Name: deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the zebrafish gastrula
Uploaded: 2021-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula at JoVE.com

نشكر إيميلي مينانت على رعاية الأسماك، ومرفق التصوير الحيوي للفنون التطبيقية، ولا سيما بيير ماهو، للمساعدة في التصوير الحي على معداتهم بدعم جزئي من ريجيون إيل دو فرانس (interDIM) ووكالة الأنباء الوطنية دي لا ريشرش (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2، ANR-10-INBS-04 France BioImaging). وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح ANR 15-CE13-0016-1، 18-CE13-0024، 20-CE13-0016، وبرنامج الاتحاد الأوروبي لأفق 2020 للبحث والابتكار بموجب اتفاق منحة ماري سكلودوسكا كوري رقم 840201، ومينيستير دي L'Enseignement Supérieur et de la Recherche والمركز الوطني للبحوث العلمية.

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل اللجنة الأخلاقية N 59 وMinistère de l'Education Nationale، دي L'Enseignement Supérieur et la Recherche تحت رقم الملف APAFIS#15859-2018051710341011v3. بعض الخطوات المذكورة أدناه محددة لمعداتنا وبرامجنا ولكن يمكن تكييفها بسهولة مع المعدات المختلفة.
1. إعداد الحقن
<ol><li>إعداد 75 م...

<ol>
	<li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+induction.">Embryonic induction.</a> Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).</li><li>Fernandez-Sanchez, M. -. E., Brunet, T., R&#246;per, J. -. C., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction's+impact+on+animal+development,+evolution,+and+tumorigenesis.">Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).</li><li>Shih, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+zebrafish+organizer:+microsurgical+analysis+at+the+early-shield+stage.">Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage.</a> Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).</li><li>Selleck, M. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+microsurgical+manipulation+of+the+early+avian+embryo.">Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).</li><li>Bulina, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photosensitizer.">A genetically encoded photosensitizer.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 95-99 (2006).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+diffraction+limited+nanosurgery+of+live+biological+tissues.">Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues.</a> Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).</li><li>Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+laser+ablation+to+measure+cell+and+tissue-generated+forces+in+the+zebrafish+embryo+in+vivo+and+ex+vivo.">UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 219-235 (2015).</li><li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation.">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li><li>Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscope-based+laser+ablation+and+regeneration+assay+in+zebrafish+interneuromast+cells.">Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).</li><li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling.">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).</li><li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition - Four Volume Set. , (2019).</li><li>Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioimaging:+second+window+for+in+vivo+imaging.">Bioimaging: second window for in vivo imaging.</a> Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Theveneau, E., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrations+cellulaires+collectives.">Migrations cellulaires collectives.</a> Medecine/Sciences. 30 (8-9), 751-757 (2014).</li><li>Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+mesendoderm+migration+relies+on+an+intrinsic+directionality+signal+transmitted+through+cell+contacts.">Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).</li><li>Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+things:+cell+fates+and+cell+movements+during+early+embryogenesis+of+zebrafish.">Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish.</a> BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).</li><li>Montero, J. -. A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+3-kinase+is+required+for+process+outgrowth+and+cell+polarization+of+gastrulating+mesendodermal+cells.">Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells.</a> Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).</li><li>Ulrich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slb/Wnt11+controls+hypoblast+cell+migration+and+morphogenesis+at+the+onset+of+zebrafish+gastrulation.">Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation.</a> Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).</li><li>Kai, M., Heisenberg, C. -. P., Tada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+individual+cell+behaviours+underlying+the+directed+migration+of+prechordal+plate+progenitor+cells+during+zebrafish+gastrulation.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation.</a> Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).</li><li>Smutny, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction+forces+position+the+neural+anlage.">Friction forces position the neural anlage.</a> Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).</li><li>Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dkk1+controls+cell-cell+interaction+through+regulation+of+non-nuclear+&#946;-Catenin+pools.">Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear &#946;-Catenin pools.</a> Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).</li><li>Gorelik, R., Gautreau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+unbiased+analysis+of+directional+persistence+in+cell+migration.">Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).</li><li>Grill, S. W., Howard, J., Sch&#228;ffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+active+force+generators+controls+mitotic+spindle+position.">The distribution of active force generators controls mitotic spindle position.</a> Science. 301 (5632), 518-521 (2003).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -. A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Farhadifar, R., R&#246;per, J. -. C., Aigouy, B., Eaton, S., J&#252;licher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Foundations of Experimental Embryology. , (1964).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Bosze, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pcdh18a+regulates+endocytosis+of+E-cadherin+during+axial+mesoderm+development+in+zebrafish.">Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish.</a> Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).</li></ol>

