Name: rapid characterization of genetic parts with cell-free systems
Uploaded: 2021-08-30T14:00:00
Duration: 5 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

أصبح هذا العمل ممكنا بفضل برنامج البحوث التطبيقية للنهوض بأولويات العلوم والتكنولوجيا التابع لمكتب وزير الدفاع. نشكر سكوت والبر (مختبر الأبحاث البحرية) على توفير مخزون sfGFP المستخدم ، وزاكاري صن وأبيل تشياو (Tierra Biosciences) على المناقشات المثمرة المتعلقة بالنماذج الأولية مع الأنظمة الخالية من الخلايا واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ذات الصلة للتعامل مع السوائل الصوتية.

تمتلك RMM حصة مالية في Tierra Biosciences ، وهي شركة خاصة تستخدم تقنيات خالية من الخلايا مثل تلك الموضحة في هذه المقالة للتعبير عن البروتين وفحصه.
المؤلفون الآخرون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

توفر البروتوكولات الموصوفة هنا وسيلة فعالة من حيث التكلفة وسريعة لفحص الأجزاء الجينية عن طريق التعبير عن بروتين المراسل بواسطة CFPS. تعتبر الأجزاء الجينية ذات الخصائص الجيدة ضرورية لتصميم دوائر وراثية يمكن التنبؤ بها ذات وظيفة مفيدة. تزيد هذه المنهجية من الإنتاجية وتقلل من الوقت اللازم لفحص الأجزاء الجينية الجديدة عن طريق إزالة متطلبات العمل في الخلايا الحية ، مع الاحتفاظ بالوظائف التي تعكس البيئة الخلوية من خلال الاحتفاظ بعملية التمثيل الغذائي للتعبير البروتيني في محللة الخلية. يمكن تنفيذ بروتوكولنا في يوم واحد بعد استلام البادئات (~ 2.5-6 ساعات لإعداد التفاعل ، 2-16 ساعة لتفاعل CFPS ؛ الشكل 1) ، مقارنة ب 3 أيام على الأقل للاستنساخ التقليدي (يوم واحد لكل من تجميع البناء والتحويل ، والتحقق من تسلسل الحيوانات المستنسخة ، وزراعة الخلايا للتقييم). ونقدر كذلك أن تكلفة البناء باستخدام الحمض النووي الخطي تبلغ حوالي ثلث تكلفة الاستنساخ التقليدي (78 دولارا مقابل 237 دولارا؛ الجدول التكميلي 1) أساليب. تقتبس خدمات التوليف التجاري حاليا ما لا يقل عن 4 أيام عمل اعتمادا على الحجم ، على الرغم من أنه سيكون لها تكاليف مماثلة لطريقتنا إذا تم فحص الأجزاء الخطية مباشرة في CFPS (78 دولارا مقابل 91 دولارا) ؛ لم نتحقق من هذا النهج. تكلفة تقييم جزء باستخدام CFPS صغيرة مقارنة بتوليد قالب الحمض النووي (0.05 دولار / رد الفعل22 مقابل 78 دولارا لكل قالب) ، على الرغم من أنه تجدر الإشارة إلى أن تكاليف بدء التشغيل للكواشف السائبة ومعدات التحلل لا تقل عن عدة آلاف من الدولارات. يؤدي استخدام معالج سائل صوتي إلى تحسين التكاليف بشكل هامشي فقط من خلال تمكين أحجام أصغر تصل إلى 0.5 ميكرولتر40 ؛ الميزة الأكثر أهمية هي تقليل الوقت اللازم لإعداد التفاعلات (~ 10 دقائق مقابل ما يصل إلى 1 ساعة ، اعتمادا على عدد التفاعلات) ، خاصة عند إعداد عدد كبير من التفاعلات يثير مخاوف من رد الفعل المحضر لأوقات طويلة قبل الحضانة.
