioner i övre luftvägarna och mag-tarmkanalen hos människor3.
I jordbruksmiljöer är en faagebaserad biokontrollstrategi terapeutisk användning av fager för att kontrollera bakteriella patogener. Phage biocontrol är väl accepterad som en grön teknik, effektiv för att dekontaminera livsmedelsburna patogener (t.ex. Shiga-toxin som producerar Escherichia coli (STEC), Salmonella och Listeria) i olika livsmedel4,5. Dessutom kan fager användas som desinfektionsmedel för att desinficera ytor och djurhudar, som kan integreras i konventionella antimikrobiella system (t.ex. kemikalier, ånga och varmvattenpastörisering) för att förbättra önskade resultat och minska miljöpåverkan. Användningen av fager för att minska zoonotiska bakterier hos djur är också lovande1. Det finns dock ett behov av att ta itu med de tekniska utmaningarna för att förbättra resultaten av den fagbiokontrollmetod som ska tillämpas populärt i olika livsmedelsproduktionssystem. Den största utmaningen är fagernas försämrade effektivitet på grund av utvecklingen av bakterieresistenta mutanter5 och förändringar i bakteriefysiologin på grund av exponering för miljöstressfaktorer6.
För att minimera risken för fagbeständighet föreslås fagercocktails (dvs. en kombination av flera fager) och har förbättrad biokontrollstyrka inom jordbruk och vattenbruk7. Men från flera studier har det visat sig att fagercocktails inte alltid erbjöd bättre effektivitet än administrering av en enda. Till exempel hade en cocktail av 3 T4-liknande fager ett smalare värdområde mot E. coli-stammar8. Dessutom hade AKFV33, en medlem av Tequintavirus, större effekt än en cocktail av fyra fager för att avlägsna E. coli O157 från nötkött, trots inkubationstemperaturerna som tillämpades4. Nyligen har det rapporterats att effektiviteten hos enskilda fager inte förutsäger effekten av fagercocktails för kontroll av O1579, eftersom interaktioner mellan flera fager kan förändra effekten. Viktigast av allt, många faktorer, såsom fager genera och kombinationer, riktade stammar och MOI, och inkubationstemperaturer och tider, kan påverka interaktioner mellan fager. Därför är det mycket viktigt att noggrant undersöka kombinationer av fager mot specifika bakterier för att bedöma fagsynergi eller underlättande, eller åtminstone för att säkerställa minimal fager antagonism under specifika miljöförhållanden. Här beskrivs en metod för att systematiskt bedöma effekten av olika fagerkombinationer mot livsmedelsburna patogener under en rad olika miljöförhållanden. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att möjliggöra screening av alla möjliga biotiska och abiotiska faktorer som förutspås påverka den antibakteriella effekten av fager i naturliga miljöer. I protokollet används STEC O157 och deras infekterande fager som exempel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Essential supplies, reagents, and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1374361</td>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Diameter: 100 mm, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17013808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17014412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips RT LTS 1000&#181;L FL 768A/8-low retention</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 20&#181;L F 960A/5</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips SR LTS 300&#181;L 768A/4</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>17005867</td>
			<td>no filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>168055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar (TSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105458-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105459-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Shaped Cell Spreaders</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76299-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Microbiological Incubators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50125590H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer Hotplates</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-889-335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon Stir Bars</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>14-512-125</td>
			<td>length: 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BTNEO2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>9.4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacteriophage effectiveness for biocontrol of foodborne pathogens evaluated via high-throughput settings

Bakteriella patogener utmanar ständigt livsmedelssäkerhetssystem över hela världen. Med ökande oro för uppkomsten av värme- och sanitizerresistenta bakterier behövs det ett trängande behov av nya antibakteriella medel. En bakteriofagbaserad biokontrollstrategi är terapeutisk användning av fager för att kontrollera bakteriella patogener i jordbruksmiljöer. Phage biocontrol accepteras alltmer som en hållbar teknik, effektiv för att dekontaminera livsmedelsburna patogener. För att säkerställa effektiva biokontrollresultat är systematisk screening av fagerkombinationer mot riktade bakterier under erforderliga miljöförhållanden avgörande. Antibakteriell effekt av fagcocktails kan påverkas av fagsläkten och kombination, riktade bakteriestammar, infektionens mångfald, temperatur och tid. För att formulera en fagercocktail med överlägsen effekt var den föreslagna metoden att systematiskt utvärdera effektiviteten hos enskilda fager och fagercocktails för att döda livsmedelsburna bakteriella patogener under riktade förhållanden. Bakteriell dödande effekt övervakades genom att mäta optisk densitet vid önskade temperaturer och varaktigheter. Överlägsen fager effekt fastställdes genom fullständig hämning av bakteriell tillväxt. Den föreslagna metoden är ett robust, evidensbaserat tillvägagångssätt för att underlätta formulering av fagercocktails med överlägsen antibakteriell effekt.

