Name: deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the zebrafish gastrula
Uploaded: 2021-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula at JoVE.com

우리는 물고기 관리에 대한 에밀리 메넌트, 폴리 테크닉 바이오 이미징 시설, 특히 피에르 마후, 부분적으로 레지온 일 드 프랑스 (interDIM)와 기관 국립 드 라 레체체 (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04)에 의해 지원 자신의 장비에 라이브 이미징에 대한 지원을 제공합니다. 이 작품은 ANR 보조금 15-CE13-0016-1에 의해 지원되었다, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016, 그리고 마리 Skłodowska-Curie 보조금 협정에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 No 840201, 미니슈레 드 l'Enseignement Supérieur et de la Recherche 및 국립 센터 드 라 리셔.

모든 동물 작업은 윤리위원회 N 59와 미니스티에르 드 l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche에 의해 승인되었다 파일 번호 APAFIS#15859-2018051710341011v3. 아래에 설명된 단계 중 일부는 장비 및 소프트웨어에 만지지만 다른 장비에 쉽게 적응할 수 있습니다.
1. 사출 준비
<ol><li>배아 매체(EM)에서 1% 아가로즈 용액의 75mL를 준비한다.</li>
	<li>주입 금형을 90mm 페트리 접시...

<ol>
	<li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+induction.">Embryonic induction.</a> Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).</li><li>Fernandez-Sanchez, M. -. E., Brunet, T., R&#246;per, J. -. C., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction's+impact+on+animal+development,+evolution,+and+tumorigenesis.">Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).</li><li>Shih, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+zebrafish+organizer:+microsurgical+analysis+at+the+early-shield+stage.">Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage.</a> Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).</li><li>Selleck, M. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+microsurgical+manipulation+of+the+early+avian+embryo.">Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).</li><li>Bulina, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photosensitizer.">A genetically encoded photosensitizer.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 95-99 (2006).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+diffraction+limited+nanosurgery+of+live+biological+tissues.">Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues.</a> Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).</li><li>Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+laser+ablation+to+measure+cell+and+tissue-generated+forces+in+the+zebrafish+embryo+in+vivo+and+ex+vivo.">UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 219-235 (2015).</li><li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation.">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li><li>Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscope-based+laser+ablation+and+regeneration+assay+in+zebrafish+interneuromast+cells.">Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).</li><li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling.">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).</li><li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition - Four Volume Set. , (2019).</li><li>Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioimaging:+second+window+for+in+vivo+imaging.">Bioimaging: second window for in vivo imaging.</a> Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Theveneau, E., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrations+cellulaires+collectives.">Migrations cellulaires collectives.</a> Medecine/Sciences. 30 (8-9), 751-757 (2014).</li><li>Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+mesendoderm+migration+relies+on+an+intrinsic+directionality+signal+transmitted+through+cell+contacts.">Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).</li><li>Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+things:+cell+fates+and+cell+movements+during+early+embryogenesis+of+zebrafish.">Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish.</a> BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).</li><li>Montero, J. -. A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+3-kinase+is+required+for+process+outgrowth+and+cell+polarization+of+gastrulating+mesendodermal+cells.">Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells.</a> Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).</li><li>Ulrich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slb/Wnt11+controls+hypoblast+cell+migration+and+morphogenesis+at+the+onset+of+zebrafish+gastrulation.">Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation.</a> Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).</li><li>Kai, M., Heisenberg, C. -. P., Tada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+individual+cell+behaviours+underlying+the+directed+migration+of+prechordal+plate+progenitor+cells+during+zebrafish+gastrulation.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation.</a> Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).</li><li>Smutny, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction+forces+position+the+neural+anlage.">Friction forces position the neural anlage.</a> Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).</li><li>Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dkk1+controls+cell-cell+interaction+through+regulation+of+non-nuclear+&#946;-Catenin+pools.">Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear &#946;-Catenin pools.</a> Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).</li><li>Gorelik, R., Gautreau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+unbiased+analysis+of+directional+persistence+in+cell+migration.">Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).</li><li>Grill, S. W., Howard, J., Sch&#228;ffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+active+force+generators+controls+mitotic+spindle+position.">The distribution of active force generators controls mitotic spindle position.</a> Science. 301 (5632), 518-521 (2003).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -. A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Farhadifar, R., R&#246;per, J. -. C., Aigouy, B., Eaton, S., J&#252;licher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Foundations of Experimental Embryology. , (1964).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Bosze, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pcdh18a+regulates+endocytosis+of+E-cadherin+during+axial+mesoderm+development+in+zebrafish.">Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish.</a> Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).</li></ol>