في حين أنها سريعة وفعالة من حيث التكلفة ، إلا أن القيود المفروضة على الوقت الذي تتنبأ فيه النماذج الأولية ل CFPS بشكل كاف في وظيفة الجسم الحي لا تزال غير واضحة. على سبيل المثال ، لن يتم اكتشاف أي تفاعل متقاطع مع الحمض النووي الجينومي بسبب إزالة الجينوم المضيف أثناء إنتاج نظام CFPS. أيضا ، يمكن أن تكون تركيزات المكونات أقل بمقدار 1-2 أوامر في CFPS منها في الخلايا51 ، والتي من المحتمل أن تؤثر على سلوك بعض الأجزاء نتيجة لظروف الازدحام الجزيئي المختلفة. علاوة على ذلك ، قد تكون قدرة الحمض النووي الخطي على التنبؤ بوظيفة الجسم الحي محدودة ، على سبيل المثال ، عندما تلعب البنية الثانوية للحمض النووي دورا مهما. القيد الأخير هو أن الإنشاءات لا يتم التحقق من تسلسلها قبل اختبار الوظائف. قد تكون هناك حالات لا يتماشى فيها الجزء المميز فعليا مع التسلسل النظري المقصود. يمكن تخفيف كل هذه القيود عن طريق التحقق من صحة مجموعة فرعية من الأجزاء التي تم فحصها بهذه الطريقة في التطبيق المقصود في الجسم الحي .
لقد طورنا هذه المنهجية في الأصل للتحقيق في آثار تغيير موضع المشغل على مروجي T7-tetO الهجين32. لقد قدمنا البروتوكولات هنا بتنسيق أكثر عمومية ، بحيث يمكن تطبيقها على المروجين والمشغلين وتسلسلات ربط الريبوسوم والعوازل والإنهاءات. يمكن إضافة هذه الأجزاء الجينية إلى نهاية 5ʹ أو 3ʹ من جين المراسل عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات لكل تصميم ، مما يغني عن الحاجة إلى التوليف أو الاستنساخ لكل متغير للاختبار. تعمل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتجة كقالب DNA للتقييم عبر التعبير عن بروتين المراسل. في عملنا ، تم استخدام بروتوكول تنقية التقارب المقدم هنا ل TetR و GamS. يمكن استخدام نفس الإجراء للتعبير عن وتنقية المثبطات الأخرى ، والمنشطات ، والبوليميراز ، وعوامل سيغما ، والبروتينات الأخرى المشابهة لجزء وراثي من الاهتمام ، على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات للبروتين المطلوب الذي يتم التعبير عنه. تتيح تنقية هذه البروتينات ومعايرتها في تفاعلات CFPS توصيفا أكثر تفصيلا لجزء وراثي معين. أخيرا ، توجد العديد من بروتوكولات CFPS البديلة ويجب أن يكون كل منها قابلا لجزء فحص الأجزاء من المنهجية. على سبيل المثال ، لا نقوم بتضمين خطوة غسيل الكلى في هذا البروتوكول ، والتي وجدها الآخرون مهمة للتعبير عن المروجين البكتيريين الأصليين22. من الممكن أيضا تغيير تركيزات المكونات المكونة الأساسية ل CFPS. يعزز استخدام مناولة السوائل القدرة على اختبار الظروف التي لا تعد ولا تحصى عن طريق زيادة الإنتاجية وتقليل المواد المطلوبة34,35.
أحد المجالات التي يمكن أن تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل كبير هو تحسين معالج السائل الصوتي. يجب تحسين توزيع معالج السوائل الصوتية لكل مكون يتم نقله ويوصى بشدة بتشغيل عناصر التحكم للتحقق من التوزيع والتكرار المناسبين قبل جمع البيانات. يعتمد نوع لوحة المصدر المثالي وإعداد فئة السائل على السائل المحدد المراد الاستغناء عنه ومكوناته. لا ينصح باستخدام الألواح المطلية بالأمين لتوزيع الحمض النووي ، حيث قد يتفاعل طلاء الأمين مع الحمض النووي. