Name: rapid characterization of genetic parts with cell-free systems
Uploaded: 2021-08-30T14:00:00
Duration: 5 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Dette arbejde blev muliggjort af forsvarsministerens kontor for anvendt forskning til fremme af videnskab og teknologi prioriteter program. Vi takker Scott Walper (Naval Research Laboratory) for at levere lageret af anvendt sfGFP og Zachary Sun og Abel Chiao (Tierra Biosciences) for frugtbare diskussioner relateret til prototyping med cellefrie systemer og relateret fejlfinding af akustisk væskehåndtering.

1. Fremstilling af celleekstrakt
<ol><li>Forberedelse af medier<ol><li>For 2xYT-medier: Tilsæt 16 g trypton, 10 g gærekstrakt og 5 g NaCl til 900 ml deioniseret vand, og juster pH-værdien til 7,0 med 5 M NaOH. Opløsningsvolumenet hæves til 1 liter ved hjælp af deioniseret vand og autoklave eller filtersterilisering. Alternativt kan du købe 2xYT-medier.</li>
		<li>Til S30B-buffer: Der fremstilles en opløsning af 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat og 5 mM Tris i 2 liter deioniseret vand. Brug 2 M Tris til at justere pH til 8,2, autoklave og opbevar ved 4 °C. Opløsningen færdiggøres ved at tilsætte dithiothreitol (DTT) til en slutkoncentration på 1 mM lige før brug.</li>
	</ol></li>
	<li>Fremstilling af celler<ol><li>Streak Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta2-celler eller anden valgt cellelinje (se Cole et al.44 for en nylig omfattende gennemgang) på en LB (Lysogeny Broth) agarplade og inkuberes ved 37 ° C i 10-14 timer.</li>
		<li>Brug en enkelt E. coli-koloni til at inokulere 3 ml 2xYT-medium i et 10 ml kulturrør. Reagensglasset inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 250 o/min i 8 timer.</li>
		<li>Brug 50 μL fra 3 ml kulturen til at pode 50 ml 2xYT medium i en 500 ml kolbe. Denne kolbe inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 250 o/min i 8 timer.</li>
		<li>Brug 7,5 ml fra 50 ml kulturen til at inokulere hver af fire 4 L forvirrede kolber indeholdende 0,75 L 2xYT medium. Disse kolber inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 220 o/min, indtil de efter ca. 3-4 timer har nået en optisk densitet ved 600 nm på 2 til 4.</li>
		<li>Cellerne høstes fra hver kolbe ved at overføre dem til 1 liter beholdere og centrifugere ved 5.000 x g i 12 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres ved dekantering i en affaldsbeholder.</li>
		<li>Hver cellepille vaskes med 150 ml iskold S30B-buffer ved at resuspendere dem fuldstændigt ved hjælp af en pipette for at forstyrre cellemassen, og cellerne opsamles derefter igen ved centrifugering ved 5.000 x g i 12 minutter. Supernatanten kasseres.</li>
		<li>Hver cellepille vaskes igen i 40 ml iskold S30B-buffer ved at resuspendere dem fuldstændigt og forstyrre cellemassen ved hjælp af en pipette. Cellerne overføres til forvejede 50 ml koniske rør, og cellerne opsamles igen ved centrifugering ved 2.000 x g i 8 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres ved dekantering.</li>
		<li>Vej de våde cellepiller. Flash-frys cellepillerne ved at anbringe rørene direkte i flydende nitrogen og opbevar ved -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellelyse<ol><li>Optø cellepillerne på is.</li>
		<li>Hver cellepille resuspenderes i 1,4 ml S30B-buffer pr. 1 g cellepellet ved hvirvelstrøm.</li>
		<li>Lyser cellerne med fransk trykcelle ved 640 psi ved 4 °C. Lysatet opsamles i mikrocentrifugeglas på is, og der tilsættes 3 μL 1 M DTT pr. 1 ml lysat umiddelbart efter lysis. BEMÆRK: Det er bedst at trykke på den franske presseudløserventil med en lille metalstang for at opretholde et jævnt tryk og undgå pludselige trykfald.</li>
		<li>Lysatet renses ved centrifugering ved 30.000 x g i 30 minutter ved 4 °C, og pelletsen kasseres, efter at supernatanten er pipetteret til et nyt iskoldt mikrocentrifugerør, idet pelletsen ikke forstyrres.</li>
		<li>Supernatanten centrifugeres endnu en gang ved 30.000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Den resulterende supernatant pipetteres ned i et iskoldt mikrocentrifugeglas. Kassér pelleten.</li>
		<li>Supernatanten inkuberes i 37 °C vandbad i 1 time.</li>
		<li>Supernatanten renses ved centrifugering ved 15.000 x g i 15 minutter ved 4 °C, og den deraf resulterende supernatant overføres til et iskoldt mikrocentrifugeglas, idet pelletten ikke forstyrres.</li>
		<li>Supernatanten centrifugeres endnu en gang ved 15.000 x g i 15 minutter ved 4 °C, og den deraf resulterende supernatant overføres til et iskoldt mikrocentrifugeglas, idet det sikres, at resterende pellet ikke afbrydes.</li>
		<li>Supernatanten fordeles i 100 μL alikvoter i 1,5 ml mikrocentrifugeglas og lynfryses ved at anbringe dem direkte i flydende nitrogen. Supernatanten opbevares ved -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lineær skabelon forberedelse
<ol><li>Primer design<ol><li>Vælg en kernesekvens som PCR-skabelon. Inkluder som minimum en reportersekvens, såsom sfGFP (superfolder Green Fluorescent Protein), LacZ eller Spinat aptamer. Medtag andre dele, der vil blive fastgjort på tværs af screenede varianter, såsom terminatorer, promotorer eller RBS'er, alt efter hvad der er relevant for designet. BEMÆRK: Inkludering af en terminator er ikke altid nødvendig for ekspression fra lineært DNA i cellefrie systemer.</li>
		<li>For de fremadgående primere skal du vælge mindst 20 bp, der matcher 5ʹ-enden af kernesekvensen som 3ʹ-enden af primeren. Hvis du tilføjer dele til 5′-enden af konstruktionen, skal du designe resten af 5ʹ-enden af primeren for at tilføje de genetiske dele af interesse til kernesekvensen via PCR-amplifikation (figur 1A og figur 2). BEMÆRK: Da primere over ~ 60 bp ofte stiger dramatisk i omkostninger, kan flere overlappende primere designes til at tilføje længere sekvenser eller flere dele. Mens flere primere kan bruges i en enkelt PCR-reaktion, anbefales det at udføre flere runder PCR.</li>
