Name: deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the zebrafish gastrula
Uploaded: 2021-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula at JoVE.com

אנו מודים לאמילי מננט על טיפול בדגים, למתקן הביו-הדמיה הפוליטכני, ובמיוחד לפייר מהו, על הסיוע בהדמיה חיה על הציוד שלהם שנתמך בחלקו על ידי Région Ile-de-France (ביניים) ו- Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 צרפת BioImaging). עבודה זו נתמכה על ידי מענקי ANR 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016, ותוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי תחת הסכם המענק מארי Skłodowska-Curie No 840201, המיניסטר דה ל'אנסנסיגנציה Supérieur et de la Recherche והמרכז הלאומי דה לה רשצ'ה סיאנטיפיק.

כל עבודות החיות אושרו על ידי ועדת האתיקה N 59 ו Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche תחת מספר הקובץ APAFIS#15859-2018051710341011v3. חלק מהצעדים המתוארים להלן ספציפיים לציוד ולתוכנה שלנו, אך ניתן להתאים אותם בקלות לציוד שונה.
1. הכנת הזרקה
<ol><li>הכן 75 מ"ל של 1% תמיסה אגרוז בעובר בינוני...

<ol>
	<li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+induction.">Embryonic induction.</a> Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).</li><li>Fernandez-Sanchez, M. -. E., Brunet, T., R&#246;per, J. -. C., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction's+impact+on+animal+development,+evolution,+and+tumorigenesis.">Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).</li><li>Shih, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+zebrafish+organizer:+microsurgical+analysis+at+the+early-shield+stage.">Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage.</a> Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).</li><li>Selleck, M. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+microsurgical+manipulation+of+the+early+avian+embryo.">Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).</li><li>Bulina, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photosensitizer.">A genetically encoded photosensitizer.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 95-99 (2006).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+diffraction+limited+nanosurgery+of+live+biological+tissues.">Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues.</a> Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).</li><li>Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+laser+ablation+to+measure+cell+and+tissue-generated+forces+in+the+zebrafish+embryo+in+vivo+and+ex+vivo.">UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 219-235 (2015).</li><li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation.">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li><li>Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscope-based+laser+ablation+and+regeneration+assay+in+zebrafish+interneuromast+cells.">Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).</li><li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling.">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).</li><li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition - Four Volume Set. , (2019).</li><li>Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioimaging:+second+window+for+in+vivo+imaging.">Bioimaging: second window for in vivo imaging.</a> Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Theveneau, E., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrations+cellulaires+collectives.">Migrations cellulaires collectives.</a> Medecine/Sciences. 30 (8-9), 751-757 (2014).</li><li>Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+mesendoderm+migration+relies+on+an+intrinsic+directionality+signal+transmitted+through+cell+contacts.">Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).</li><li>Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+things:+cell+fates+and+cell+movements+during+early+embryogenesis+of+zebrafish.">Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish.</a> BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).</li><li>Montero, J. -. A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+3-kinase+is+required+for+process+outgrowth+and+cell+polarization+of+gastrulating+mesendodermal+cells.">Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells.</a> Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).</li><li>Ulrich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slb/Wnt11+controls+hypoblast+cell+migration+and+morphogenesis+at+the+onset+of+zebrafish+gastrulation.">Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation.</a> Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).</li><li>Kai, M., Heisenberg, C. -. P., Tada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+individual+cell+behaviours+underlying+the+directed+migration+of+prechordal+plate+progenitor+cells+during+zebrafish+gastrulation.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation.</a> Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).</li><li>Smutny, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction+forces+position+the+neural+anlage.">Friction forces position the neural anlage.</a> Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).</li><li>Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dkk1+controls+cell-cell+interaction+through+regulation+of+non-nuclear+&#946;-Catenin+pools.">Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear &#946;-Catenin pools.</a> Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).</li><li>Gorelik, R., Gautreau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+unbiased+analysis+of+directional+persistence+in+cell+migration.">Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).</li><li>Grill, S. W., Howard, J., Sch&#228;ffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+active+force+generators+controls+mitotic+spindle+position.">The distribution of active force generators controls mitotic spindle position.</a> Science. 301 (5632), 518-521 (2003).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -. A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Farhadifar, R., R&#246;per, J. -. C., Aigouy, B., Eaton, S., J&#252;licher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Foundations of Experimental Embryology. , (1964).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Bosze, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pcdh18a+regulates+endocytosis+of+E-cadherin+during+axial+mesoderm+development+in+zebrafish.">Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish.</a> Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).</li></ol>