هنا، نقوم بوصف بروتوكول يستخدم البصريات غير الخطية لإجراء عمليات استئصال حجم عميقة ومحددة مكانيا. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي العثور على ظروف العلاج التي توفر الطاقة الكافية للسماح بالاجتثاث ، ولكن ليس الكثير من الطاقة ، لتجنب الحطام المفرط أو التجويف. تعتمد كمية الطاقة المسلمة...

تلعب التفاعلات بين الخلية والخلية أدوارا حيوية في التنمية. توفر الخلايا إشارات يمكن لجيرانها المباشرين، أو الخلايا البعيدة، إدراكها، وبالتالي التأثير على مصيرهم و/أو سلوكهم. العديد من هذه الإشارات هي كيميائية في طبيعتها. على سبيل المثال، في أحداث التعريفية ذات الخصائص الجيدة، تنتج مجموعة خلايا واحدة جزيئات قابلة للنشر تؤثر على مصير مجموعة خلايا أخرى1. غير أن الإشارات الأخرى ميكانيكية؛ الخلايا تمارس القوات والقيود على جيرانهم، والتي يرى الجيران والرد على2.
إحدى الطرق لدراسة أهمية هذه التفاعلات بين الخلية والخلية في الجسم الحي هي القضاء على بعض الخلايا ومراقبة التطور اللاحق. لسوء الحظ، التقنيات المتاحة لإزالة أو تدمير الخلايا محدودة. يمكن إزالة الخلايا جراحيا3,4، باستخدام الإبر أو الأسلاك الصغيرة، ولكن هذه العلاجات الغازية، ليست دقيقة جدا، وعادة ما يتم تنفيذها تحت منظار مجسم، ومنع التصوير الفوري تحت المجهر. وعلاوة على ذلك، فإن استهداف الخلايا العميقة يعني ثقب ثقب في الأنسجة المفرطة، وخلق الاضطرابات غير المرغوب فيها. وقد استخدمت الحساسات الضوئية المشفرة وراثيا، مثل KillerRed، للحث على موت الخلايا عن طريق الإضاءة الخفيفة5. الحساسات الضوئية هي الكروموفوريس التي تولد أنواع الأكسجين التفاعلية عند تشعيع الضوء. الحد الرئيسي هو أنها تتطلب إضاءات ضوئية طويلة (حوالي 15 دقيقة) ، والتي قد يكون من الصعب تحقيقها إذا كانت الخلايا تتحرك ، وأنها تحفز موت الخلايا من خلال موت الخلايا المبرمج ، وهو أمر غير فوري.
وأخيرا، تم تطوير عمليات الاستئصال بالليزر واستخدامها على نطاق واسع في السنوات ال 15 الماضية6,7,8,9,10,11,12. ويركز شعاع الليزر على الخلية المستهدفة / الأنسجة. فإنه يحفز الاستئصال من خلال التدفئة, الاجتثاث الضوئي, أو الاستئصال الناجم عن البلازما; تعتمد العملية المعنية على كثافة الطاقة ووقت التعرض13. معظم بروتوكولات الاستئصال استخدام أشعة الليزر للأشعة فوق البنفسجية لطاقتها العالية. ومع ذلك، يتم امتصاص ضوء الأشعة فوق البنفسجية على حد سواء وتناثرها من قبل الأنسجة البيولوجية. وبالتالي ، فإن استهداف الخلايا العميقة يتطلب طاقة ليزر عالية ، مما يؤدي بعد ذلك إلى أضرار في أنسجة أكثر سطحية وخارج الطائرة. وهذا يحد من استخدام أشعة الليزر فوق البنفسجية إلى هياكل سطحية ويفسر دقة المحورية منخفضة نسبيا. البصريات غير الخطية (ما يسمى المجهر اثنين فوتون) يستخدم خصائص غير خطية للضوء لإثارة الفلوروفور مع اثنين من فوتونات من نصف الطاقة تقريبا في مجال الأشعة تحت الحمراء. عند تطبيقها على الاستئصال ، وهذا له ثلاث مزايا رئيسية. أولا، ضوء الأشعة تحت الحمراء أقل تشتتا وأقل امتصاصا من الأشعة فوق البنفسجية بواسطة الأنسجة البيولوجية14، مما يسمح بالوصول إلى هياكل أعمق دون زيادة قوة الليزر المطلوبة. ثانيا، استخدام ليزر نبضي femtosecond يوفر كثافات طاقة عالية جدا، وخلق الاستئصال من خلال التعريفي البلازما، والتي، خلافا للتدفئة، لا تنتشر مكانيا15. ثالثا، يتم الوصول إلى كثافة الطاقة التي تحفز تكوين البلازما في نقطة الاتصال فقط. وبفضل هذه الخصائص، يمكن استخدام استئصال الليزر ثنائي الفوتون لاستهداف الخلايا العميقة بدقة دون التأثير على بيئة الأنسجة المحيطة.