		<li>For de omvendte primere skal du vælge mindst 20 bp for at matche 3′-enden af kernesekvensen som 3ʹ-enden af primeren. Hvis du tilføjer dele til 3′-enden af konstruktionen, skal du designe resten af 5ʹ-enden af primeren for at tilføje de genetiske dele af interesse til kernesekvensen via PCR-amplifikation (figur 1A og figur 2). Sørg for, at den omvendte primers udglødningstemperatur ligger inden for 5 °C af udglødningstemperaturen for hele den fremadgående primer.</li>
	</ol></li>
	<li>Lineær skabelonforstærkning<ol><li>Bestem antallet af PCR-reaktioner, der skal udføres, baseret på antallet af kernesekvenser, og beregn mængden af hver komponent, der kræves, ved hjælp af tabel 1.</li>
		<li>Forbered masterblandingen i henhold til tabel 1 og opbevar den på is. Alikvote 30 eller 40 μL (se tabel 1) af masterblandingen i det bestemte antal PCR-reagensglas og tilsættes 10 μL af hver variabel primer (dvs. primere, der koder for en delændring, se tabel 1) ved 5 μM til korrekt mærkede PCR-rør.</li>
		<li>Anbring PCR-rørene i termocyklisten, og kør følgende PCR-program: 98 °C i 3 minutter; 30 cyklusser a 98 °C i 15 s, XX °C i 20 s, 72 °C i YY min; endelig forlængelse ved 72 °C i 10 min. Derefter holdes reaktionen ved 4 °C. Hvor XX repræsenterer udglødningstemperaturen for primeren med den nedre udglødningstemperatur, og YY repræsenterer forlængelsestiden beregnet for amplikonens længde baseret på producentens anbefalinger for den anvendte high-fidelity-polymerase. Optimer disse forhold efter behov for forskellige primere og/eller skabeloner.</li>
		<li>(Valgfrit) Tilsæt 1 μL DpnI-restriktionsenzym for at fordøje den originale skabelon. Reaktionen inkuberes ved 37 °C i 1 time. Udfør kun dette trin, hvis den originale skabelon er plasmid-DNA.</li>
		<li>Analyser 5 μL af hvert PCR-produkt ved gelelektroforese. Udskil produktet med en 1% agarosegel ved 180 V i 20 min. Kontroller for den korrekte båndstørrelse, som varierer med den valgte kernesekvens og længden af de tilføjede dele.</li>
	</ol></li>
	<li>Rens den lineære skabelon ved hjælp af et kommercielt PCR-rensningssæt eller ved den foretrukne PCR-oprydningsmetode. Hvis flere bånd var til stede ved gelelektroforeseanalyse, skal du enten optimere PCR-betingelserne eller rense de korrekte molekylvægtbånd ved hjælp af et kommercielt gelekstraktionssæt i henhold til producentens anbefaling.</li>
	<li>Kvantificer hver DNA-skabelon ved hjælp af et spektrofotometer. Vurder DNA-skabelonens kvalitet ved at kontrollere, at forholdet 260 nm/280 nm er ca. 1,8.</li>
	<li>(Valgfrit) Adskil igen en del af DNA-skabelonen ved hjælp af en 1% agarosegel ved 180 V i 20 minutter, og sørg for, at eventuelle uønskede bånd blev fjernet under skabelonrensning.</li>
	<li>Brug straks oprensede DNA-skabeloner eller opbevar ved -20 °C.</li>
</ol>3. Renset proteinpræparat
<ol><li>Protein ekspression<ol><li>For hvert protein, der skal udtrykkes, samles en passende ekspressionskonstruktion. Codon-optimere genet til ekspression i E. coli. Genet indsættes i en pET-22b-ekspressionsvektor eller anden passende ekspressionsvektor via den foretrukne plasmidsamlingsmetode. Omdan ekspressionsplasmidet til BL21(DE3) Rosetta2-ekspressionsceller eller anden passende cellelinje.</li>
		<li>For hvert protein skal du bruge en enkelt koloni til at inokulere 3 ml LB-medium i et 10 ml kulturrør. Disse glas inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 250 o/min natten over.</li>
		<li>En 2 L kolbe indeholdende 750 ml LB-substrat podes med 1 ml dag-til-dag-kultur. Disse kolber inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 250 o/min., indtil de når en OD600 på 0,6-1,0.</li>
		<li>Der induceres proteinekspression ved at tilsætte 0,75 ml 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) i vand til hver kolbe og fortsætte med at inkubere kolberne ved 37 °C under omrystning ved 250 o/min i 4 timer.</li>
		<li>Cellerne fra hver kolbe høstes ved hjælp af en 1 L centrifugeflaske ved centrifugering ved 5.000 x g i 12 minutter. Supernatanten kasseres.</li>
		<li>Overfør pellets til et 50 ml konisk rør og vej hver pellet. Cellerne lynfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C, eller trin 3.2 fortsættes. BEMÆRK: 2-5 g celler pr. 0,75 ml forventes at være resultatet af dette trin.</li>
	</ol></li>
	<li>Proteinoprensning ved nikkelaffinitetssøjlekromatografi<ol><li>Forbered lysisbufferen ved at kombinere 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl og 5 mM imidazol. Juster til pH 8,0.</li>
		<li>Klargør vaskebufferen ved at kombinere 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl og 25 mM imidazol. Juster til pH 8,0.</li>
		<li>Elueringsbufferen fremstilles ved at kombinere 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl og 250 mM imidazol. Juster til pH 8,0.</li>
		<li>Forbered dialysebufferen ved at kombinere 50 mM NaHPO4, 100 mM NaCl og 2% DMSO. Juster til pH 7,5.</li>
		<li>Optø cellepillerne ved at placere rørene i stuetemperaturvand. Der tilsættes 5 ml lysisbuffer pr. 1 g cellepellet og resuspenderes ved hvirvelstrøm.</li>
		<li>Lyse cellerne ved sonikering. Adskil cellehomogenatet, så der ikke er mere end 30 ml pr. 50 ml konisk rør, og hold hvert rør på is. Lys cellerne ved hjælp af en sonikator med en 0,16 cm diameter sonde i 15 s runder med 30 s pauser, 10 gange. BEMÆRK: Undgå skumdannelse, da dette denaturerer proteinet. Dannelsen af skum kan undgås ved at holde sonikatorspidsen mindst 2/3 nedsænket i lysatet, mens det er i drift. Andre metoder til cellelyse udover sonikering er også mulige44.</li>