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن القدرة على توزيع تركيزات أعلى من مكونات معينة قد تعتمد على نموذج معالج السائل الصوتي. يمكن إجراء اختبار نقل السائل عن طريق الاستغناء عن ختم لوحة رقائق لتصور تكوين قطرات ناجحة ؛ ومع ذلك ، يوفر هذا الاختبار معلومات محدودة وقد تظهر قطرات من إعدادات مختلفة متطابقة. يمكن استخدام صبغة قابلة للذوبان في الماء ، مثل التارتازين ، للتحقق بشكل أكثر دقة من الاستغناء عن الحجم الصحيح في إعداد أو سير عمل معين (انظر النتائج التمثيلية). ويمكن أن تؤثر البرمجة المثلى لعمليات نقل السوائل أيضا على دقة واتساق البيانات المتولدة؛ بالنسبة لعمليات النقل >1 ميكرولتر من بئر مصدر واحد إلى بئر وجهة واحدة ، وجدنا أنه يجب برمجة عمليات النقل المتسلسلة ل ≤1 ميكرولتر لتقليل التباين المنهجي من بئر إلى بئر (الشكل 4). أخيرا ، يمكن أن تختلف أحجام الآبار الميتة النظرية والفعلية بشكل كبير اعتمادا على نوع لوحة المصدر وإعداد فئة السائل ومكونات السائل المحدد ؛ قد يساعد استخدام وظيفة مسح معالج السائل الصوتي لتقييم أحجام الآبار قبل تشغيل البرنامج في قياس مدى دقة الأداة في قياس سائل معين.
يمكن أن يختلف أداء تفاعل CFPS عند مقارنة النتائج بين المستخدمين المختلفين ودفعات المواد وقارئات الألواح والمختبرات41. في الحالات التي تكون فيها مثل هذه المقارنات مطلوبة أثناء وضع نماذج أولية للدوائر الجينية ، نوصي بتضمين تفاعلات التحكم الداخلي مع المروجين التأسيسيين القياسيين في كل لوحة تفاعل للمساعدة في تطبيع النتائج عبر الإعدادات التجريبية. يمكن أن تساهم طريقة تحضير الحمض النووي أيضا بشكل كبير في نشاط CFPS. يوصى بإدراج خطوة ترسيب الإيثانول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يختلف تكوين التفاعل الأمثل حسب دفعةالمستخلص 34. وقد تبين أن تركيزات غلوتامات المغنيسيوم وغلوتامات البوتاسيوم المثلى ، على وجه الخصوص ، تختلف حسب الدفعة42 أو مع بروتين المروج أو المراسل المستخدم24. يجب تحسين تركيزات هذه المكونات عن طريق الفحص عبر عدة تركيزات لكل مكون لكل بناء جيني ولكل مستحضر مستخلص خلية لتحديد الظروف المثلى للتعبير عن البروتين. أخيرا ، تتضمن أفضل الممارسات لأداء تفاعل CFPS المتسق الخلط الشامل ، والماصات الدقيقة ، والاتساق في إعداد كل مكون من مكونات الكاشف.
بالإضافة إلى توصيف الأجزاء الفردية ، يمكن استخدام نفس الطريقة لفحص مجموعات الأجزاء التي تشكل دوائر معقدة ، مثل الدوائر المنطقية16 أو مؤشرات التذبذب52,53. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على فحص وتحسين أجهزة الاستشعار الحيوية للتطبيقات في التشخيص الوبائي 54،55،56،57 أو الكشف عن المخاطر وتحديدها كميا3،58،59. يمكن أيضا إقران تطبيق التقنيات التي تعتمد على الذكاء الاصطناعي مثل التعلم النشط34 بالطبيعة عالية الإنتاجية لهذه الطريقة لدفع الاستكشاف السريع لمساحات التصميم البيولوجي المعقدة. في نهاية المطاف ، نتصور أن هذا النهج يدعم أوقات التطوير المتسارعة للتصميمات الجينية الجديدة في البيولوجيا التركيبية.