Enligt protokollet utfördes en jämförelse av anti-O157 effekt med olika kombinationer, temperaturer, tider och MOI. Effekter av inkubationstemperatur och inkubationstider, MOI, fager och bakteriestammar som används för att förbättra effekten av anti-E. coli O157 presenteras i tabell 1 (odds ratio table)9. Procentandelen (%) av optisk grumlighet mätning ≤ 0,01 som gavs analyserades av varje preparat under varje experimentellt villkor. Baserat på denna analys maximerades anti-O157 fagen effekt efter 14, 16 eller 18 h inkubation vid 22 °C (P < 0,001) och MOI = 1000 (P < 0,001), med 75% respektive 89% av tillväxten av fagbehandlad kultur är helt hämmad. I allmänhet var bland 11 fagpreparat en cocktail av T1, T4 och rV5 mest effektiv (P < 0,05) mot O157. Dessutom varierade känsligheten för fager över inkubationstemperaturer, tider, MOI och fager som testades, med O157-stammar som testades med stam CO281-31N som mest känsliga (P < 0,001) och 3081 (P < 0,001) som är minst känsliga för fager.
För att förstå fagendödande kinetik för varje bakteriestam som testades, ritades OD600-värdet mot varje provtagningstid, MOI och fagbehandling vid varje inkubationstemperatur. Representativa resultat från effekten av fager mot E. coli O157 3081 vid 37 °C visas i figur 2. Det säkerställs att tillväxtkurvan för fagenfri kontrollkultur är normal innan man bedömer hämning av tillväxtkurvan för fagbehandlad kultur. Enligt figur 2 hämmade införandet av T4 helt bakterietillväxt vid 37 °C, vid varje provtagningstid vid en MOI så låg som 1. För att överblicka hur hämmade bakterietillväxt över tid vid olika temperaturer, oavsett MOI, ritades det genomsnittliga OD600nm-värdet från alla MOI (MOI > 0) mot varje provtagningstid och fagbehandling (figur 3). Jämfört med 37 °C förbättrades särskilt fagens dödande effekt, t.ex. fagerna T4 och T1 + T4, över 22 °C. Ett annat tillvägagångssätt för att sammanfatta och jämföra den totala anti-O157-effektiviteten bland fager visas i tabell 2 och tabell 39. OD600-värdet var medelvärdet från varje provtagningstid och MOI och rangordnad fagereffekt från högsta (A) till lägsta (F: 37 °C och D: 22 °C). Denna tabell underlättar identifieringen av den bästa fagbehandlingen. Till exempel, för stam 3081, var fager T4 och T5 + T4 (panel A) den mest effektiva behandlingen vid 37 °C, medan förutom faage T4, fager T1 + T4, T1 + T4 + rV5 och 4 faage cocktails (panel A) var den mest effektiva behandlingen vid 22 °C.
Detta protokoll gjorde det också möjligt för oss att jämföra fager effekt mot olika bakteriella stammar riktade och anpassa beredning. Till exempel, när man valde fager, vid 37 °C, exklusive stam 3081, hade T1 + T4 + rV5 den mest signifikanta effektiviteten mot alla andra stammar, oavsett deras fagtyper. Vid 22 °C var 4-phage cocktail den mest effektiva mot alla testade stammar. De bästa MOI resulterade i fullständig lys (OD600 ≤ 0,01), vilket motiverade potentiell överlägsen effekt under experimentella förhållanden (tabell 2 och tabell 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg"> Bild 1: Föreslagen layout av 96-brunns mikroplatta analys. Seriella 10-faldiga utspädningar av varje bereds i kolumnerna 1-8 av sterila 96-brunnsmikroplattor. Fyra fager mot en bakteriestam kan testas i duplikat, i angränsande kolonner, på varje platta. De återstående kolumnerna är för kontroller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg"> Figur 2: Tillväxtkurvor av E. coli O157 stam 3081 vid 37 °C behandlas och behandlas inte med fager vid varje MOI. Uppgifterna sammanställdes från två oberoende försök. Staplar utgör standardavvikelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg"> Figur 3: Tillväxtkurvor av E. coli O157 stam 3081 stammar. Varje kurva representerar individuella och blandade kulturer, behandlas och behandlas inte med fager över MOIs. Uppgifterna sammanställdes från två oberoende försök. Staplar visar medelvärdets standardfel (anpassat från Referens9 med tillstånd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Tabell 1: Oddskvoter som jämför sannolikheten för överlägsen fagereffekt mot E. coli O157 vid inkubationstemperaturer, inkubationstider, MOI, fager och stammar av E. coli O157 (anpassad från Reference9 med tillstånd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 2: Total fagereffekt mot E. coli O157 vid 37 °C (anpassad från Reference9 med tillstånd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 3: Total fagereffekt mot E. coli O157 vid 22 °C (anpassad från Reference9 med tillstånd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Kompletterande siffror 1-11: Ögonblicksbilder av mikroplattans läsares funktion och procedurer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings at JoVE.com

Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

Detta protokoll beskriver en robust metod för att använda inställningar med hög genomströmning för att screena den antibakteriella effekten av bakteriofagcocktails.

Bakteriofag effektivitet för Biocontrol av livsmedelsburna patogener utvärderas via höggenomströmningsinställningar

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

Detta lättanvända protokoll utvärderar den antibakteriella effekten av olika bakteriofagkombinationer, även kända som fagcocktails, under olika förhållanden i en hög genomströmningsinställning. De främsta fördelarna med tekniken är förmågan att strömma olika biotika och abiotiska faktorer, såsom temperatur, som kan påverka fageffektiviteten under en rad olika miljöförhållanden. Denna metod kan underlätta utformningen av lämpliga fagercocktails för att förbättra biokontroller och terapeutiska resultat och bestämma interaktionen mellan bakteriella värdar och bakteriofager.Till att börja med ställer du in mikroplattans analys med filtrerade spetsar för att undvika korskontaminering. Tillsätt först 180 mikroliter mTSB i brunnarna i kolumnerna ett till 12 av 96-brunnsmikroplattan och förbered sedan seriella tiofaldiga utspädningar av varje i kolumnerna en till åtta av de sterila 96-brunnsmikroplattorna för att ställa in analysen. Tillsätt 20 mikroliter av enskilda fager eller fagcocktails till brunnar en till åtta av den översta raden A på mikroplattan.För fagfri och tom kontroll, lägg till 20 mikroliter mTSB i den övre brunnen i kolumnerna nio till 12. Blanda brunnsinnehållet med skonsam och upprepad aspiration minst fem gånger vid pipettering och byt spetsar mellan utspädningar. Ta bort 20 mikroliter från sista raden H och sätt sedan upp en reservoar för den testade bakteriestammen genom att överföra två till tre milliliter av den utspädda kulturen till behållaren med en en milliliter pipett.Använd en flerkanalspipett, tillsätt 20 mikroliter av den utspädda bakteriekulturen till varje brunn i kolumnerna ett till 10 medan du byter tips mellan varje tillsats. Täck och inkubera mikroplattan vid 37 grader Celsius. Med två timmars mellanrum tar du bort mikroplattan från inkubatorn och läser av plattan med hjälp av en mikroplatta.Alternativt kan du inkubera plattan i en mikroplatta läsare och läsa den över tid. För att undersöka den optiska densiteten vid 600 nanometer med hjälp av en mikroplatta läsare, öppna programmet på en mikroplatta läsare. Välj enkelt läge i fönstret startalternativ och välj sedan Skapa ett nytt protokoll i Aktivitetshanteraren.I fönstret Välj plåttyp väljer du 96-brunnsplatta i listrutan. Som identifieringsmetod väljer du Absorbans för lästypen, väljer Slutpunkt/Kinetic-alternativ för optiktyp, väljer Monokromatorer och klickar sedan på OK. För Lässteg anger du 600 nanometer för våglängder, väljer Normal för läshastighet och klickar på OK.To ställer in temperaturen för analysen, klickar på kryssrutan Inkubation och välj Inkubator på.Ange önskad temperatur i temperaturrutan och klicka sedan på OK. Klicka på kryssrutan Förvärmning innan du fortsätter med nästa steg för inkubationstemperaturen på 37 grader Celsius, även om alternativet inte krävs för testförhållandena vid 22 grader Celsius. Om du vill förhindra kondens på plåtlocket under inkubation ställer du in temperaturgradienten genom att ange ett värde i övertoningsrutan och klickar sedan på OK. Klicka sedan på kryssrutan Kinetic för att öppna den kinetiska inställningen.Ställ in körtiden i 10 timmar för 37 grader Celsius