여기서는 비선형 광학을 사용하여 깊고 공간적으로 잘 정의된 볼륨 절제를 수행하는 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜의 가장 중요한 단계는 과도한 파편이나 캐비테이션을 피하기 위해 절제를 허용하지만 너무 많은 에너지를 허용하는 충분한 에너지를 제공하는 치료 조건을 찾는 것입니다. 대상 부위에 전달되는 에너지의 양은 주로 레이저 출구 전력, (2) 레이저 정렬의 품질, (3) 빛이 절제 평면...

세포 세포 상호 작용은 개발에 중요한 역할을합니다. 세포는 그들의 직접적인 이웃, 또는 더 멀리 세포가, 그들의 운명 및/또는 행동에 영향을 미치는, 인식할 수 있는 신호를 제공합니다. 이러한 신호의 대부분은 본질적으로 화학 물질이다. 예를 들어, 잘 특징인 유도 이벤트에서, 한 세포 그룹은 다른 세포 집단의 운명에 영향을 미치는 확산 분자를 생성1. 그러나 다른 신호는 기계적입니다. 세포는 이웃이 인식하고 대응하는 이웃에게 힘과 제약을 행사합니다2.
생체 내에서 이러한 세포 세포 상호 작용의 중요성을 연구 하는 한 가지 방법은 일부 세포를 제거 하 고 후속 개발을 관찰 하는. 불행히도 세포를 제거하거나 파괴하는 데 사용할 수 있는 기술은 제한됩니다. 세포는 바늘 또는 작은 전선을 사용하여 외과적으로 제거 될 수 있지만, 이러한 치료는 침습적이며 매우 정확하지 않으며 일반적으로 현미경으로 즉시 이미징을 방지하여 스테레오 현미경으로 수행됩니다. 또한 깊은 세포를 대상으로 하는 것은 조직 과대 결막에 구멍을 뚫고 원치 않는 혼란을 일으킵니다. KillerRed와 같은 유전적으로 인코딩된 광세제는 빛 조명을 통해 세포 사멸을 유도하는 데 사용되어 왔다5. 광세제는 빛 조사 시 반응성 산소 종을 생성하는 크로모포라이트입니다. 그들의 주요 한계는 세포가 움직이는 경우에 달성하기 어려울 지도 모르다 긴 빛 일루미네이션 (약 15 분)를 필요로 하고, 즉각적인 것이 아닙니다 세포 사멸을 통해 세포 죽음을 유도한다는 것입니다.
마지막으로, 레이저 절제는 개발 되었으며 널리 지난 15 년 동안 사용 되었습니다6,7,8,9,10,11,12. 레이저 빔은 표적 세포/조직에 초점을 맞습니다. 그것은 가열을 통해 그것의 절제를 유도, 광절, 또는 플라즈마 유도 절제; 관련 프로세스는 전력 밀도 및 노출 시간13에 따라 달라집니다. 대부분의 절제 프로토콜은 높은 에너지에 자외선 레이저를 사용합니다. 그러나, UV 광은 모두 흡수되고 생물학 조직에 의해 산란됩니다. 따라서 깊은 세포를 대상으로하려면 높은 레이저 전력이 필요하며, 이는 더 피상적이고 평면 외 조직에서 손상을 유도합니다. 이것은 표면 구조에 UV 레이저의 사용을 제한하고 상대적으로 낮은 축 해상도를 설명합니다. 비선형 광학(소위 2광자 현미경 검사법)은 적외선 영역에서 약 반 에너지의 두 광자를 가진 형광을 자극하기 위해 빛의 비선형 특성을 사용합니다. 절제에 적용하면 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 적외선은 생물학적 조직에 의해 UV 빛보다 덜 산발적이고 덜 흡수되어 필요한 레이저 전력을 증가하지 않고 더 깊은 구조물에 도달할 수 있습니다. 둘째, 펨토초 펄스 레이저의 사용은 매우 높은 전력 밀도를 제공하여 플라즈마 유도를 통해 절제를 생성하며, 이는 가열과는 달리 공간적으로 확산되지 않습니다15. 셋째, 플라즈마 형성을 유도하는 전력 밀도는 초점에서만 도달한다. 이러한 특성 덕분에, 2광자 레이저 절제는 주변 조직 환경에 영향을 주지 않고 깊은 세포를 정확하게 표적으로 하는 데 사용될 수 있다.
집단 이동은 세포 세포 상호 작용이 기본인 발달 과정의 훌륭한 예입니다. 집단 이동은 인접한 세포가 하나의 cell16의 동작에 영향을 미치는 세포 마이그레이션으로 정의됩니다. 이러한 상호 작용의 본질 (화학 또는 기계적) 그리고 세포 마이그레이션에 미치는 영향은 크게 다를 수 있으며 종종 완전히 이해되지 않습니다. 세포를 제거하고 이것이 다른 사람들에게 어떻게 영향을 미치는지 관찰하는 능력은 이러한 집단 적 과정을 더욱 해명하는 데 중요합니다. 몇 년 전, 우리는 제브라피쉬 위장 중 폴스터의 이주가 집단 이주라는 외과 적 접근법을 사용하여 설립했습니다17. polster는 배아18의 등쪽 측에 있는 첫번째 내재화 세포를 구성하는 세포의 단입니다. Tg(gsc:GFP) 형질전환선에서 녹색으로 표지된 이 세포는 태아 의 깊은 곳에 위치하며, 에피블라스트 세포의 여러 층 아래에 있습니다. 