الهجرات الجماعية هي مثال ممتاز على العمليات التنموية التي تكون فيها التفاعلات بين الخلية والخلية أساسية. يتم تعريف الهجرات الجماعية على أنها هجرات الخلايا التي تؤثر فيها الخلايا المجاورة على سلوك الخلية الواحدة16. ويمكن أن تختلف طبيعة هذه التفاعلات (الكيميائية أو الميكانيكية) وكيفية تأثيرها على هجرة الخلايا اختلافا كبيرا وغالبا ما لا تكون مفهومة تماما. القدرة على إزالة الخلايا ومراقبة كيفية تأثير ذلك على الآخرين أمر بالغ الأهمية في زيادة كشف هذه العمليات الجماعية. قبل بضع سنوات، أثبتنا - باستخدام النهج الجراحية - أن هجرة البولستر أثناء تخثر سمك الحمار الوحشي هي هجرة جماعية17. بولستر هو مجموعة من الخلايا التي تشكل أول خلايا استيعاب على الجانب الظهري من الجنين18. هذه الخلايا، وصفت باللون الأخضر في خط Tg(gsc:GFP) المعدلة وراثيا، وتقع في عمق الجنين، تحت عدة طبقات من الخلايا epiblast. أثناء الاختراق ، تقود هذه المجموعة تمديد المحور المحوري ، والهجرة من المنظم الجنيني إلى القطب الحيواني19،20،21،22،23 (الشكل 1A). لقد أثبتنا أن الخلايا تتطلب الاتصال مع جيرانها لتوجيه هجرتهم في اتجاه القطب الحيواني. ومع ذلك، فإن فهم الأسس الخلوية والجزيئية لهذه الهجرة الجماعية بشكل أفضل ينطوي على إزالة بعض الخلايا لمعرفة كيف يؤثر ذلك على الخلايا المتبقية. لذلك ، قمنا بتطوير عمليات استئصال من كميات كبيرة وعميقة باستخدام إعداد مجهري ثنائي الفوتون. هنا، نحن نظهر استخدام هذا البروتوكول لقطع بولستر في وسطه ومراقبة العواقب على هجرة الخلايا عن طريق تتبع نواة المسمى مع Histone2B-mCherry.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A8963,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software : Matlab</td>
			<td>Math Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-optic modulator (EOM)</td>
			<td>ConOptics</td>
			<td>350-80LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Medium (EM) solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201-T-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM driver</td>
			<td>ConOptics</td>
			<td>302RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>300085</td>
			<td>Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Tip should be fire polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green/ablation laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td>Mai Tai HP DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone2B-mCherry mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier&#38; al. 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software: IMARIS</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector software</td>
			<td>Abberior Instruments Development Team</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection mold</td>
			<td>Adapative Science Tools</td>
			<td>I-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube (PMT)</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>H7422-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPump (Air injector)</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td>OPO/Insight DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water for injection</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software: Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(gsc:GFP) zebrafish line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647&#8211;59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope II microscope</td>
			<td>La Vision Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the zebrafish gastrula