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המשתמש באופטיקה לא ליניארית כדי לבצע אבלציות נפח עמוקות ומוגדרות היטב. השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא למצוא תנאי טיפול המספקים מספיק אנרגיה כדי לאפשר אבלציות, אבל לא יותר מדי אנרגיה, כדי למנוע פסולת מוגזמת או cavitation. כמות האנרגיה המועברת באתר היעד תלויה בעיקר ב:...

אינטראקציות בין תאים ממלאות תפקידים חיוניים בהתפתחות. תאים מספקים אותות לכך שהשכנים הישירים שלהם, או התאים רחוקים יותר, יכולים לתפוס, ובכך להשפיע על גורלם ו /או התנהגותם. רבים מהאותות האלה הם כימיים בטבע. לדוגמה, באירועי אינדוקציה מאופיינים היטב, קבוצת תאים אחת מייצרת מולקולות מפוזרות המשפיעות על גורלה של אוכלוסיית תאים אחרת1. אותות אחרים, לעומת זאת, הם מכניים; תאים מפעילים כוחות ואילוצים על שכניהם, שהשכנים תופסים ומגיבים ל2.
דרך אחת ללמוד את החשיבות של אינטראקציות תא-תאים אלה ב vivo היא לחסל כמה תאים ולבחון את ההתפתחות הבאה. למרבה הצער, הטכניקות הזמינות כדי להסיר או להרוס תאים מוגבלים. תאים ניתן להסיר בניתוח3,4, באמצעות מחטים או חוטים קטנים, אבל טיפולים כאלה הם פולשניים, לא מדויקים מאוד, ובדרך כלל מבוצעים תחת סטריאוטיקרוסקופ, מניעת הדמיה מיידית תחת מיקרוסקופ. יתר על כן, מיקוד תאים עמוקים מרמז פירסינג חור ברקמות overlying, יצירת מוטרדים לא רצויים. רגישים לאור מקודדים גנטית, כגון KillerRed, שימשו כדי לגרום למוות תאים באמצעות תאורת אור5. רגישים לאור הם כרומופורים המייצרים מינים של חמצן תגובתי על הקרנת אור. המגבלה העיקרית שלהם היא שהם דורשים תאורת אור ארוכה (סביב 15 דקות), אשר עשוי להיות קשה להשיג אם תאים נעים, וכי הם לגרום למוות תאים באמצעות אפופטוזיס, אשר אינו מיידי.
לבסוף, אבלציות לייזר פותחו בשימוש נרחב ב -15 השנים האחרונות6,7,8,9,10,11,12. קרן לייזר מתמקדת בתא/רקמה הממוקדים. זה גורמת אבלציה שלה באמצעות חימום, photoablation, או אבלציה הנגרמת על ידי פלזמה; התהליך המעורב תלוי בצפיפות הכוח וזמן החשיפה13. רוב פרוטוקולי אבלציה להשתמש לייזרי UV עבור האנרגיה הגבוהה שלהם. עם זאת, אור UV נספג ומפוזר על ידי רקמות ביולוגיות. לכן, מיקוד תאים עמוקים דורש כוח לייזר גבוה, אשר לאחר מכן גורמת נזקים ברקמות שטחיות יותר, מחוץ למטוס. זה מגביל את השימוש בלייזר UV למבנים שטחיים ומסביר את הרזולוציה האקסית הנמוכה יחסית שלהם. אופטיקה לא ליניארית (מה שנקרא מיקרוסקופיה דו-פוטונית) משתמשת במאפיינים לא ליניאריים של אור כדי לרגש פלואורופור עם שני פוטונים של כחצי אנרגיה בתחום האינפרא אדום. כאשר מוחל על אבלציות, יש לזה שלושה יתרונות עיקריים. ראשית, אור האינפרא אדום מפוזר פחות ונספג פחות מאור UV על ידי רקמות ביולוגיות14, ומאפשר להגיע למבנים עמוקים יותר מבלי להגדיל את כוח הלייזר הנדרש. שנית, השימוש בלייזר פעום פמטו-שניות מספק צפיפות הספק גבוהה מאוד, ויוצר אבלציה באמצעות אינדוקציה של פלזמה, אשר, בניגוד לחימום, אינו מתפזר מרחבי15. שלישית, צפיפות הכוח הגורמת להיווצרות פלזמה מגיעה בנקודת המוקד בלבד. הודות למאפיינים אלה, ניתן להשתמש בבלציות לייזר של שני פוטונים כדי למקד במדויק תאים עמוקים מבלי להשפיע על סביבת הרקמה שמסביב.