위질 도중, 이 단은 축 중구의 확장을 이끌고, 배아 조직자에서 동물 극으로 이동19,20,21,22,23 (도 1A). 우리는 세포가 동물 극의 방향으로 그들의 이주를 방향을 그들의 이웃과 접촉이 필요하다는 것을 설치했습니다. 그러나, 이 집단 이주의 세포 및 분자 기지를 더 잘 이해하는 것은 이것이 나머지 그들에 어떻게 영향을 미치는지 보기 위하여 몇몇 세포를 제거하는 관련시킵니다. 따라서 우리는 2광자 현미경 설정을 사용하여 크고 깊은 양의 절제를 개발했습니다. 여기에서, 우리는 Histone2B-mCherry로 표지된 핵을 추적하여 중앙에 있는 polster를 단절하고 세포 이동에 대한 결과를 관찰하기 위하여 이 프로토콜의 사용을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A8963,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software : Matlab</td>
			<td>Math Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-optic modulator (EOM)</td>
			<td>ConOptics</td>
			<td>350-80LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Medium (EM) solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201-T-UNIT-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM driver</td>
			<td>ConOptics</td>
			<td>302RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>300085</td>
			<td>Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Tip should be fire polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green/ablation laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td>Mai Tai HP DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone2B-mCherry mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier&#38; al. 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software: IMARIS</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImSpector software</td>
			<td>Abberior Instruments Development Team</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection mold</td>
			<td>Adapative Science Tools</td>
			<td>I-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube (PMT)</td>
			<td>Hammamatsu</td>
			<td>H7422-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPump (Air injector)</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td>OPO/Insight DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water for injection</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software: Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(gsc:GFP) zebrafish line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647&#8211;59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope II microscope</td>
			<td>La Vision Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the zebrafish gastrula