		<li>Lysatet klares ved centrifugering ved 15.000 x g i 30 minutter ved 4 °C, og supernatanten anbringes i et nyt 50 ml konisk glas.</li>
		<li>Der tilsættes 1 ml nikkel-nitrilotrieddikesyreharpiks (Ni-NTA) for hver 5 ml supernatant. Del cellelysat/Ni-NTA-opslæmningen, så der ikke er mere end 36 ml pr. 50 ml konisk rør. Der inkuberes ved 4 °C på en rørrotator ved 10 o/min i 1 time.</li>
		<li>Læg harpiksen ved at dekantere cellelysat/Ni-NTA-opslæmningen i en 2 ml sengevolumenkromatografikolonne, og opsaml elueringsmidlet, hvis det er nødvendigt til yderligere analyse, ellers kasseres det. Vask harpiksen med 10 harpiks seng mængder vaskebuffer.</li>
		<li>Opsaml proteinet ved at tilsætte tre harpikslejevolumener elueringsbuffer til søjlen og koncentrer volumenet til 1,5 ml ved hjælp af en centrifugalkoncentrator med den passende molekylvægtsafskæringsmembran for hvert protein.</li>
		<li>Dialysere proteinet mod 2 liter dialysebuffer ved 4 °C i 1 time. Dialyser proteinet igen mod 2 liter dialysebuffer natten over ved 4 °C.</li>
		<li>Kvantificer proteinet ved hjælp af dets molære ekstinktionskoefficient og absorbans ved 280 nm. Analyser proteinet for renhed ved at adskille det ved hjælp af natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Opbevar proteinet ved -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Cellefri proteinsyntese
<ol><li>Fremstilling af CFPS-reaktionsblanding<ol><li>Forbered tilskudsblandingen ved at følge aminosyreopløsningspræparatet, energiopløsningsforberedelsen og bufferpræparationstrinnene i Sun et al.42. Opbevares separat eller kombineret ved -80 °C i alikvoter. Sørg for, at de endelige koncentrationer svarer til dem, der er beskrevet i Sun et al.42 i afsnittet Eksperimentel udførelse af en TX-TL-reaktion.</li>
		<li>Forbered et additiv for at beskytte lineært DNA mod nedbrydning. Hvis du bruger GamS33,45, skal du forberede dig via trin i afsnit 3 ovenfor eller få fra en kommerciel leverandør; For andre tilgange, tjek den tilsvarende litteratur46,47,48. Alternativt kan du anvende et CFPS-system, der ikke kræver additiver49.</li>
		<li>Forbered T7-polymerase, repressorproteiner og andre additiver ved hjælp af trinnene i afsnit 3 ovenfor, eller få dem fra en kommerciel leverandør.</li>
		<li>Antallet af CFPS-reaktioner, der skal udføres, bestemmes, og den nødvendige mængde af hver komponent beregnes ved hjælp af tabel 2. Komponenternes koncentrationer ændres, herunder tilføjes eller fjernes komponenter efter behov, og vandmængden justeres, således at det endelige volumen af hver reaktionsblanding altid er 10 μL. På samme måde skal du ændre masterblandingen for at lette dispensering af andre komponenter ved akustisk væskehåndtering efter ønske (se diskussionsafsnittet ).</li>
		<li>Optø alle komponenterne på is, og forbered en masterblanding ved at blande hver komponent som beregnet ovenfor. Bland alle komponenterne grundigt med pipette. Vær opmærksom på at undgå nedbør, især for aminosyreblandingen. Hold masterblandingen på is.</li>
		<li>En plade med 384 brønde afkøles på is, og masterblandingen fordeles i 9 μL alikvoter i hvert hul. BEMÆRK: Det er muligt at distribuere disse komponenter ved akustisk væskehåndtering, selvom man skal sørge for korrekt dispensering (se diskussionsafsnittet for fejlfinding).</li>
	</ol></li>
	<li>Distribution af yderligere komponenter ved akustisk væskehåndtering<ol><li>Beregn mængden af repressorprotein (og andre valgfrie komponenter), der kræves til alle CFPS-reaktioner.</li>
		<li>Optø repressorproteinet på is og fordel det i en akustisk væskehåndteringskildeplade eller anden passende plade. Sørg for, at den passende mængde dødvolumen, der kræves til den anvendte type kildeplade, er inkluderet.</li>
		<li>Repressorproteinet fordeles i volumener på 1 μL i de relevante brønde via væskehåndtereren. Du kan finde flere oplysninger om fejlfinding i distributionen i afsnittet Diskussion. </li>
	</ol></li>
	<li>Standardkurver<ol><li>Der anbringes en seriel fortynding af den oprensede indberetter (se punkt 3 for proteinoprensning)41 eller passende kemisk standard50 på pladen for at muliggøre sammenligning af resultater med andre undersøgelser og andre laboratorier. Vælg et koncentrationsinterval, der passer til den anvendte indberetter, og det forventede ekspressionsområde for eksperimenterne.</li>
	</ol></li>
	<li>Kørsel af CFPS-reaktioner<ol><li>Forvarm pladelæseren til 30 °C. Indstil pladelæseren til at læse ved indstillinger, der passer til den reporter, der bruges i kernesekvensen, uden at ryste trin. BEMÆRK: Mens 30 ° C bruges her, er 29 ° C og 37 ° C også almindeligt anvendte og fungerer godt med denne protokol. Andre temperaturer kan foretrækkes til alternative cellefrie reaktionspræparater. For læseintervaller er 10 min tilstrækkelig til at opnå en god opløsning for de repræsentative data, der præsenteres her; Andre opløsninger kan dog være bedre afhængigt af reporterproteinet og den særlige CFPS-opskrift.</li>
		<li>(Valgfrit) Kør først en testreaktion for at indstille den passende forstærknings- eller følsomhedsindstilling for at fange ændringen i fluorescens uden signaloverløb.</li>
		<li>Forsegl pladen med 384 brønde med et uigennemtrængeligt plastforseglbart låg for at forhindre fordampning. Hvis det er muligt, indstilles en lodret temperaturgradient på 1 °C på instrumentet for at begrænse kondensering på tætningen. Placer pladen med 384 brønde på pladeholderen, og begynd at læse.</li>
	</ol></li>
</ol>

RMM har en økonomisk andel i Tierra Biosciences, en privat virksomhed, der gør brug af cellefrie teknologier som dem, der er beskrevet i denne artikel til proteinekspression og screening.