הגירות קולקטיביות הן דוגמה מצוינת לתהליכים התפתחותיים שבהם אינטראקציות בין תאים הן בסיסיות. העברות קולקטיביות מוגדרות כהעברות תאים שבהן תאים שכנים משפיעים על אופן הפעולה של תא אחד16. אופי האינטראקציות הללו (כימיות או מכניות) וכיצד הן משפיעות על נדידת תאים יכולים להשתנות מאוד ולעתים קרובות אינו מובן לחלוטין. היכולת להסיר תאים ולבחון כיצד זה משפיע על האחרים היא קריטית בפענוח נוסף של תהליכים קיבוציים אלה. לפני מספר שנים קבענו — באמצעות גישות כירורגיות — שהנדידה של הפוסטר במהלך בגרות דגי הזברה היא נדידה קולקטיבית17. הפולסטר הוא קבוצה של תאים המהווה את התאים ההפנמה הראשונה בצד העור של העובר18. תאים אלה, המסומנים בירוק בקו הטרנסגני Tg(gsc:GFP), ממוקמים עמוק בעובר, מתחת למספר שכבות של תאי אפיבלסט. במהלך ההסתעפות, קבוצה זו מובילה את הרחבת המסודרמה צירית, נודדת מהמארגן העוברי לקוטב החייתי19,20,21,22,23 (איור 1A). קבענו שתאים דורשים מגע עם שכניהם כדי לכוון את נדידתם לכיוון עמוד החיה. עם זאת, הבנה טובה יותר של הבסיסים התאיים והמולקולריים של הגירה קולקטיבית זו כרוכה בהסרת תאים מסוימים כדי לראות כיצד זה משפיע על הנותרים. לכן פיתחנו אבלציות של נפחים גדולים ועמוקים באמצעות מערך מיקרוסקופיה של שני פוטונים. כאן, אנו מדגימים את השימוש בפרוטוקול זה כדי לנתק את הפולסטר באמצעו ולבחון את ההשלכות על נדידת תאים על ידי מעקב אחר גרעינים המסומנים עם Histone2B-mCherry.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A8963,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software : Matlab</td>
			<td>Math Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-optic modulator (EOM)</td>
			<td>ConOptics</td>
			<td>350-80LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Medium (EM) solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201-T-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM driver</td>
			<td>ConOptics</td>
			<td>302RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>300085</td>
			<td>Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Tip should be fire polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green/ablation laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td>Mai Tai HP DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone2B-mCherry mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier&#38; al. 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software: IMARIS</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector software</td>
			<td>Abberior Instruments Development Team</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection mold</td>
			<td>Adapative Science Tools</td>
			<td>I-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube (PMT)</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>H7422-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPump (Air injector)</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td>OPO/Insight DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water for injection</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software: Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(gsc:GFP) zebrafish line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647&#8211;59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope II microscope</td>
			<td>La Vision Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the zebrafish gastrula