Morphogenesis는 조직과 기관으로 세포를 조직하기 위하여 많은 세포 운동을 관련시킵니다. 적절한 개발을 위해서는 이러한 모든 움직임을 엄격하게 조정해야 하며 증거를 축적하면 적어도 부분적으로는 기계적 상호 작용을 통해 이 것을 달성해야 합니다. 태아에서 이것을 시험하는 것은 직접적인 물리적 인 동요를 필요로 합니다. 레이저 절제는 기계적 제약을 완화하거나 두 세포 집단을 물리적으로 격리할 수 있는 점점 더 많이 사용되는 옵션입니다. 그러나, 많은 절제는 제한된 축 분해능 및 조직 침투를 제공하는 자외선 (UV) 레이저로 수행됩니다. 방법은 2광자 현미경을 사용하여 깊고, 중요하고, 공간적으로 잘 정의된 볼륨을 축하하기 위하여 여기에서 기술됩니다. 절제는 축 중음근에서 녹색 형광 단백질을 표현하는 형질 형질 제브라피 시라인에서 입증되고 과열 된 자궁 또는 기본 노른자 세포에 영향을 주지 않고 축 성 메센도더름을 절단하는 데 사용됩니다. 세포 행동은 절제 전후에 살아있는 화상 진찰에 의해 감시됩니다. 절제 프로토콜은 몇 미크론에서 백 미크론에 이르는 비늘에서 모든 세포 유형 또는 조직에 다른 발달 단계에서 사용할 수 있습니다.

중간에 폴스터를 끊기 위해, Histone2B-mCherry mRNAs로 주입된 Tg(gsc:GFP) 배아는 4단계에서 설명된 바와 같이 70% 에피보리 스테이지에 장착되었다. 폴스터는 GFP 발현에 의해 확인되었고, 배아는 폴스터의 평면이 광학 축(도 1B)에 수직되도록 장착되었다. 이 위치에서 배아를 기울이면 절차가 복잡해집니다. 빛은 절제 비행기에 도달하기 위해 더 많은 조직을 통과해야하며, 절?...

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Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula

배아 발달은 세포 운동의 대규모 조정을 요구합니다. 2광자 포동 중재 레이저 절제는 심층 세포의 큰 그룹의 공간 적으로 제어 된 3 차원 절제를 허용한다. 또한, 이 기술은 생체 내에서 집단적으로 이동하는 세포의 반응을 기계적 환경에서 의 동요로 조사할 수 있다.

얼룩말 피시 가스트룰라의 2광자 현미경을 사용하여 깊고 공간적으로 제어된 볼륨 절제

Morphogenesis involves many cell movements to organize cells into tissues and organs. For proper development, all these movements need to be tightly ...

