Name: rapid characterization of genetic parts with cell-free systems
Uploaded: 2021-08-30T14:00:00
Duration: 5 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Dit werk werd mogelijk gemaakt door het Programma Toegepast Onderzoek voor de Bevordering van wetenschap en technologieprioriteiten van het kantoor van de minister van Defensie. We bedanken Scott Walper (Naval Research Laboratory) voor het leveren van de voorraad gebruikte sfGFP, en Zachary Sun en Abel Chiao (Tierra Biosciences) voor vruchtbare discussies met betrekking tot prototyping met celvrije systemen en gerelateerde probleemoplossing van akoestische vloeistofverwerking.

1. Bereiding van celextract
<ol><li>Voorbereiding van media<ol><li>Voor 2xYT-media: voeg 16 g trypton, 10 g gistextract en 5 g NaCl toe aan 900 ml gedeïoniseerd water en pas de pH aan op 7,0 met 5 M NaOH. Verhoog het oplossingsvolume tot 1 L met gedeïoniseerd water en autoclaaf of filtersterilisatie. U kunt ook 2xYT-media aanschaffen.</li>
		<li>Voor S30B-buffer: Bereid een oplossing van 14 mM Mg-glutamaat, 60 mM K-glutamaat en 5 mM Tris in 2 L gedeïoniseerd water. Gebruik 2 M Tris om de pH aan te passen op 8,2, autoclaaf, en bewaar bij 4 °C. Voltooi de oplossing door dithiothreitol (DTT) toe te voegen aan een eindconcentratie van 1 mM vlak voor gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van cellen<ol><li>Streak Escherichia coli BL21(DE3) Rosetta2-cellen of andere cellijn naar keuze (zie Cole et al.44 voor een recent uitgebreid overzicht) op een LB (Lysogeny Broth) agarplaat en incubeer bij 37 °C gedurende 10-14 uur.</li>
		<li>Gebruik een enkele E. coli kolonie om 3 ml 2xYT medium in een kweekbuis van 10 ml te enten. Incubeer deze buis bij 37 °C met schudden bij 250 tpm gedurende 8 uur.</li>
		<li>Gebruik 50 μL uit de 3 ml cultuur om 50 ml 2xYT medium in een kolf van 500 ml te enten. Incubeer deze kolf bij 37 °C met schudden bij 250 tpm gedurende 8 uur.</li>
		<li>Gebruik 7,5 ml uit de 50 ml cultuur om elk van de vier 4 L verbijsterde kolven met 0,75 l 2xYT medium te enten. Incubeer deze kolven bij 37 °C met schudden bij 220 tpm totdat ze na ongeveer 3-4 uur een optische dichtheid hebben bereikt bij 600 nm van 2 tot 4.</li>
		<li>Oogst de cellen uit elke kolf door ze over te brengen naar 1 L-containers en te centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door het in een afvalcontainer te decanteren.</li>
		<li>Was elke celpellet met 150 ml ijskoude S30B-buffer door ze volledig te resuspenderen met een pipet om de celmassa te verstoren en verzamel de cellen vervolgens opnieuw door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 12 minuten. Gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Was elke celpellet opnieuw in 40 ml ijskoude S30B-buffer door ze volledig te resuspenderen en de celmassa te verstoren met een pipet. Breng de cellen over in vooraf gewogen conische buisjes van 50 ml en verzamel de cellen opnieuw door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door te decanteren.</li>
		<li>Weeg de natte celkorrels. Bevries de celpellets door de buizen direct in vloeibare stikstof te plaatsen en op te slaan bij -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellyse<ol><li>Ontdooi de celkorrels op ijs.</li>
		<li>Resuspensie van elke celpellet in 1,4 ml S30B-buffer per 1 g van de celpellet door vortexing.</li>
		<li>Lyse de cellen door Franse drukcel op 640 psi bij 4 °C. Verzamel het lysaat in microcentrifugebuizen op ijs en voeg onmiddellijk na lyse lyse 3 μL 1 M DTT per 1 ml lysaat toe. OPMERKING: Het is het beste om met een kleine metalen staaf op de Franse persklep te tikken om de gelijkmatige druk te handhaven en plotselinge drukdalingen te voorkomen.</li>
		<li>Verwijder het lysaat door centrifugatie bij 30.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C en gooi de pellet weg nadat u het supernatant naar een nieuwe ijskoude microcentrifugebuis hebt gepipetteerd, waarbij u ervoor moet zorgen dat de pellet niet wordt verstoord.</li>
		<li>Centrifugeer het supernatant een tweede keer bij 30.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Pipetteer het resulterende supernatant in een ijskoude microcentrifugebuis. Gooi de pellet weg.</li>
		<li>Incubeer het supernatant in een waterbad van 37 °C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant door centrifugatie bij 15.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en breng het resulterende supernatant over in een ijskoude microcentrifugebuis, waarbij u ervoor zorgt dat de pellet niet wordt verstoord.</li>
		<li>Centrifugeer het supernatant een tweede keer bij 15.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en breng het resulterende supernatant over naar een ijskoude microcentrifugebuis, waarbij u ervoor zorgt dat de resterende pellet niet wordt verstoord.</li>