De andre forfattere har intet at afsløre.

De her beskrevne protokoller giver et omkostningseffektivt og hurtigt middel til at screene genetiske dele via ekspression af et reporterprotein ved CFPS. Velkarakteriserede genetiske dele er afgørende for udformningen af forudsigelige genetiske kredsløb med nyttig funktion. Denne metode øger gennemstrømningen og reducerer den tid, der er nødvendig for at screene nye genetiske dele ved at fjerne kravet om at arbejde i levende celler, samtidig med at funktionaliteten, der afspejler det cellulære miljø ved at bevare den metaboliske proces med proteinekspression i cellelysatet, bevares. Vores protokol kan udføres på 1 dag efter modtagelse af primere (~ 2,5-6 timer til reaktionsforberedelse, 2-16 timer til CFPS-reaktion; Figur 1) sammenlignet med mindst 3 dage for traditionel kloning (1 dag hver for konstruktionssamling og transformation, sekvensverifikation af kloner og dyrkning af celler til vurdering). Vi vurderer endvidere, at omkostningerne pr. konstruktion ved hjælp af lineært DNA er omtrent en tredjedel af den traditionelle kloning ($ 78 vs. $ 237; Supplerende tabel 1) metoder. Kommercielle syntesetjenester citerer i øjeblikket mindst 4 arbejdsdage afhængigt af størrelse, selvom de ville have lignende omkostninger som vores metode, hvis lineære fragmenter screenes direkte i CFPS ($ 78 vs. $ 91); Vi har ikke verificeret denne tilgang. Omkostningerne ved at evaluere en del med CFPS er små sammenlignet med genereringen af skabelon-DNA'et ($ 0,05 / reaktion22 vs. $ 78 pr. Skabelon), selvom det skal bemærkes, at opstartsomkostningerne for bulkreagenser og lysisudstyr er mindst flere tusinde dollars. Brugen af en akustisk væskebehandler forbedrer kun omkostningerne marginalt ved at muliggøre mindre volumener ned til 0,5 μL40; Den mere signifikante fordel er reduktionen af tid til at forberede reaktioner (~ 10 min vs. op til 1 time, afhængigt af antallet af reaktioner), især når man forbereder et stort antal reaktioner, giver anledning til bekymring for forberedt reaktion, der sidder i længere tid før inkubation.
Selvom CFPS-prototyper er hurtige og omkostningseffektive, er der stadig uvisse, når CFPS-prototyper forudsiger in vivo-funktionen tilstrækkeligt. For eksempel vil krydsreaktivitet med genomisk DNA ikke blive detekteret på grund af fjernelse af værtsgenomet under produktionen af CFPS-systemet. Komponentkoncentrationer kan også være 1-2 størrelsesordener lavere i CFPS end i celle51, hvilket sandsynligvis vil påvirke opførelsen af nogle dele som følge af forskellige makromolekylære trængselsforhold. Endvidere kan lineært DNA's evne til at forudsige in vivo-funktion være begrænset, for eksempel når DNA's sekundære struktur spiller en vigtig rolle. En sidste begrænsning er, at konstruktioner ikke sekvensverificeres før test for funktioner. Der kan være tilfælde, hvor den karakteriserede del faktisk ikke er tilpasset den tilsigtede teoretiske rækkefølge. Alle disse begrænsninger kan afhjælpes ved at validere en delmængde af de dele, der screenes ved denne metode i den tilsigtede in vivo-applikation .
Vi udviklede oprindeligt denne metode til at undersøge virkningerne af at ændre operatørpositionen på hybrid T7-tetO-promotorer 32. Vi har præsenteret protokollerne her i et mere generisk format, så de kan anvendes på promotorer, operatører, ribosombindingssekvenser, isolatorer og terminatorer. Disse genetiske dele kan tilføjes til 5'- eller 3'-enden af reportergenet ved PCR ved hjælp af primere til hvert design, hvilket eliminerer behovet for syntese eller kloning af hver variant for at teste. De resulterende PCR-produkter tjener som skabelon-DNA til evaluering via ekspression af et reporterprotein. I vores arbejde blev affinitetsrensningsprotokollen, der er angivet her, brugt til TetR og GamS. Den samme procedure kan anvendes til ekspression og oprensning af andre repressorer, aktivatorer, polymeraser, sigmafaktorer og andre proteiner, der er beslægtede med en genetisk del af interesse, selvom modifikationer kan være nødvendige for det ønskede protein, der udtrykkes. Oprensning og titrering af disse proteiner i CFPS-reaktioner muliggør en mere detaljeret karakterisering af en bestemt genetisk del. Endelig findes der talrige alternative CFPS-protokoller, som hver især bør kunne anvendes til delscreeningsdelen af metodologien. Som et eksempel inkluderer vi ikke et dialysetrin i denne protokol, som andre har fundet vigtigt for ekspression fra indfødte bakteriepromotorer22. Det er også muligt at variere koncentrationerne af de underliggende bestanddele af den fælles fiskeripolitik. Brugen af væskehåndtering forbedrer evnen til at teste de utallige forhold ved at øge gennemstrømningen og reducere de krævede materialer34,35.