يتمثل أحد الجهود الأساسية للبيولوجيا التركيبية في تطوير مجموعات أدوات وراثية تحتوي على أجزاء جيدة التوصيف ، والتي يمكن استخدامها لبناء دوائر وراثية1 تؤدي وظائف مفيدة عند نشرها في الميكروبات أو المحللات الخالية من الخلايا. المجالات التي اكتسبت فيها هذه الدوائر الجينية قوة جذب هي استشعار2،3،4 ، والأداء البشري5،6 ، والوقود الحيوي7،8 ، وإنتاج المواد9،10 ، والحوسبة الخلوية 11. تم إنشاء سجلات للأجزاء الجينية الموحدة12 لفهرسة الأجزاء الجديدة والحالية في فئات مثل المروجين والمشغلين وتسلسلات الترميز والإنهاءات ، على سبيل المثال لا الحصر. كانت الجهود المبذولة مثل iGEM (الآلات الدولية المهندسة وراثيا)13 مفيدة في توصيف وفهرسة هذه الأجزاء الجينية. تم تطوير العديد من الطرق لتسهيل التجميع السريع لهذه الأجزاء في دوائر وراثية مفيدة14,15. تم تطوير برنامج حتى لأتمتة تكوين الأجزاء ذات المواصفات الجيدة في دوائر تحقق الوظيفة المطلوبة16. ومع ذلك ، فإن تجميع الدوائر الجينية المفيدة ذات الوظائف التي يمكن التنبؤ بها يعتمد على افتراض أن مجموعات الأدوات الجينية تحتوي على أجزاء وراثية جيدة التوصيف. نظرا لضرورة مجموعات الأدوات هذه نحو النهوض بالبيولوجيا التركيبية ، تم وصف العديد من الجهود لتحسين فهرسة الدوائر والأجزاء ببيانات التوصيف المناسبة17،18،19،20،21.
يستخدم أحد الأساليب لتوصيف المكونات الجينية أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) ، والتي تعيد تكوين الوظائف الخلوية مثل النسخ والترجمة خارج الجسم الحي22. أظهرت العديد من الدراسات إمكانات CFPS للمكونات الجينية الأولية 23،24،25،26،27،28،29،30،31،32 سواء للتطبيقات المباشرة في الأنظمة الخالية من الخلايا أو للتنبؤ بوظيفة التركيبات الجينية في الخلايا ، مثل النشاط النسبي للأجزاء داخل المكتبة 29 ، وتحسين المسار الأيضي27 ، والعبء الخلوي30. تشمل مزايا النماذج الأولية في CFPS مقابل الخلايا التي أبرزتها هذه الدراسات تجنب الاستنساخ الذي يستغرق وقتا طويلا ، والتحكم الدقيق في تركيز الحمض النووي ومكونات التفاعل الأخرى ، والقدرة على خلط ومطابقة تركيبات الحمض النووي المتعددة بسهولة. تظهر ميزة تجنب الاستنساخ بشكل خاص عند استخدام قوالب الحمض النووي الخطية ، والتي تمكن من تجميع التركيبات الجديدة بطرق مخبرية تستغرق ساعات بدلا من أيام33. إن القدرة على التلاعب بتركيز تركيبات الحمض النووي والمكونات الأخرى ببساطة عن طريق سحب العينات تجعل النهج أكثر جاذبية من خلال تمكين التجارب عالية الإنتاجية المدعومة من روبوتات مناولة السوائل34,35. بينما تم الإبلاغ عن نجاحات في استخدام CFPS للنماذج الأولية ، من المهم ملاحظة أنه يبقى أن نرى تحت أي سياقات يمكن لنتائج CFPS التنبؤ بشكل موثوق بالوظائف في الخلايا.
هنا ، نقدم طريقة للنماذج الأولية CFPS التي تؤكد على مزايا السرعة والإنتاجية والتكلفة مقارنة بالأساليب التقليدية القائمة على الخلايا. النهج مشتق من عملنا السابق حيث استخدمنا CFPS لتوصيف مكتبة من متغيرات المروج T7 التي ينظمها عامل النسخ TetR32 بسرعة ، والتوسع بشكل كبير في حفنة صغيرة من متغيرات مروج T7 المنظمة التي كانت متوفرة في الأدبيات في ذلك الوقت36,37. ومنذ ذلك الحين، قام آخرون بتوسيع نطاق هؤلاء المروجين38. في طريقتنا ، يتم تسريع تجميع البناء الجيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم قالب الحمض النووي عبر البادئات التي تضيف أجزاء وراثية متغيرة إلى جين المراسل. يتم استخدام معالجة السوائل الصوتية في 384 لوحة بئر لزيادة الإنتاجية وتقليل حجم المواد المطلوبة. أظهرت الأعمال السابقة الاستخدام الناجح لمعالجة السوائل الصوتية بكميات أقل بكثير39,40 مع تباين مماثل للسحب اليدوي لأحجام أكبر 41. بالإضافة إلى الطريقة ، نقدم معلومات استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييم الوفورات المحتملة في التكلفة والوقت. لاحظ أنه بينما نقوم بتضمين بروتوكول لإنتاج محللات خالية من الخلايا بناء على Sun et al.42 هنا ، يجب أن تعمل أيضا العديد من المجموعات والبروتوكولات التجارية الأخرى43,44. وبالمثل ، بينما نوضح طريقة توصيف متغيرات المروج32 ، يمكن تبديل الأجزاء الأخرى عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل منظمات الريبو ، ومواقع ربط الريبوسوم (RBSs) ، والعوازل ، وعلامات البروتين ، والنهايات. نأمل أن تساعد هذه المنهجية مجتمع البيولوجيا التركيبية على الاستمرار في زيادة عدد الأجزاء المميزة لتجميع الدوائر الجينية التي يمكن التنبؤ بها ذات الوظيفة المفيدة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x YT medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2377-250G</td>
			<td>Alternative to making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td>For plating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (5 cm diameter)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>731-1550</td>
			<td>Used for protein purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destination plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc plate</td>
			<td>142761</td>
			<td>For CFPS reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L</td>
			<td>For digestion of plasmid templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>20871723</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) Rosetta2</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70954</td>
			<td>Cell line used for production of lysate and purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>525</td>
			<td>Acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell</td>
			<td>Thermo Spectronic</td>
			<td>FA-078</td>
			<td>For lysing cells for CFPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impermeable plastic sealable lid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>232702</td>
			<td>Plate seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>RPI</td>
			<td>I56000-25.0</td>
			<td>Used for protein induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g1501-500G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo source plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>PL-05525</td>
			<td>For use with Echo acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td>For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>For production of purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR H2O</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>H10</td>
			<td>Plate reader used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494S</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28606</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSonica Ultrasonic Processor</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q700</td>
			<td>Cell disruption during protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>Updated supplier from Sun et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T7293</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid characterization of genetic parts with cell-free systems