مورفوجينيسيس ينطوي على العديد من حركات الخلايا لتنظيم الخلايا في الأنسجة والأعضاء. ومن أجل التنمية السليمة، يجب تنسيق جميع هذه الحركات بإحكام، وتشير الأدلة المتراكمة إلى أن ذلك يتحقق، على الأقل جزئيا، من خلال التفاعلات الميكانيكية. اختبار هذا في الجنين يتطلب الاضطرابات الجسدية المباشرة. الاستئصال بالليزر هي خيار يستخدم بشكل متزايد الذي يسمح بتخفيف القيود الميكانيكية أو عزل جسديا اثنين من مجموعات الخلايا من بعضها البعض. ومع ذلك ، يتم إجراء العديد من عمليات الاستئصال باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية (UV) ، والذي يوفر دقة محورية محدودة واختراق الأنسجة. يتم وصف طريقة هنا ل ablate عميقة، كبيرة، وأحجام محددة بشكل جيد مكانيا باستخدام المجهر اثنين الفوتون. يتم عرض الاستئصالات في خط حمار وحشي معدل وراثيا يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في mesendoderm المحوري ويستخدم لقطع mesendoderm المحوري دون التأثير على ectoderm المفرط أو خلية الصفار الأساسية. يتم مراقبة سلوك الخلية عن طريق التصوير الحي قبل وبعد الاستئصال. يمكن استخدام بروتوكول الاستئصال في مراحل نمو مختلفة، على أي نوع من الخلايا أو الأنسجة، على نطاقات تتراوح بين بضعة ميكرونات إلى أكثر من مائة ميكرون.

لقطع بولستر في وسطه، تم تركيب جنين Tg (gsc:GFP)، الذي تم حقنه مع الهستون2B-mCherry mRNAs في مرحلة epiboly 70٪، كما هو موضح في الخطوة 4. تم التعرف على بولستر بواسطة التعبير GFP، وتم تركيب الجنين بحيث يكون مستوى بولستر عموديا على المحور البصري (الشكل 1B). إن إمالة الجنين بعيدا عن هذا الوضع سوف...

Watch this Scientific Journal Video about Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula at JoVE.com

Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula

يتطلب التطور الجنيني تنسيقا واسع النطاق لحركة الخلية. يسمح الإثارة ثنائية الفوتونيز بالاجتثاث بالليزر بوساطة الاستئصال ثلاثي الأبعاد الذي يتم التحكم فيه مكانيا لمجموعات كبيرة من الخلايا العميقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه التقنية التحقيق في رد فعل الخلايا المهاجرة بشكل جماعي في الجسم الحي للاضطرابات في بيئتها الميكانيكية.

عمليات الاستئصال العميقة والتحكم المكانية في الحجم باستخدام مجهر فوتونين في زيبرافيش غاسترولا

Morphogenesis involves many cell movements to organize cells into tissues and organs. For proper development, all these movements need to be tightly ...