Et område, der kan kræve betydelig fejlfinding, er optimering af den akustiske væskehåndterer. Dispensering af akustisk væskehåndterer bør optimeres for hver komponent, der overføres, og det anbefales kraftigt at køre kontroller for at verificere korrekt fordeling og reproducerbarhed, før der indsamles data. Den ideelle kildepladetype og væskeklasseindstilling afhænger af den specifikke væske, der skal dispenseres, og dens komponenter. Det anbefales ikke at bruge aminbelagte plader til at dispensere DNA, da aminbelægningen kan interagere med DNA'et. Det skal også bemærkes, at evnen til at dispensere højere koncentrationer af visse komponenter kan afhænge af den akustiske væskehåndteringsmodel. En testvæskeoverførsel kan udføres ved dispensering på en foliepladeforsegling for at visualisere vellykket dråbedannelse; Denne test giver dog begrænsede oplysninger, og slipværktøjer fra forskellige indstillinger kan se identiske ud. Brugen af et vandopløseligt farvestof, såsom tartrazin, kan bruges til mere nøjagtigt at kontrollere, at det korrekte volumen dispenseres med en given indstilling eller arbejdsgang (se Repræsentative resultater). Optimal programmering af likvide overførsler kan også påvirke nøjagtigheden og konsistensen af de genererede data; for overførsler >1 μL fra en kildebrønd til en destinationsbrønd har vi konstateret, at sekventielle overførsler på ≤1 μL bør programmeres til at reducere systematisk brønd-til-brønd-variabilitet (figur 4). Endelig kan teoretiske og faktiske kildebrønddøde volumener variere dramatisk afhængigt af kildepladetypen, væskeklasseindstillingen og komponenterne i den specifikke væske; Brug af Acoustic Liquid Handler Survey-funktionen til at vurdere brøndvolumenerne, før du kører et program, kan hjælpe med at måle, hvor nøjagtigt instrumentet er i stand til at måle en bestemt væske.
CFPS-reaktionsydelsen kan variere, når resultater sammenlignes mellem forskellige brugere, materialebatcher, pladelæsere og laboratorier41. I tilfælde, hvor sådanne sammenligninger er nødvendige under prototyper af genetiske kredsløb, anbefaler vi at inkludere interne kontrolreaktioner med standardkonstitutive promotorer i hver reaktionsplade for at hjælpe med at normalisere resultaterne på tværs af eksperimentelle opsætninger. Metoden til DNA-forberedelse kan også bidrage væsentligt til CFPS-aktivitet; Det anbefales at medtage et ethanoludfældningstrin. Derudover kan den optimale reaktionssammensætning variere med batchen af ekstrakt34. Især optimale magnesiumglutamat- og kaliumglutamatkoncentrationer har vist sig at variere efter batch42 eller med det anvendte promotor- eller reporterprotein24. Koncentrationerne af disse komponenter bør optimeres ved screening på tværs af flere koncentrationer af hver komponent pr. genetisk konstruktion og pr. celleekstraktpræparat for at bestemme de optimale betingelser for proteinekspression. Endelig omfatter bedste praksis for ensartet CFPS-reaktionsydelse grundig blanding, omhyggelig pipettering og konsistens i fremstillingen af hver reagenskomponent.
Ud over karakterisering af individuelle dele kan den samme metode bruges til at screene kombinationer af dele, der danner komplekse kredsløb, såsom logiske kredsløb16 eller oscillatorer52,53. Denne metode kan også anvendes til screening og optimering af biosensorer til applikationer inden for epidemiologisk diagnostik 54,55,56,57 eller faredetektion og kvantificering 3,58,59. Anvendelsen af AI-drevne teknikker såsom aktiv læring34 kan også parres med denne metodes høje kapacitet til at drive hurtig udforskning af komplekse biologiske designrum. I sidste ende forestiller vi os, at denne tilgang understøtter accelererede udviklingstider for nye genetiske designs inden for syntetisk biologi.

En kerneindsats inden for syntetisk biologi er at udvikle genetiske værktøjssæt, der indeholder velkarakteriserede dele, som kan bruges til at konstruere genetiske kredsløb1, der udfører nyttige funktioner, når de indsættes i mikrober eller cellefrie lysater. Områder, hvor sådanne genetiske kredsløb har fået trækkraft, registrerer 2,3,4, menneskelig ydeevne 5,6, biobrændstoffer7,8, materialeproduktion 9,10 og cellulær computing 11. Registre over standardiserede genetiske dele er blevet oprettet12 for at katalogisere nye og eksisterende dele i kategorier som promotorer, operatører, kodende sekvenser og terminatorer, for blot at nævne nogle få. Bestræbelser som iGEM (international Genetic Engineered Machines) konkurrence13 har været medvirkende til at karakterisere og katalogisere disse genetiske dele. Mange metoder er blevet udviklet for at lette hurtig samling af disse dele i nyttige genetiske kredsløb14,15. Software er endda udviklet til at automatisere sammensætningen af velkarakteriserede dele til kredsløb, der opnår en ønsket funktion16. Samlingen af nyttige genetiske kredsløb med forudsigelige funktioner hviler imidlertid på formodningen om, at de genetiske værktøjssæt indeholder velkarakteriserede genetiske dele. På grund af nødvendigheden af disse værktøjssæt mod fremskridt inden for syntetisk biologi er adskillige bestræbelser på bedre at katalogisere kredsløb og dele med passende karakteriseringsdata blevet beskrevet 17,18,19,20,21.
En tilgang til karakterisering af genetiske komponenter gør brug af cellefri proteinsyntese (CFPS) systemer, som rekonstituerer cellulære funktioner såsom transkription og translation ex vivo22. Flere undersøgelser har vist CFPS' potentiale til prototypning af genetiske komponenter 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32, hvad enten det er til direkte anvendelse i cellefrie systemer eller til at forudsige funktionen af genetiske konstruktioner i celler, såsom den relative aktivitet af dele i et bibliotek 29 , optimering af metabolisk vej27 og cellulær byrde30. Fordele ved prototyping i CFPS versus celler fremhævet af disse undersøgelser inkluderer at undgå tidskrævende kloning, præcis kontrol over koncentrationen af DNA og andre reaktionskomponenter og evnen til let at blande og matche flere DNA-konstruktioner. Fordelen ved at undgå kloning er især tydelig ved brug af lineære DNA-skabeloner, som gør det muligt at samle nye konstruktioner ved in vitro-metoder, der tager timer i stedet for dage33. Evnen til at manipulere koncentrationen af DNA-konstruktioner og andre komponenter blot ved pipettering gør tilgangen endnu mere attraktiv ved at muliggøre eksperimenter med høj kapacitet drevet af væskehåndteringsrobotter34,35. Mens succeser med at bruge CFPS til prototyping er blevet rapporteret, er det vigtigt at bemærke, at det stadig er at se, under hvilke sammenhænge CFPS-resultater pålideligt kan forudsige funktionalitet i celler.