배아 내에서 세포는 서로 상호 작용하여 화학 및 기계적 정보를 교환합니다. 이러한 상호 작용을 조사하는 한 가지 효율적인 방법은 일부 세포를 죽이고 이웃 세포에 대한 결과를 모니터링하는 것입니다. 우리가 설명하는 방법은 우리가 정확하게 이웃 조직을 손상시키지 않고, 태아 내에서 세포를 ablate 수 있습니다.제1 레이저를 절제 파장 820 나노미터로 설정하고, 제2 레이저를 mCherry 이미징 파장 1, 160 나노미터에 설정하여 2광광 현미경을 준비한다. 광학 경로에 이동식 거울을 사용하여 스캔 헤드 의 두 레이저 빔을 입력 및 출구로 정렬한 다음 820 나노미터에서 첫 번째 레이저의 최대 출력을 측정합니다. 파워 미터를 목표 아래에 놓고 검은 챔버를 닫고 첫 번째 레이저 전력을 파워 미터에서 데이터 수집을 100 % 시작하고 레이저 셔터를 열고 출력 전력을 측정하고 300 밀리와트에 도달하는 데 필요한 레이저 전력의 비율을 계산합니다.첫 번째 레이저를 920 나노미터의 GFP 여기 파장에 설정하고 전력을 7%로 조정하여 두 번째 레이저 전력을 15%로 조정하여 녹색 및 빨간색 선에 대한 PMT 검출기를 활성화하고 녹색 및 빨간색 선 PMT 감도를 65로 설정합니다. 시야를 400x400 마이크로미터로 조정하고, 이미지 해상도를 512x 512픽셀로 조정하고, 스캔 주파수를 800 헤르츠로 조정합니다. 3D 시간 경과 이미징 모드를 선택한 다음 폴더를 만들고 Autosave를 활성화하여 각 수집 후 데이터를 저장합니다.가열 챔버를 조립하고 섭씨 28도로 설정합니다. 챔버와 목표가 따뜻해지려면 적어도 10 분 동안 기다립니다. 형광 스테레오 현미경의 밑에, GFP를 표현하는 70%epiboly에 태아를 확인합니다.플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 아가로즈 코팅 접시에 3~4개의 선택된 배아를 옮기고 조심스럽게 미세한 집게로 장식합니다. 작은 유리 바이알에서는 2%아가로즈를 함유한 페니실린 연쇄상 구균 배지용액1밀리리터를 넣고, 유리병을 예열된 드라이 블록 히터에 섭씨 42도에 넣습니다. 불을 연마한 유리 파이펫을 사용하여, 아가로즈에 너무 많은 배아 배지를 추가하지 않도록 주의하여, 성모에 성모배전을 전달한다.파이펫에서 나머지 배아 매체를 폐기합니다. 배아를 다시 흡인하고, 유리 바닥 접시의 슬라이드를 덮을 충분한 아가로즈를 흡입합니다. 접시의 유리 슬라이드에 배아와 아가로즈를 날려 배아가 접시의 공기 또는 플라스틱 측면을 만지지 않도록하십시오.그런 다음 유리 슬라이드 주위에 챔버를 아가로즈로 채웁니다. 속눈썹을 사용하여, 표적 부위가 상단에 있도록 배아의 방향을 지정합니다. 5 분 후, 아가로즈가 완전히 설정되면, 유리 슬라이드에 페니실린 연쇄 상혈구 배아 배지의 몇 방울을 추가합니다.유리 바닥 접시를 가열 된 챔버에 목표 아래에 놓습니다. 챔버를 닫기 전에 페니실린 연쇄 절제술 배지에 목표를 담급하십시오. 슬라이더를 이동하여 가벼운 경로를 안구로 설정합니다.형광 램프를 켭니다. 배아를 찾아 표면에 초점을 설정합니다. 형광 램프를 끄고 검은 색 챔버를 닫기 전에 PMT로 가벼운 경로를 설정합니다.라이브 이미징을 시작하고 축 중구를 찾습니다. 좋은 신호를 가지고, 레이저 능력을 조정합니다. 빨간색 채널을 사용하여 스테이지를 배아의 맨 위로 이동하고 Z가 0과 같을 때 이 위치를 할당합니다.1분의 시간 단계와 2마이크로미터의 Z 단계를 선택합니다. 축 중소 더미 위의 15 마이크로미터에서 첫 번째 슬라이스를 설정하고 마지막 슬라이스는 축 중구 보다 15 마이크로미터 아래에 있습니다. 사전 절제 영화의 10~15분을 기록합니다.