מורפוגנזה כרוכה בתנועות תאים רבות כדי לארגן תאים לתוך רקמות ואיברים. לפיתוח תקין, כל התנועות האלה צריכות להיות מתואמות היטב, וצבירת ראיות מצביעה על כך שזה מושג, לפחות בחלקו, באמצעות אינטראקציות מכניות. בדיקת זה בעובר דורשת בעיות פיזיות ישירות. אבלציות לייזר הן אפשרות בשימוש הולך וגדל המאפשרת להקל על אילוצים מכניים או בידוד פיזי של שתי אוכלוסיות תאים זו מזו. עם זאת, אבלציות רבות מבוצעות עם לייזר אולטרה סגול (UV), המציע רזולוציה צירית מוגבלת וחדירת רקמות. שיטה מתוארת כאן כדי לנפח נפחים עמוקים, משמעותיים ומוגדרים היטב באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. אבלציות מודגמות בקו דגי זברה מהונדס המבטא את החלבון הפלואורסצנטי הירוק במסנדונדורם צירי ומשמשות לניתוק המסנדודרם צירי מבלי להשפיע על הקטודרם המשתרע יתר על המידה או על תא החלמון הבסיסי. התנהגות התא מנוטרת על-ידי הדמיה חיה לפני ואחרי אבלציה. פרוטוקול אבלציה יכול לשמש בשלבים התפתחותיים שונים, על כל סוג תא או רקמה, בקשקשים הנעים בין כמה מיקרונים ליותר ממאה מיקרון.

כדי לנתק את הפולסטר באמצעו, עובר Tg (gsc:GFP), שהוזרק עם Histone2B-mCherry mRNAs הותקן בשלב 70% אפיבולי, כמתואר בשלב 4. הפולסטר זוהה על ידי ביטוי GFP, והעובר הותקן כך שמישור הפולסטר מאונך לציר האופטי (איור 1B). הטיית העובר הרחק מעמדה זו תסבך את ההליך. האור יצטרך לעבור דרך רקמות נוספות כדי להגי...

Watch this Scientific Journal Video about Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula at JoVE.com

Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula

התפתחות עוברית דורשת תיאום בקנה מידה גדול של תנועת תאים. אבלציה תלת-ממדית של עירור דו-פוטון מאפשרת אבלציה תלת-ממדית מבוקרת מרחבית של קבוצות גדולות של תאים עמוקים. בנוסף, טכניקה זו יכולה לחקור את התגובה של תאים נודדים באופן קולקטיבי ב vivo להסתבכויות בסביבה המכנית שלהם.

אבלציות נפח עמוקות ומבוקרות מרחביות באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטון בגסטרולה דג הזברה

Morphogenesis involves many cell movements to organize cells into tissues and organs. For proper development, all these movements need to be tightly ...