Her præsenterer vi en metode til CFPS-prototyping, der understreger fordelene i hastighed, gennemstrømning og omkostninger sammenlignet med traditionelle cellebaserede tilgange. Tilgangen stammer fra vores tidligere arbejde, hvor vi brugte CFPS til hurtigt at karakterisere et bibliotek af T7-promotorvarianter reguleret af transkriptionsfaktoren TetR32, hvilket signifikant udvidede den lille håndfuld regulerede T7-promotorvarianter, der var tilgængelige i litteraturen på det tidspunkt36,37. Andre har siden da udvidet udvalget af sådanne initiativtagere yderligere38. I vores metode accelereres genetisk konstruktion ved at bruge PCR til at amplificere skabelon-DNA via primere, der tilføjer variantgenetiske dele til et reportergen. Akustisk væskehåndtering i plader med 384 brønde bruges til at øge gennemstrømningen og reducere mængden af nødvendige materialer. Tidligere arbejde har vist vellykket brug af akustisk væskehåndtering ved betydeligt lavere volumener39,40 med variabilitet, der kan sammenlignes med manuel pipettering af større volumener 41. Ud over metoden leverer vi fejlfindingsoplysninger og en vurdering af potentielle omkostnings- og tidsbesparelser. Bemærk, at selvom vi inkluderer en protokol til fremstilling af cellefrie lysater baseret på Sun et al.42 her, bør mange andre kommercielle sæt og protokoller43,44 også fungere. Tilsvarende, mens vi demonstrerer metoden til karakterisering af promotorvarianter32, kan andre dele udskiftes ved PCR-amplifikation, såsom riboregulatorer, ribosombindingssteder (RBS'er), isolatorer, proteinmærker og terminatorer. Vi håber, at denne metode kan hjælpe det syntetiske biologisamfund med at fortsætte med at vokse antallet af karakteriserede dele til samling af forudsigelige genetiske kredsløb med nyttig funktion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x YT medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2377-250G</td>
			<td>Alternative to making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td>For plating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (5 cm diameter)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>731-1550</td>
			<td>Used for protein purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destination plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc plate</td>
			<td>142761</td>
			<td>For CFPS reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L</td>
			<td>For digestion of plasmid templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>20871723</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) Rosetta2</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70954</td>
			<td>Cell line used for production of lysate and purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>525</td>
			<td>Acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell</td>
			<td>Thermo Spectronic</td>
			<td>FA-078</td>
			<td>For lysing cells for CFPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impermeable plastic sealable lid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>232702</td>
			<td>Plate seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>RPI</td>
			<td>I56000-25.0</td>
			<td>Used for protein induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g1501-500G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo source plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>PL-05525</td>
			<td>For use with Echo acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td>For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>For production of purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR H2O</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>H10</td>
			<td>Plate reader used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494S</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28606</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSonica Ultrasonic Processor</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q700</td>
			<td>Cell disruption during protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>Updated supplier from Sun et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T7293</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid characterization of genetic parts with cell-free systems

Karakterisering og katalogisering af genetiske dele er afgørende for design af nyttige genetiske kredsløb. At have velkarakteriserede dele giver mulighed for finjustering af genetiske kredsløb, således at deres funktion resulterer i forudsigelige resultater. Med væksten af syntetisk biologi som felt har der været en eksplosion af genetiske kredsløb, der er blevet implementeret i mikrober for at udføre funktioner vedrørende sensing, metabolisk ændring og cellulær computing. Her viser vi en hurtig og omkostningseffektiv metode til karakterisering af genetiske dele. Vores metode anvender cellefrit lysat, der fremstilles internt som et medium til at evaluere dele via ekspression af et reporterprotein. Skabelon-DNA fremstilles ved PCR-amplifikation ved hjælp af billige primere for at tilføje variantdele til reportergenet, og skabelonen føjes til reaktionen som lineært DNA uden kloning. Dele, der kan tilføjes på denne måde, inkluderer promotorer, operatører, ribosombindingssteder, isolatorer og terminatorer. Denne tilgang kombineret med inkorporeringen af en akustisk væskehåndtering og 384-brøndplader giver brugeren mulighed for at udføre high-throughput evalueringer af genetiske dele på en enkelt dag. Til sammenligning kræver cellebaserede screeningsmetoder tidskrævende kloning og har længere testtider på grund af normaliseringstrin for kultur natten over og kulturtæthed. Endvidere giver arbejde i cellefri lysat brugeren mulighed for at opnå strammere kontrol over ekspressionsbetingelserne gennem tilsætning af eksogene komponenter og DNA ved præcise koncentrationer. Resultater opnået ved cellefri screening kan bruges direkte i applikationer af cellefrie systemer eller i nogle tilfælde som en måde at forudsige funktion i hele celler.