라이브 이미징에서 폴스터 윤곽을 찾은 다음, 전자 광학 변조기 영역 또는 EOM-ROI 도구를 사용하여 폴스터의 너비에 걸쳐 있는 20픽셀 대형 사각형을 그리고 폴스터 의 중간에 사각형을 놓습니다. 가장 높고 가장 낮은 평면의 축 위치를 확인하여 ROI가 비행기의 노른자 셀과 겹치지 않도록 합니다. 스테이지를 가장 낮은 Z 위치에 놓습니다.첫 번째 레이저 파장을 820 나노미터로 설정하고 300 밀리와트의 출구 전력을 얻기 위해 이전에 계산된 전력 백분율을 입력합니다. 이미징 주파수를 200 헤르츠로 설정하고 첫 번째 레이저 이미징 EOM을 0으로 설정합니다. ROI 치료 모드를 선택한 후 EOM을 끄고 0 프레임 직후부터 치료를 시작합니다.이미징 모드를 타임랩스에 넣고 자동 저장을 비활성화합니다. 시간 단계에서 빠른 모드를 선택한 후 처리 프레임 수와 프레임 수를 대상 깊이에 해당하는 값으로 조정합니다. 이미징을 시작합니다.EOM 처리 중에 PMT에 대한 셔터가 닫히므로 획득은 검은색이어야 합니다. 다음으로 스테이지를 다음 Z 위치로 이동하여 절제작업을 수행합니다. 폴스터의 상단에 도달 할 때까지 모든 Z 위치에 반복합니다.절제 과정이 완료되면 첫 번째 레이저를 920 나노미터로 설정하고 이전에 선택한 이미징 전력에 적응합니다. 첫 번째 레이저 이미징 EOM을 100으로 넣고 전체 필드 모드를 선택합니다. 이미징 주파수는 800 헤르츠여야 하며, 모든 비행기가 절단되었는지 확인하기 위해 라이브 모드에서 전체 스택을 검사하기 전에 EOM을 꺼야 합니다.절제가 확인되면 3D 시간 경과를 이미징 모드로 선택합니다. 자동 저장을 다시 활성화하고 40~60분 동안 포스트 절제 동영상 녹화를 시작합니다. 절제 후 영화에서, 표적 세포가 효과적으로 절단되었는지 확인하십시오.polsters를 가로지르는 절제는 배아에 해를 끼치지 않아야하므로, ablated 태아의 정상적인 형태는 수정 후 24 시간에서 관찰 될 수 있습니다. 레이저 절제의 성공적인 결과에서, 과다 구조직은 근본적인 구조물의 절제에 의해 영향을 받지 않았습니다. 너무 강렬한 치료, 또는 너무 작은 치료, 레이저 절제에 실패 결과.실패한 절제의 예는 폴스터 위의 초점 평면에 있는 자동 형광 파편에 의해 명백했던 폴스터 위의 세포를 보여줍니다. 또 다른 비효율적인 시도에서, 세포는 표백되었지만 abed되지 않았고, 낮은 형광 신호는 아직도 그대로 있는 세포 윤곽을 드러냅니다. 마지막으로, 일부 세포는 레이저 치료가 부족하여 표백되지도 않았습니다.거품의 형성은 너무 강렬한 레이저 치료에 의해 유도 된 캐비테이션에 기인한다. Z-스택은 성공적인 절제에서 40 분 동안 매 분마다 캡처되어 세포질 GFP와 핵 mCherry 신호를 모두 기록했습니다. 또한, 폴스터의 전방 절반에 속하는 핵은 마젠타 점으로 표시되고 시간이 지남에 따라 절제 전후로 추적된다.마이그레이션 지속성의 척도로서 절제 전후셀의 방향 자동 상관관계가 연구되었습니다. 폴스터의 전방 부분에 속하는 세포는 절제 전에 지속적인 움직임을 표시, 이는 크게 집단 지향 마이그레이션의 손실을 나타내는 절제 후 감소. 레이저를 적절히 정렬하고 레이저 전력을 측정하는 것은 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다.또한 첫 번째 절제 후 이미지에서 절제 효율을 확인하는 것도 중요합니다. 우리는 레이저 절제를 사용하여 배아 내 세포의 이동을 안내하는 세포 세포 상호 작용의 역할에 의문을 제기합니다. 그러나 절차는 세포 또는 조직이 유기체에 있는 잠재적으로 깊은 정확하게 abLATED될 필요가 있는 많은 그밖 질문에 쉽게 적응될 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...