داخل الأجنة، تتفاعل الخلايا مع بعضها البعض، وتبادل المعلومات الكيميائية والميكانكية. إحدى الطرق الفعالة للتحقيق في هذه التفاعلات هي قتل بعض الخلايا ورصد العواقب على الخلايا المجاورة. الطريقة التي نصفها تسمح لنا بمحض الخلايا بدقة، حتى داخل الجنين، دون الإضرار بالأنسجة المجاورة.قم بإعداد مجهر الفوتونين من خلال ضبط الليزر الأول على الطول الموجي للاجتثاث 820 نانومتر، والليزر الثاني إلى الطول الموجي للتصوير mCherry 1، 160 نانومتر. باستخدام المرايا المنقولة على المسار البصري، ومحاذاة شعاعي الليزر عند دخول وخروج رؤساء المسح الضوئي، ثم قياس الطاقة القصوى لليزر الأول في 820 نانومتر. ضع عداد الطاقة تحت الهدف، وأغلق الغرفة السوداء، وحدد طاقة الليزر الأولى إلى 100٪ ابدأ جمع البيانات على مقياس الطاقة، وفتح مصراع الليزر ثم قياس قوة الإخراج وحساب النسبة المئوية لطاقة الليزر اللازمة للوصول إلى 300 ملليواط.تعيين الليزر الأول إلى الطول الموجي GFP الإثارة من 920 نانومتر والطاقة إلى 7٪ ضبط طاقة الليزر الثانية إلى 15٪ تنشيط كاشفات PMT للخطوط الخضراء والحمراء، وتعيين حساسية PMT الخط الأخضر والأحمر إلى 65. ضبط مجال الرؤية إلى 400 في 400 ميكرومتر، ودقة الصورة إلى 512 في 512 بكسل، وتردد المسح الضوئي إلى 800 هيرتز. حدد وضع التصوير الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد، ثم أنشئ مجلدا وقم بتنشيط الحفظ التلقائي لحفظ البيانات بعد كل عملية استحواذ.تجميع غرفة التدفئة وتعيينها إلى 28 درجة مئوية. انتظر ما لا يقل عن 10 دقائق للغرفة والهدف من ذلك إلى الحارة. تحت منظار مجسم مفلور، حدد الأجنة بنسبة 70٪ من البشرة التي تعبر عن GFP.و, باستخدام ماصة باستور البلاستيك, نقل ثلاثة إلى أربعة أجنة مختارة في طبق المغلفة agarose و dechorionate بعناية لهم مع ملقط غرامة. في قارورة زجاجية صغيرة، أضف ملليلتر واحد من محلول من بينسلين-ستربتوميسين الجنين المتوسطة التي تحتوي على 2٪agarose، ووضع القارورة في سخان كتلة جافة مسخنة مسبقا في 42 درجة مئوية. باستخدام ماصة زجاجية مصقولة بالنار ، قم بنقل جنين مهتبس إلى القارورة ، مع الحرص على عدم إضافة الكثير من وسيط الجنين إلى الآغروز.تجاهل المتوسط الجنين المتبقية من ماصة. يستنشق الجنين مرة أخرى، جنبا إلى جنب مع ما يكفي من الآغاروز لتغطية الشريحة من طبق أسفل الزجاج. قم بتفجير الآغاروز مع الجنين على الشريحة الزجاجية للطبق ، مما يضمن عدم لمس الجنين للهواء أو الجانب البلاستيكي من الطبق.ثم، ملء الغرفة حول الشريحة الزجاجية مع agarose. باستخدام رمش، وتوجيه الجنين بحيث تكون المنطقة المستهدفة في الجزء العلوي. بعد خمس دقائق، عندما يتم تعيين agarose تماما، إضافة بضع قطرات من البنسلين-streptomycin الجنين المتوسطة إلى الشريحة الزجاجية.ضع طبق القاع الزجاجي تحت الهدف في الغرفة الساخنة. تزج الهدف في المتوسطة الجنين البنسلين-streptomycin قبل إغلاق الغرفة. حرك شريط التمرير لتعيين مسار الضوء إلى العينين.تشغيل مصباح الفلورسينس. العثور على الجنين وتعيين التركيز على سطحه. قم بإيقاف تشغيل المصباح الفلوري وحدد مسار الضوء إلى PMTs قبل إغلاق الغرفة السوداء.بدء التصوير الحي وتحديد موقع mesoderm المحورية. للحصول على إشارة جيدة، قم بضبط قوى الليزر. استخدم القناة الحمراء لنقل المرحلة إلى أعلى الجنين، وقم بتعيين هذا الموضع على أنه Z يساوي صفرا.اختر خطوة زمنية دقيقة واحدة وخطوة Z من ميكرومترين. تعيين الشريحة الأولى في 15 ميكرومتر فوق mesoderm المحوري، والشريحة الأخيرة في 15 ميكرومتر تحت mesoderm المحوري. سجل 10 إلى 15 دقيقة من فيلم ما قبل الاستئصال.على التصوير الحي، حدد موقع كفاف بولستر، ثم، وذلك باستخدام المنطقة المغير الكهربائي البصري من الفائدة، أو أداة EOM-ROI، رسم مستطيل 20 بكسل كبيرة التي تمتد عرض بولستر، ووضع المستطيل في منتصف بولستر. لاحظ الموضع المحوري للطائرات الأعلى والأدنى التي سيتم اجتثاثها ، مما يضمن عدم تداخل عائد الاستثمار مع خلية الصفار على أي من الطائرات. ضع المرحلة في أدنى وضع Z ليتم اجتثاثها.