يعد توصيف الأجزاء الجينية وفهرستها أمرا بالغ الأهمية لتصميم الدوائر الجينية المفيدة. يسمح وجود أجزاء مميزة جيدا بضبط الدوائر الجينية ، بحيث تؤدي وظيفتها إلى نتائج يمكن التنبؤ بها. مع نمو البيولوجيا التركيبية كمجال ، كان هناك انفجار في الدوائر الجينية التي تم تنفيذها في الميكروبات لتنفيذ الوظائف المتعلقة بالاستشعار والتغيير الأيضي والحوسبة الخلوية. هنا ، نعرض طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتوصيف الأجزاء الجينية. تستخدم طريقتنا محللة خالية من الخلايا ، يتم إعدادها داخليا كوسيلة لتقييم الأجزاء عن طريق التعبير عن بروتين المراسل. يتم تحضير قالب الحمض النووي عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مواد أولية غير مكلفة لإضافة أجزاء مختلفة إلى جين المراسل ، ويضاف القالب إلى التفاعل كحمض نووي خطي بدون استنساخ. تشمل الأجزاء التي يمكن إضافتها بهذه الطريقة المروجين والمشغلين ومواقع ربط الريبوسوم والعوازل والنهايات. يسمح هذا النهج ، جنبا إلى جنب مع دمج معالج سائل صوتي وألواح 384 بئر ، للمستخدم بإجراء تقييمات عالية الإنتاجية للأجزاء الجينية في يوم واحد. وبالمقارنة، تتطلب نهج الفحص القائم على الخلايا استنساخا مستهلكا للوقت ولها أوقات اختبار أطول بسبب خطوات تطبيع الثقافة وكثافة الثقافة بين عشية وضحاها. علاوة على ذلك ، فإن العمل في المحللة الخالية من الخلايا يسمح للمستخدم بالتحكم بشكل أكثر إحكاما في ظروف التعبير من خلال إضافة مكونات خارجية وحمض نووي بتركيزات دقيقة. يمكن استخدام النتائج التي تم الحصول عليها من الفحص الخالي من الخلايا مباشرة في تطبيقات الأنظمة الخالية من الخلايا أو ، في بعض الحالات ، كطريقة للتنبؤ بالوظيفة في الخلايا بأكملها.