For at demonstrere nytten af vores metoder præsenterer vi resultater, der beskriver virkningerne af tetO-sekvensens nærhed til T7-promotoren på reguleringen af T7 RNAP-drevet ekspression. De fulde resultater og deres implikationer kan findes i McManus et al.32's arbejde. Arbejdsprocessen er beskrevet i figur 1. Femten lineære skabeloner, der kun varierede i afstanden fra T7-promotoren i forhold til tetO-sekvensen, blev udarbejdet ved PCR-forstærkning af sfGFP-reporteren med primere designet til at tilføje hver promotorvariant (figur 2) som beskrevet i afsnit 2 i protokollen. CFPS-reaktionskomponenter og reaktioner blev fremstillet i overensstemmelse med protokollen. Ekspressionen af sfGFP blev målt fra hver skabelon med en titrering af 12 forskellige koncentrationer af TetR-proteinet i tre eksemplarer ved hjælp af en akustisk væskehåndterer. Ved 36 CFPS-reaktioner pr. skabelon og 15 skabeloner blev der udført i alt 540 reaktioner for hele sættet af T7-tetO-kombinationer. Hele evalueringen blev udført på to plader i to pladelæsere. Analyse af disse data viste, at T7 RNAP nedregulerer T7-drevet ekspression ligeligt op gennem 13 bp nedstrøms fra starten af T7-transkriptet (figur 3). Dette resultat har konsekvenser for det fremtidige design af regulerbare T7-drevne genkredsløb ved at beskrive et formodet vindue for en effektiv undertrykkelse af T7 af andre repressorer. Sammenligning af resultater fra protokollen beskrevet her med DNA fremstillet ved traditionel kloning afslørede en lille, men statistisk signifikant forskel i graden af TetR-undertrykkelse mellem formater. Vi antog, at ikke-specifik binding af TetR til vektor-DNA'et kunne forklare den observerede forskel. Eksperimentelle resultater viste, at tilsætning af lineært vektor-DNA til reaktioner med lineært skabelon-DNA reducerede forskellen til ikke-statistisk signifikans, selvom det ikke udelukkede bidrag fra andre faktorer, såsom forskelle i periodicitet af DNA-helixen for lineære vs. cirkulære formater, hvilket igen kunne påvirke TetR-binding. Afhængigt af applikationen kan brugen af lineær skabelon kræve yderligere validering.
Vi inkluderer yderligere repræsentative data om potentielle problemer med nøjagtig dispensering ved hjælp af akustisk væskehåndtering (figur 4). En opløsning af 1x phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,4 indeholdende 0,25 mM tartrazinfarvestof blev anvendt til at evaluere to metoder til programmering af en akustisk væskehåndterer til dispensering af volumener >1 μL. Efter væskedispensering blev målpladen forseglet og centrifugeret ved 1.500 x g i 1 min., og absorbansen ved 425 nm målt med en pladelæser. Repræsentative resultater af ni eksperimenter vises og demonstrerer mere ensartet dispensering på tværs af serien af otte destinationsbrønde, når 5 μL-overførslen er opdelt i separate 1 μL-dispensere. På baggrund af disse observationer anbefales det, at overførsler >1 μL opdeles i flere overførsler på ≤1 μL. Se afsnittet Diskussion for at få flere oplysninger om fejlfinding af dette vigtige aspekt af protokollen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig01.jpg"> Figur 1: En-dags arbejdsgang til evaluering af promotordele i cellefrit ekstrakt. (A) En reporter PCR-amplificeres ved hjælp af primere, der indeholder genetiske dele, der skal evalueres (2-5 timer). (B) Den cellefrie reaktionsblanding fremstilles som beskrevet i protokollen og fordeles i en 384-brøndplade med de PCR-amplificerede skabeloner (30 min). (C) Akustisk væskehåndtering bruges til at distribuere yderligere komponenter, som kan omfatte repressorproteiner, effektormolekyler og andre betingede effektorer (10 min). (D) Reporterproteinekspression fra hver reaktion måles i en pladelæser (2-16 timer, afhængigt af CFPS-opskriften og konstruktionen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig02.jpg"> Figur 2: Primerdesign til tilføjelse af genetiske dele til et reportergen ved PCR-amplifikation . (A) SFGFP-reportergenet (grønt) vil blive forstærket for at tilføje en RBS (rød) og en T7-promotor (blå) ved PCR. (B) sfGFP (grøn) og en RBS (rød) vil blive forstærket for at tilføje en tetO-sekvens (guld) og en T7-promotor (blå) ved PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig03.jpg"> Figur 3: Effekten af tetO-position på reguleringen af et T7-drevet udtryk. Normaliserede maksimale undertrykkelsesværdier for lineær og cirkulær skabelon som funktion af tetO-position . Sporinger repræsenterer middel- og standardafvigelserne for tre replikater. Denne figur er blevet ændret fra McManus et al.32 under en Creative Commons CC-BY licens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig04.jpg"> Figur 4: Brug af tartrazinfarvestof til at validere væskedispensering med en akustisk væskehåndterer. Sorte bjælker angiver, at der dispenseres 5 μL tartrazinopløsning fra en enkelt kilde et godt stykke ind i hver af de otte på hinanden følgende destinationsbrønde i en 384-brøndplade ved hjælp af en enkelt programmeringskommando. Grå søjler angiver, at 1 μL fra en enkelt kildebrønd dispenseres fra en enkelt kildebrønd til hver af otte på hinanden følgende destinationsbrønde ved hjælp af en enkelt programmeringskommando og derefter gentages dette trin fire gange for i alt 5 μL dispenseret i hver destinationsbrønd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Komponentnavn</td>
			<td>Volumen for 1 reaktion (μL)</td>
			<td>Volumen for 110% af X antal reaktioner (μL)</td>
		</tr><tr><td>Q5 PCR-forblanding</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vand</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Skabelon (1–3 ng/μL)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(hvis fast1) Fremadgående primer (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(hvis fast1) Omvendt primer (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Master Mix i alt:</td>
			<td>30 eller 40</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(hvis variabel1) Fremadgående primer (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(hvis variabel1) Omvendt primer (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Arbejdsark til fremstilling af reagenser til PCR-reaktioner. Værdier i kolonnen yderst til højre kan udfyldes af brugerne afhængigt af det tilsigtede antal reaktioner. 1 Variable primere indeholder en bestemt del, der skal tilsættes i PCR-reaktionen, og kan være den fremadgående primer, omvendte primer eller begge dele. Faste primere tilføjer ikke en del og kan være den forreste primer eller omvendte primer, men ikke begge dele.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Komponentnavn</td>
			<td>Volumen for 1 reaktion (μL)</td>
			<td>Volumen for 110% af X antal reaktioner (μL)</td>
		</tr><tr><td>Udtræk af celler</td>
			<td>4.2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Supplement Mix</td>
			<td>3.3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GamS-protein (207 μM)</td>
			<td>0.15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Skabelon DNA (20 nM)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>T7 polymerase (13 mg/ml)</td>
			<td>0.12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vand</td>
			<td>0,73 (dette tal kan variere)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Master Mix i alt:</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Repressor Protein:</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Arbejdsark til fremstilling af reagenser til CFPS-reaktioner. Værdier i kolonnen yderst til højre kan udfyldes af brugerne afhængigt af det tilsigtede antal reaktioner.