تعيين الطول الموجي ليزر الأول إلى 820 نانومتر وأدخل نسبة الطاقة كما حسبت في وقت سابق للحصول على قوة الخروج من 300 مللي واط. تعيين تردد التصوير إلى 200 هيرتز وأول تصوير ليزر EOM إلى الصفر. بعد تحديد وضع علاج عائد الاستثمار، قم بإيقاف تشغيل EOM، ثم قم بتعيين المعالجة لبدء التشغيل مباشرة بعد الإطار الصفري.وضع وضع التصوير إلى الفاصل الزمني وتعطيل الحفظ التلقائي. بعد تحديد الوضع السريع في الخطوة الزمنية، قم بضبط عدد إطارات المعالجة وعدد الإطارات إلى القيمة المقابلة للعمق المستهدف. بدء التصوير.يجب أن يكون الاستحواذ أسود ، حيث يغلق الغالق إلى PMT أثناء علاج EOM. بعد ذلك ، انتقل إلى أعلى المسرح إلى وضع Z التالي ، وبالمثل قم بإجراء الاستئصال. كرر على كل موقف Z حتى يتم التوصل إلى الجزء العلوي من بولستر.عند اكتمال عملية الاستئصال، قم بضبط أول ليزر على 920 نانومتر واضبط على قوة التصوير التي تم اختيارها مسبقا. وضع أول التصوير بالليزر EOM إلى 100 واختيار وضع الحقل الكامل. يجب أن يكون تردد التصوير 800 هيرتز، وينبغي إيقاف EOM قبل فحص المكدس بأكمله في الوضع المباشر للتحقق مما إذا كان قد تم استئصال كل طائرة.بمجرد تأكيد الاستئصال، حدد الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد كوضع التصوير. إعادة تنشيط الحفظ التلقائي، وبدء تسجيل فيلم ما بعد الاستئصال لمدة 40 إلى 60 دقيقة. في فيلم ما بعد الاستئصال، تحقق مما إذا كانت الخلايا المستهدفة قد تم استئصالها بشكل فعال.كما الاستئصال عبر polsters لا ينبغي أن تضر الأجنة، يمكن ملاحظة مورفولوجيا طبيعية من الأجنة المبلد في 24 ساعة بعد الإخصاب. في النتيجة الناجحة للاجتثاث بالليزر ، لم تتأثر الأنسجة المتراكبة باجتثاث الهياكل الأساسية. أدى العلاج المكثف للغاية ، أو القليل جدا من العلاج ، إلى فشل في استئصال الليزر.مثال على الاستئصال غير الناجح يظهر الخلايا فوق بولستر يجري ablated، وهو ما كان واضحا من الحطام autofluorescent في الطائرة المحورية فوق بولستر. وفي محاولة أخرى غير فعالة، تم تبييض الخلايا ولكن ليس اجتثاثها، ولا تزال الإشارات الفلورية المنخفضة تكشف عن ملامح الخلية السليمة. وأخيرا، لم يتم حتى تبييض بعض الخلايا بسبب عدم كفاية العلاج بالليزر.يرجع تكوين الفقاعات إلى التجويف الناجم عن علاج ليزر مكثف للغاية. تم التقاط مداخن Z كل دقيقة لمدة 40 دقيقة في استئصال ناجح ، وتسجيل كل من GFP السيتوبلازمية وإشارات mCherry النووية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وضع علامة على النوى التي تنتمي إلى النصف الأمامي من البولستر بنقطة أرجوانية وتتبعها بمرور الوقت ، قبل وبعد الاستئصال.وكمقياس لاستمرار الهجرة، تمت دراسة الارتباط التلقائي اتجاه الخلايا قبل وبعد الاستئصال. وأظهرت الخلايا التي تنتمي إلى الجزء الأمامي من بولستر حركة مستمرة قبل الاستئصال، والتي تنخفض بشكل كبير بعد الاستئصال، مما يشير إلى فقدان الهجرة الجماعية الموجهة. محاذاة الليزر بشكل صحيح وقياس قوة الليزر أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ.كما أنه من المهم التحقق من كفاءة الاستئصال في الصور الأولى بعد الاجتثاث. نحن نستخدم عمليات الاستئصال بالليزر للتشكيك في دور التفاعلات بين الخلايا في توجيه هجرة الخلايا داخل الجنين. ولكن يمكن تكييف الإجراء بسهولة مع العديد من الأسئلة الأخرى حيث تحتاج الخلايا أو الأنسجة إلى الاجتثاث بدقة ، وربما عميقة في الكائن الحي.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

قياس الاستقرار البروتين المتواجد في الحي اسماك الزرد الأجنة عن طريق الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

عن طريق الاستجابة أثار اللمس والحركة فحوصات لتقييم أداء العضلات وظيفة في الزرد

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...