لإثبات فائدة أساليبنا ، نقدم النتائج التي تصف آثار قرب تسلسل tetO من مروج T7 على تنظيم التعبير المدفوع ب T7 RNAP. يمكن العثور على النتائج الكاملة وآثارها في عمل McManus et al.32. يتم وصف سير العمل في الشكل 1. تم إعداد خمسة عشر نموذجا خطيا ، تختلف فقط في مسافة مروج T7 بالنسبة إلى تسلسل tetO ، عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمراسل sfGFP باستخدام مواد أولية مصممة لإضافة كل متغير مروج (الشكل 2) كما هو موضح في القسم 2 من البروتوكول. تم تحضير مكونات تفاعل CFPS والتفاعلات باتباع البروتوكول. تم قياس تعبير sfGFP من كل قالب بمعايرة 12 تركيزا مختلفا من بروتين TetR ، في ثلاث نسخ ، باستخدام معالج سائل صوتي. عند 36 تفاعل CFPS لكل قالب و 15 نموذجا ، تم إجراء ما مجموعه 540 تفاعلا لمجموعة كاملة من مجموعات T7-tetO . تم إجراء التقييم بأكمله على لوحين في قارئين للوحة. أظهر تحليل هذه البيانات أن T7 RNAP ينظم التعبير المدفوع ب T7 بالتساوي حتى 13 نقطة أساس في اتجاه مجرى النهر من بداية نسخة T7 (الشكل 3). هذه النتيجة لها آثار على التصميم المستقبلي لدوائر الجينات التي يحركها T7 القابلة للتنظيم من خلال وصف نافذة مفترضة لقمع فعال ل T7 من قبل مثبطات أخرى. كشفت مقارنة نتائج البروتوكول الموصوف هنا مع الحمض النووي الذي أعده الاستنساخ التقليدي عن اختلاف صغير ولكنه ذو دلالة إحصائية في درجة قمع TetR بين الأشكال. افترضنا أن الارتباط غير المحدد ل TetR بالحمض النووي المتجه يمكن أن يفسر الاختلاف الملحوظ. أظهرت النتائج التجريبية أن إضافة الحمض النووي المتجه الخطي إلى التفاعلات مع قالب الحمض النووي الخطي قلل من الاختلاف إلى دلالة غير إحصائية ، على الرغم من أنها لم تستبعد المساهمات من عوامل أخرى ، مثل الاختلافات في دورية حلزون الحمض النووي للأشكال الخطية مقابل الدائرية ، والتي بدورها يمكن أن تؤثر على ربط TetR. اعتمادا على التطبيق ، قد يتطلب استخدام القالب الخطي التحقق من صحة إضافية.
نقوم أيضا بتضمين بيانات تمثيلية حول المشكلات المحتملة مع التوزيع الدقيق باستخدام معالجة السوائل الصوتية (الشكل 4). تم استخدام محلول ملحي 1x فوسفات مخزن (PBS) ، الرقم الهيدروجيني 7.4 الذي يحتوي على صبغة تارترازين 0.25 mM لتقييم طريقتين لبرمجة معالج سائل صوتي لتوزيع الأحجام >1 ميكرولتر. بعد توزيع السائل ، تم إغلاق لوحة الوجهة وطردها بالطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وتم قياس الامتصاص عند 425 نانومتر باستخدام قارئ اللوحة. يتم عرض النتائج التمثيلية لتسع تجارب وتظهر توزيعا أكثر اتساقا عبر سلسلة من ثمانية آبار وجهة عندما يتم تقسيم نقل 5 ميكرولتر إلى توزيعات منفصلة 1 ميكرولتر. بناء على هذه الملاحظات ، يوصى بتقسيم عمليات النقل >1 ميكرولتر إلى عمليات نقل متعددة بقيمة ≤1 ميكرولتر. راجع قسم المناقشة لمزيد من التفاصيل حول استكشاف أخطاء هذا الجانب المهم من البروتوكول وإصلاحها.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig01.jpg"> الشكل 1: سير العمل ليوم واحد لتقييم أجزاء المروج في مستخلص خال من الخلايا. (أ) يتم تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مواد أولية تحتوي على أجزاء وراثية ليتم تقييمها (2-5 ساعات). (ب) يتم تحضير مزيج التفاعل الخالي من الخلايا كما هو مفصل في البروتوكول وتوزيعه في لوحة 384 بئر مع قوالب مضخمة PCR (30 دقيقة). (ج) تستخدم معالجة السوائل الصوتية لتوزيع مكونات إضافية ، والتي يمكن أن تشمل البروتينات المثبطة ، وجزيئات المستجيب ، وأي مستجيبات شرطية أخرى (10 دقائق). (د) يتم قياس تعبير بروتين المراسل من كل تفاعل في قارئ لوحة (2-16 ساعة ، اعتمادا على وصفة CFPS والبناء). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig02.jpg"> الشكل 2: تصميم تمهيدي لإضافة أجزاء جينية إلى جين مراسل عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل . (أ) سيتم تضخيم جين مراسل sfGFP (أخضر) لإضافة RBS (أحمر) ومروج T7 (أزرق) بواسطة PCR. (ب) سيتم تضخيم sfGFP (أخضر) و RBS (أحمر) لإضافة تسلسل tetO (ذهبي) ومروج T7 (أزرق) بواسطة PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig03.jpg"> الشكل 3: تأثير موضع tetO على تنظيم تعبير يحركه T7. تطبيع قيم القمع القصوى للقالب الخطي والدائري كدالة لموضع tetO . تمثل التتبعات المتوسط والانحرافات المعيارية لثلاث نسخ متماثلة. تم تعديل هذا الرقم من McManus et al.32 بموجب ترخيص المشاع الإبداعي CC-BY. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig04.jpg"> الشكل 4: استخدام صبغة التارتازين للتحقق من صحة توزيع السوائل باستخدام معالج سائل صوتي. تشير الأشرطة السوداء إلى توزيع 5 ميكرولتر من محلول التارتازين من بئر مصدر واحد في كل من الآبار الوجهة الثمانية المتتالية للوحة 384 بئرا باستخدام أمر برمجة واحد. تشير الأشرطة الرمادية إلى توزيع 1 ميكرولتر من بئر مصدر واحد في كل من آبار الوجهة الثمانية المتتالية باستخدام أمر برمجة واحد ، ثم تكرار هذه الخطوة أربع مرات ليصبح المجموع 5 ميكرولتر موزعة في كل بئر وجهة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>اسم المكون</td>
			<td>حجم 1 تفاعل (ميكرولتر)</td>
			<td>حجم 110٪ من X عدد التفاعلات (ميكرولتر)</td>
		</tr><tr><td>Q5 PCR بريمكس</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>الماء</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>القالب (1–3 نانوغرام/ميكرولتر)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(إذا تم إصلاحه1) التمهيدي الأمامي (5 ميكرومتر)</td>
			<td>0 أو 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(إذا تم إصلاحه1) التمهيدي العكسي (5 ميكرومتر)</td>
			<td>0 أو 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ماستر ميكس توتال:</td>
			<td>30 أو 40</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(إذا كان المتغير1) التمهيدي الأمامي (5 ميكرومتر)</td>
			<td>0 أو 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(إذا كان المتغير1) التمهيدي العكسي (5 ميكرومتر)</td>
			<td>0 أو 10</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: ورقة عمل لإعداد الكواشف لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن للمستخدمين ملء القيم الموجودة في العمود الموجود في أقصى اليمين اعتمادا على العدد المقصود من التفاعلات. 1 تحتوي البادئات المتغيرة على جزء معين لإضافته في تفاعل PCR ويمكن أن يكون التمهيدي الأمامي أو التمهيدي العكسي أو كليهما. البادئات الثابتة لا تضيف جزءا ويمكن أن تكون التمهيدي الأمامي أو التمهيدي العكسي ولكن ليس كلاهما.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>اسم المكون</td>
			<td>حجم 1 تفاعل (ميكرولتر)</td>
			<td>حجم 110٪ من X عدد التفاعلات (ميكرولتر)</td>
		</tr><tr><td>مستخلص الخلية</td>
			<td>4.2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ملحق ميكس</td>
			<td>3.3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>بروتين GamS (207 ميكرومتر)</td>
			<td>0.15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>قالب الحمض النووي (20 نانومتر)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>T7 بوليميراز (13 مجم / مل)</td>
			<td>0.12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>الماء</td>
			<td>0.73 (قد يختلف هذا الرقم)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ماستر ميكس توتال:</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>البروتين الكابت:</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: ورقة عمل لإعداد الكواشف لتفاعلات CFPS. يمكن للمستخدمين ملء القيم الموجودة في العمود الموجود في أقصى اليمين اعتمادا على العدد المقصود من التفاعلات.
الجدول التكميلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/Table%20S1%20-%20cost%20estimates_REV%20EDITS.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