בתוך העוברים, תאים מתקשרים זה עם זה, מחליפים מידע כימי ומכאני. אחת ה דרך יעילה לבחן אינטראקציות אלה היא להרוג תאים מסוימים ולנטר את ההשלכות על תאים שכנים. השיטה שאנו מתארים מאפשרת לנו לנפח במדויק תאים, אפילו בתוך העובר, מבלי לפגוע ברקמות השכנות.הכן את המיקרוסקופ הדו-פוטוני על ידי הגדרת הלייזר הראשון לאורך הגל אבלציה 820 ננומטר, ואת הלייזר השני אל אורך הגל הדמיה mCherry 1, 160 ננומטר. באמצעות מראות ניידות בנתיב האופטי, יישר את שתי קרני הלייזר בכניסה וביציאה של ראשי הסריקה, ולאחר מכן מדוד את העוצמה המרבית של הלייזר הראשון ב- 820 ננומטר. מקם את מד הכוח מתחת למטרה, סגור את התא השחור והגדר את כוח הלייזר הראשון ל- 100%התחל איסוף נתונים במד הכוח, פתח את תריס הלייזר ולאחר מכן מדוד את עוצמת הפלט וחשב את אחוז כוח הלייזר הדרוש כדי להגיע ל- 300 מילי וואט.הגדר את הלייזר הראשון לאורך גל העירור GFP של 920 ננומטר וכוח ל- 7%התאם את כוח הלייזר השני ל- 15%הפעל את גלאי ה- PMT עבור קווים ירוקים ואדומים, והגדר רגישות PMT של קו ירוק ואדום ל- 65. התאם את שדה הראייה ל- 400 על 400 מיקרומטר, רזולוציית תמונה ל- 512 על 512 פיקסלים ותדר סריקה ל- 800 הרץ. בחר מצב הדמיה של זמן 3D ולאחר מכן צור תיקיה והפעל שמירה אוטומטית לשמירת נתונים לאחר כל רכישה.להרכיב את תא החימום ולהגדיר אותו 28 מעלות צלזיוס. המתן לפחות 10 דקות עד שהאולם והמטרה להתחמם. תחת סטריאמפיקוסקופ פלואורסצנטי, לזהות עוברים ב 70% epiboly להביע GFP.באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק, מעבירים שלושה עד ארבעה עוברים נבחרים בצלחת מצופה אגרוז ומניחים אותם בקפידה במלקחיים עדינים. ב בקבוקון זכוכית קטן, להוסיף מיליליטר אחד של פתרון של פניצילין-סטרפטומיצין בינוני המכיל 2%agarose, ומניחים את בקבוקון בתנור בלוק מחומם מראש, יבש ב 42 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה זכוכית מלוטשת אש, להעביר עובר dechorionated ל בקבוקון, דואג לא להוסיף מדי מדיום עובר לאגרוז.יש להשליך את מדיום העובר הנותר מהפיפטה. שאפו את העובר בחזרה, יחד עם מספיק אגרוז כדי לכסות את החלקה של צלחת התחתונה זכוכית. לפוצץ את agarose עם העובר על שקופית הזכוכית של המנה, להבטיח את העובר אינו נוגע באוויר או בצד הפלסטיק של המנה.לאחר מכן, מלאו את התא סביב מגלשת הזכוכית באגרוז. באמצעות ריס, כוון את העובר כך שהאזור המיועד יהיה בחלק העליון. לאחר חמש דקות, כאשר agarose מוגדר לחלוטין, להוסיף כמה טיפות של פנסילין-סטרפטומיצין מדיום למגלשת הזכוכית.מניחים את צלחת התחתונה של הכוס מתחת למטרה בתא המחומם. לטבול את המטרה מדיום עובר פניצילין-סטרפטומיצין לפני סגירת התא. הזז את המחוון כדי להגדיר את נתיב האור למשקפת.תדליק את מנורת הפלואורסצנטיות. מצא עובר והגדר את המוקד על פני השטח שלו. כבה את מנורת הפלואורסצנטיות והגדר את נתיב האור ל- PMTs לפני סגירת התא השחור.התחל הדמיה חיה ולאתר את מסודרם צירי. כדי לקבל אות טוב, להתאים את כוחות הלייזר. השתמש בערוץ האדום כדי להזיז את הבמה לחלק העליון של העובר, והקצה מיקום זה כ- Z שווה לאפס.בחר שלב זמן של דקה אחת ו- Z-step של שני מיקרומטרים. הגדר את הפרוסה הראשונה ב 15 מיקרומטר מעל mesoderm צירי, ואת הפרוסה האחרונה ב 15 מיקרומטר מתחת mesoderm צירי. הקלט 10 עד 15 דקות של סרט לפני אבלציה.