Supplerende tabel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/Table%20S1%20-%20cost%20estimates_REV%20EDITS.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Velkarakteriserede genetiske dele er nødvendige for design af nye genetiske kredsløb. Her beskriver vi en omkostningseffektiv, high-throughput metode til hurtig karakterisering af genetiske dele. Vores metode reducerer omkostninger og tid ved at kombinere cellefrie lysater, lineært DNA for at undgå kloning og akustisk væskehåndtering for at øge gennemstrømningen og reducere reaktionsvolumenerne.

Hurtig karakterisering af genetiske dele med cellefrie systemer

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

Vores metode muliggør hurtig karakterisering af genetiske dele ved hjælp af cellefrie ekspressionssystemer og PCR i stedet for kloning. Den største fordel ved denne teknik er, hvad der typisk tager dage til uger i celler, der kan gøres i timer til dage ved hjælp af denne metode. Vores protokol indeholder trin til at lave dine egne cellefrie udtrykssystemer, hvilket kan være vanskeligt flere steder og kan kræve justeringer afhængigt af brugssagen.Når du først starter, anbefaler vi at starte med kommercielle sæt. Begynd med at forberede PCR-masterblandingen i henhold til instruktionerne i manuskriptet og opbevar den på is. Alikvote 30 eller 40 mikroliter af masterblandingen i det bestemte antal PCR-rør og tilsæt 10 mikroliter af hver fem mikromolære variable primere til passende mærkede PCR-rør.Placer PCR-rørene i termocyklisten, og kør PCR-programmet som nævnt i tekstmanuskriptet. Hold derefter reaktionerne ved fire grader Celsius. Hvis den originale skabelon er plasma-DNA, tilsættes en mikroliter DpnI-restriktionsenzym for at fordøje den originale skabelon og inkubere reaktionerne ved 37 grader Celsius i en time.Analyser fem mikroliter af hvert PCR-produkt ved at adskille dem ved hjælp af en 1% agarosegel ved 180 volt i 20 minutter. Kontroller for den korrekte båndstørrelse, som varierer med den valgte kernesekvens og længden af de tilføjede dele. Rens de lineære skabeloner ved hjælp af et kommercielt PCR-rensningssæt.Hvis flere bånd var til stede ved gelelektroforese, skal du fjerne båndene af interesse fra gelen og rense DNA'et ved hjælp af et kommercielt gelekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger. Kvantificer hver DNA-skabelon ved hjælp af et spektrofotometer, vurder dens kvalitet ved at kontrollere, at forholdet 260 til 280 nanometer er ca. 1,8. Optø alle komponenterne på is og forbered en masterblanding ved at blande alle komponenterne grundigt med en pipette, som nævnt i manuskriptet.Vær opmærksom på at undgå nedbør, især for aminosyreblandingen. Hold masterblandingen på is. Afkøl en 384-brøndplade på is og fordel masterblandingen i ni mikroliter alikvoter i hver brønd.Optø represserproteinet på is, og fordel det i en akustisk væskehåndteringskildeplade, idet det sikres, at den passende mængde dødvolumen, der kræves til den anvendte type kildeplade, er inkluderet. Represserproteinet fordeles i volumener på en mikroliter i de relevante destinationsbrønde via væskehåndtereren. Inkluder en seriel fortynding af den rensede reporter eller en passende kemisk standard på pladen for at sammenligne resultaterne med andre undersøgelser og andre laboratorier.Vælg et koncentrationsinterval, der passer til den indberetter, der anvendes i eksperimenternes forventede ekspressionsområde. Forvarm pladelæseren til 30 grader Celsius. Hvis det er muligt, skal du indstille en lodret temperaturgradient på en grad Celsius for at begrænse kondens på tætningen.Indstil pladelæseren til at læse ved indstillinger, der passer til den reporter, der bruges i kernesekvensen, uden at ryste trin. Forsegl pladen med 384 brønde med en uigennemtrængelig plastforsegling for at forhindre fordampning. Placer pladen med 384 brønde på pladeholderen, og begynd at læse.15 lineære skabeloner, der kun varierede i afstanden fra T7-promotoren i forhold til tetO-sekvensen, blev udarbejdet ved PCR, der forstærkede den supermappegrønne fluorescerende proteinreporter med primere designet til at tilføje hver promotorvariant. Analyse af data fra i alt 540 reaktioner for hele sættet af T7 tetO-kombinationer viste, at T7 RNA-polymerasen nedregulerer T7-drevet ekspression ligeligt op gennem 13 basepar nedstrøms fra starten af T7-transkriptet. Mere konsekvent dispensering på tværs af serien af otte destinationsbrønde ved hjælp af den akustiske væskehåndterer blev observeret, da en overførsel på fem mikroliter blev opdelt i separate dispensere på en mikroliter.Vores protokol kan bruges til hurtigt at screene genetiske komponenter, hvad enten det er til screening af nye biosensorer eller opbygning af genetiske delebiblioteker.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Høj effektivitet, Site-specifik Transfektion af adhærente celler med siRNA Brug mikroelektrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering af komplekse systemer ved hjælp af udformning af eksperimenter Fremgangsmåde: Transient Protein Expression i tobak som et casestudie

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Forsegles Femtoliter Chamber Arrays for celle-fri Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Hurtig Subtraktiv mønster af levende cellelag med et Mikrofluid Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese af smitsomme Bakteriofager i en E. coli -baseret celle-gratis Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Mikrofluidic-platform med flere lag til overledning af forlænget celle frit genekspression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

OnePot PURE Cell-Free System

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Hurtige, enzymatiske metoder til forstærkning af minimale, lineære skabeloner til proteinprototyping ved hjælp af cellefrie systemer

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...