الأجزاء الجينية ذات المواصفات الجيدة ضرورية لتصميم دوائر وراثية جديدة. هنا نصف طريقة فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية لتوصيف الأجزاء الجينية بسرعة. تقلل طريقتنا من التكلفة والوقت من خلال الجمع بين المحللات الخالية من الخلايا ، والحمض النووي الخطي لتجنب الاستنساخ ، ومعالجة السوائل الصوتية لزيادة الإنتاجية وتقليل أحجام التفاعل.

التوصيف السريع للأجزاء الجينية بأنظمة خالية من الخلايا

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

تسمح طريقتنا بالتوصيف السريع للأجزاء الجينية باستخدام أنظمة التعبير الخالية من الخلايا وتفاعل البوليميراز المتسلسل بدلا من الاستنساخ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي ما يستغرق عادة من أيام إلى أسابيع في الخلايا يمكن القيام به في ساعات إلى أيام باستخدام هذه الطريقة. يتضمن بروتوكولنا خطوات لإنشاء أنظمة التعبير الخالية من الخلايا الخاصة بك ، والتي يمكن أن تكون صعبة في عدد من الأماكن وقد تتطلب تعديلات حسب حالة الاستخدام.عند البدء لأول مرة ، نوصي بالبدء بمجموعات تجارية. ابدأ بإعداد مزيج PCR الرئيسي وفقا للتعليمات الواردة في المخطوطة وتخزينه على الجليد. حصة 30 أو 40 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في العدد المحدد من أنابيب PCR وإضافة 10 ميكرولتر من كل خمسة بادئات متغيرة ميكرومولار إلى أنابيب PCR ذات العلامات المناسبة.ضع أنابيب PCR في العجلة الحرارية وقم بتشغيل برنامج PCR كما هو مذكور في مخطوطة النص. ثم أمسك التفاعلات عند أربع درجات سلزية. إذا كان القالب الأصلي هو الحمض النووي للبلازما ، فأضف ميكرولترا واحدا من إنزيم تقييد DpnI لهضم القالب الأصلي واحتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.قم بتحليل خمسة ميكرولتر من كل منتج PCR عن طريق فصلها باستخدام هلام أغاروز 1٪ عند 180 فولت لمدة 20 دقيقة. تحقق من حجم النطاق الصحيح ، والذي سيختلف باختلاف التسلسل الأساسي المختار وطول الأجزاء المضافة. تنقية القوالب الخطية باستخدام مجموعة تنقية PCR التجارية.في حالة وجود نطاقات متعددة عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي ، قم باستئصال النطاقات ذات الأهمية من الجل وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الجل التجارية ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. حدد كل قالب من قوالب الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، وقم بتقييم جودته عن طريق التحقق من أن نسبة 260 إلى 280 نانومتر تبلغ حوالي 1.8. قم بإذابة جميع المكونات على الجليد وقم بإعداد مزيج رئيسي عن طريق خلط جميع المكونات جيدا باستخدام ماصة ، كما هو مذكور في المخطوطة.انتبه جيدا لتجنب هطول الأمطار ، خاصة بالنسبة لخليط الأحماض الأمينية. الحفاظ على مزيج ماستر على الجليد. قم بتبريد طبق 384 بئرا على الثلج ووزع المزيج الرئيسي في تسعة ميكرولتر في كل بئر.قم بإذابة البروتين الكابت على الثلج وتوزيعه في لوحة مصدر معالجة السوائل الصوتية ، مما يضمن تضمين الكمية المناسبة من الحجم الميت المطلوب لنوع لوحة المصدر المستخدمة. قم بتوزيع البروتين الكابت في أحجام ميكرولتر واحد في الآبار الوجهة المناسبة عبر معالج السائل. قم بتضمين تخفيف تسلسلي للمراسل المنقى أو معيار كيميائي مناسب على اللوحة لمقارنة النتائج مع الدراسات الأخرى والمختبرات الأخرى.اختر مجموعة من التركيزات المناسبة للمراسل المستخدم في نطاق التعبير المتوقع للتجارب. قم بتسخين قارئ اللوحة إلى 30 درجة مئوية. إذا أمكن ، على الجهاز ، اضبط تدرج درجة حرارة عمودي بدرجة مئوية واحدة للحد من التكثيف على الختم.اضبط قارئ اللوحة على القراءة في الإعدادات المناسبة للمراسل المستخدم في التسلسل الأساسي ، دون اهتزاز الخطوات. أغلق اللوحة التي يبلغ عدد 384 بئرا بختم بلاستيكي غير منفذ لمنع التبخر. ضع اللوحة التي تحتوي على 384 بئرا على حامل اللوحة وابدأ القراءة.تم إعداد 15 نموذجا خطيا ، تختلف فقط في مسافة مروج T7 بالنسبة إلى تسلسل tetO ، بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما أدى إلى تضخيم مراسل البروتين الفلوري الأخضر فائق الحجم ، مع مواد أولية مصممة لإضافة كل متغير من أنواع المروج. أظهر تحليل البيانات من إجمالي 540 تفاعلا لمجموعة كاملة من مجموعات T7 tetO أن بوليميراز T7 RNA ينظم التعبير المدفوع ب T7 بالتساوي ، حتى من خلال 13 زوجا من القواعد في اتجاه مجرى النهر من بداية نسخة T7. لوحظ توزيع أكثر اتساقا عبر سلسلة من ثمانية آبار وجهة باستخدام معالج السائل الصوتي عندما تم تقسيم نقل خمسة ميكرولتر إلى توزيعات منفصلة بحجم ميكرولتر واحد.يمكن استخدام بروتوكولنا لفحص المكونات الجينية بسرعة ، سواء لفحص أجهزة الاستشعار الحيوية الجديدة أو بناء مكتبات الأجزاء الجينية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

توصيف النظم المعقدة باستخدام تصميم التجارب النهج: عابر التعبير البروتين في التبغ كدراسة حالة

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

صالحة قابل للغلق غرفة فيمتولتر مجانا خلية علم الأحياء

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

الزخرفة مطروح السريع لطبقات الخلايا الحية مع التحقيق ميكروفلويديك

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

منصة ميكروفلويدريك متعددة الطبقات لتوصيل التعبير الجيني الخالي من الخلايا لفترات طويلة

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

OnePot PURE Cell-Free System

نظام خلية ونبوت PURE الخالي من الخلايا

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

طرق سريعة انزيمية لتضخيم الحد الأدنى من القوالب الخطية لنماذج البروتين باستخدام أنظمة خالية من الخلايا

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...