בהדמיה חיה, אתר את קווי המתאר של הפולסטר, ולאחר מכן, באמצעות אזור אפנון אלקטרו-אופטי של עניין, או כלי EOM-ROI, צייר מלבן גדול של 20 פיקסלים המשתרע על רוחב הפולסטר, והצב את המלבן באמצע הפולסטר. שים לב למיקום האקסיאלי של המישורים הגבוהים והנמוכים ביותר שיש לאבל, ומבטיח שה- ROI לא יחפוף את תא החלמון באף אחד מהמישורים. מקם את הבמה בעמדת Z הנמוכה ביותר כדי להיות אבלה.הגדר את אורך הגל הראשון של הלייזר ל-820 ננומטר והזן את אחוזי הכוח כפי שחושבו קודם לכן כדי להשיג כוח יציאה של 300 מילי-וואט. הגדר את תדר ההדמיה ל-200 הרץ והדמיה לייזר ראשונה EOM לאפס. לאחר בחירת מצב טיפול החזר על ביצועים, כבה את ה- EOM והגדר את הטיפול כך שיפעל מיד לאחר אפס מסגרת.עבור את מצב ההדמיה ל- Timelapse והפעל את פעולתה של שמירה אוטומטית. לאחר בחירת מצב מהיר בשלב זמן, התאם את מספר מסגרות הטיפול ומספר המסגרות לערך המתאים לעומק המיועד. תתחילו להדמיה.הרכישה צריכה להיות שחורה, כמו התריס PMT נסגר במהלך טיפול EOM. לאחר מכן, עלו על הבמה לעמדת Z הבאה, ובצעו אבלציה דומה. חזור על כל תנוחת Z עד שהחלק העליון של הפולסטר יגיע.כאשר תהליך אבלציה הושלם, הגדר את הלייזר הראשון ל 920 ננומטר ולהתאים את כוח ההדמיה שנבחר בעבר. שים את EOM הדמיית הלייזר הראשונה ל- 100 ובחר במצב שדה מלא. תדירות ההדמיה צריכה להיות 800 הרץ, ויש לכבות את EOM לפני בדיקת הערימה כולה במצב חי כדי לבדוק אם כל מטוס כבר ablated.לאחר אישור אבלציה, בחר זמן תלת-ממדי למצב הדמיה. הפעל מחדש את שמירה אוטומטית והתחל להקליט את הסרט לאחר אבלציה למשך 40 עד 60 דקות. בסרט שלאחר אבלציה, בדוק אם התאים הממוקדים היו יעילים.כמו אבלציות על פני פולסטרים לא צריך לפגוע בעוברים, המורפולוגיה הרגילה של העוברים אבלים ניתן לראות ב 24 שעות לאחר ההפריה. בתוצאה המוצלחת של אבלציות לייזר, רקמות כיסוי לא הושפעו על ידי אבלציה של מבנים בסיסיים. טיפול אינטנסיבי מדי, או טיפול מועט מדי, הביא לכשלים בבלציה בלייזר.דוגמה לאבלציה לא מוצלחת מראה תאים מעל הפולסטר להיות אבלה, אשר ניכר על ידי פסולת autofluorescent במישור המוקד מעל הפולסטר. בניסיון לא יעיל אחר, התאים מולבנו אך לא הושחתו, ואותות פלואורסצנטיות נמוכה עדיין חושפים את קווי המתאר של התאים השלמים. לבסוף, תאים מסוימים אפילו לא מולבנו עקב טיפול לייזר מספיק.היווצרות של בועות נובעת cavitation המושרה על ידי טיפול לייזר אינטנסיבי מדי. ערימות Z נלכדו כל דקה במשך 40 דקות בבלציה מוצלחת, ותיעדו הן את האותות הציטופלסמיים והן את אותות ה-mCherry הגרעיניים. בנוסף, גרעינים השייכים לחצי האחורי של הפולסטר מסומנים בנקודה מגנטה ומעקב לאורך זמן, לפני ואחרי אבלציה.כמדד להתמדה בנדידה, נלמד מתאם אוטומטי של התאים לפני ואחרי אבלציה. תאים השייכים לחלקו העורפי של הפולסטר הציגו תנועה מתמשכת לפני אבלציה, אשר פוחתת באופן דרסטי לאחר אבלציה, מה שמצביע על אובדן של הגירה קולקטיבית מכוונת. יישור נכון של הלייזרים ומדידת כוח הלייזר הם קריטיים כדי לקבל תוצאות ניתנות לשחזור.זה גם המפתח כדי לבדוק את יעילות אבלציה על התמונות הראשונות לאחר אבלציה. אנו משתמשים בבלציות לייזר כדי לפקפק בתפקידן של אינטראקציות בין תאים בהנחיית נדידת התאים בתוך העובר. אבל ההליך יכול להיות מותאם בקלות לשאלות רבות אחרות שבהן תאים או רקמות צריך להיות ablated בדיוק, פוטנציאל עמוק באורגניזם.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

באמצעות תגובת מגע עוררת ו תנועת מבחנים להעריך שריר ביצועים ופונקציות של דג זברה

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...