inkubation eller 22 timmar för rumstemperatur och ange två timmar som läsintervall och klicka sedan på OK. Klicka på kryssrutan Skaka i procedurfönstret för att ställa in skakningsförhållandet, om det behövs för varje kinetisk läsning. Välj Linjärt som skakningsläge och ändra varaktigheten till 30 sekunder. Ange linjärt frekvensvärde till 731 cykler per minut och klicka sedan på OK.In fönstret Protokollsammanfattningsdialog, klicka på Plattlayout, välj Ämnen, Analyskontroller och Exempel och klicka på Nästa.När du har definierat inställningarna för varje brunnstyp klickar du på Slutför. Välj ett väl-ID i vänstergränssnittet, tilldela det till matrisen som visas i fönstret Plåtlayout och klicka sedan på OK. Klicka på knappen Läsplatta, spara protokollet som en prt-fil och klicka på Spara. Sätt i plattan och klicka på OK. När experimentet är klart sparar du experimentet som en xpt-fil och klickar på Spara.Exportera data till Excel genom att klicka på ja-knappen i rutan meddelandefönster för ytterligare analys. Klicka på markeringen Spara ja/nej och kryssrutan fråga inte igen för att spara inställningar. Efter protokollet utfördes en jämförelse av effekt med olika kombinationer, temperaturer, tider och multiplicity av infektioner, eller MOIs,.Baserat på denna analys maximerades anti-O157 effekt efter 14, 16 eller 18 timmar inkubation vid 22 grader Celsius. För att förstå bakteriens fager dödande kinetik plottades OD-värden på 600 nanometer mot provtagningstid, MOI och fagbehandling. De representativa bakterietillväxtkurvorna vid 37 grader Celsius behandlas visas.T4 hämmade helt bakterietillväxten vid varje provtagningstid även vid låg MOI. För att analysera hämmad bakteriell tillväxt, de genomsnittliga OD värden från alla MOIs plottades mot varje provtagning tid och behandling. De representativa graferna vid två temperaturer visade att fagdödande effekt, till exempel för T1 plus T4 förbättrades vid 22 grader Celsius jämfört med 37 grader Celsius.Jämförelsen av övergripande fageffektivitet visas, vilket underlättar identifiering av den bästa fasbehandlingen. Till exempel, för Escherichia coli stam 3081, behandling med fager T4 och T5 plus T4 var den mest effektiva behandlingen vid 37 grader Celsius. Men vid 22 grader Celsius, förutom T4, var fagen T1 plus T4, T1 plus T4 plus rV5 och fyra faagecocktails effektiva.Vid utförandet av denna procedur är extremt noggrann pipettering, särskilt vid användning av en flerkanalig pipett och enhetlighet av tillvägagångssätt, avgörande för att uppnå jämförbara och tolkningsbara resultat. Uppföljande experiment krävs för att bedöma den fortsatta prestandan hos den mest inflytelserika cocktailen i screeningen, vilket förhindrar uppkomsten av antifagmutanter i ett omfattande buljongkultursystem och andra biologiska matriser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening för brett spektrum kemiska inhibitorer av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Hög genomströmning Fluorometrisk Teknik för Bedömning av Macrophage Fagocytos och aktin polymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Hög genomströmning Gene taggning i<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hög genomströmning Upptäckt av luftvägspatogener i Animal Prover av nano PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En fluorescensbaserade lymfocyter analys Lämplig för high-throughput screening av små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En hög genomströmning plattform för Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...