		<li>Verdeel het supernatant in aliquots van 100 μL in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en bevries ze door ze rechtstreeks in vloeibare stikstof te plaatsen. Bewaar het supernatant bij -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lineaire sjabloonvoorbereiding
<ol><li>Primer ontwerp<ol><li>Kies een kernreeks als pcr-sjabloon. Neem minimaal een reportersequentie op, zoals sfGFP (superfolder Green Fluorescent Protein), LacZ of Spinazie aptamer. Neem andere onderdelen op die worden bevestigd in gescreende varianten, zoals terminators, promotors of RBS'en, afhankelijk van het ontwerp. OPMERKING: Opname van een terminator is niet altijd vereist voor expressie van lineair DNA in celvrije systemen.</li>
		<li>Kies voor de voorwaartse primers minimaal 20 bp die overeenkomt met het 5ʹ-einde van de kernreeks als het 3ʹ-uiteinde van de primer. Als u onderdelen toevoegt aan het 5′-uiteinde van de constructie, ontwerp dan de rest van het 5ʹ-uiteinde van de primer om de genetische delen van belang toe te voegen aan de kernsequentie via PCR-amplificatie (figuur 1A en figuur 2). OPMERKING: Aangezien primers boven ~ 60 bp vaak dramatisch in kosten stijgen, kunnen meerdere overlappende primers worden ontworpen om langere reeksen of meerdere delen toe te voegen. Hoewel meerdere primers kunnen worden gebruikt in een enkele PCR-reactie, wordt het uitvoeren van meerdere rondes PCR aanbevolen.</li>
		<li>Kies voor de omgekeerde primers minimaal 20 bp om overeen te komen met het 3′-einde van de kernreeks als het 3ʹ-uiteinde van de primer. Als u onderdelen toevoegt aan het 3′-uiteinde van de constructie, ontwerpt u de rest van het 5ʹ-uiteinde van de primer om de genetische delen van belang toe te voegen aan de kernsequentie via PCR-amplificatie (figuur 1A en figuur 2). Zorg ervoor dat de gloeitemperatuur van de omgekeerde primer binnen 5 °C van de gloeitemperatuur van de gehele voorwaartse primer ligt.</li>
	</ol></li>
	<li>Lineaire sjabloonversterking<ol><li>Bepaal het aantal uit te voeren PCR-reacties op basis van het aantal kernsequenties en bereken de hoeveelheid van elke vereiste component met behulp van tabel 1.</li>
		<li>Bereid de mastermix volgens tabel 1 en bewaar deze op ijs. Aliquot 30 of 40 μL (zie tabel 1) van de mastermix in het bepaalde aantal PCR-buizen en voeg 10 μL van elke variabele primer (d.w.z. primers die coderen voor een onderdeelverandering, zie tabel 1) bij 5 μM toe aan correct gelabelde PCR-buizen.</li>
		<li>Plaats de PCR-buizen in de thermocycler en voer het volgende PCR-programma uit: 98 °C gedurende 3 minuten; 30 cycli van 98 °C gedurende 15 s, XX °C gedurende 20 s, 72 °C gedurende JJ min; laatste verlenging bij 72 °C gedurende 10 min. Houd vervolgens de reactie op 4 °C. Waarbij XX de gloeitemperatuur voor de primer met de lagere gloeitemperatuur vertegenwoordigt en YY de verlengingstijd die is berekend voor de lengte van de amplicon op basis van de aanbevelingen van de fabrikant voor het gebruikte high-fidelity polymerase. Optimaliseer deze voorwaarden indien nodig voor verschillende primers en/of sjablonen.</li>
		<li>(Optioneel) Voeg 1 μL DpnI-restrictie-enzym toe om de oorspronkelijke sjabloon te verteren. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 1 uur. Voer deze stap alleen uit als de oorspronkelijke sjabloon plasmide-DNA is.</li>
		<li>Analyseer 5 μL van elk PCR-product op gel-elektroforese. Scheid het product met een 1% agarose gel bij 180 V gedurende 20 minuten. Controleer op de juiste bandgrootte, die varieert met de gekozen kernvolgorde en de lengte van de toegevoegde onderdelen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zuiver de lineaire sjabloon met behulp van een commerciële PCR-zuiveringskit of met de voorkeurs-PCR-opruimmethode. Als er meerdere banden aanwezig waren door gel-elektroforese-analyse, optimaliseer dan de PCR-omstandigheden of zuiver de juiste moleculaire gewichtsbanden met behulp van een commerciële gelextractiekit volgens de aanbeveling van de fabrikant.</li>
	<li>Kwantificeer elk DNA-sjabloon met behulp van een spectrofotometer. Beoordeel de kwaliteit van het DNA-sjabloon door te controleren of de verhouding van 260 nm /280 nm ongeveer 1,8 is.</li>
	<li>(Optioneel) Scheid opnieuw een deel van het DNA-sjabloon met behulp van een 1% agarose-gel bij 180 V gedurende 20 minuten en zorg ervoor dat eventuele ongewenste banden tijdens sjabloonzuivering zijn verwijderd.</li>
	<li>Gebruik onmiddellijk gezuiverde DNA-sjablonen of bewaar bij -20 °C.</li>
</ol>3. Gezuiverde eiwitbereiding
<ol><li>Eiwitexpressie<ol><li>Stel voor elk tot expressie te brengen eiwit een geschikte expressieconstruct samen. Codon-optimaliseer het gen voor expressie in E. coli. Plaats het gen in een pET-22b-expressievector of een andere geschikte expressievector via de gewenste plasmideassemblagemethode. Transformeer de expressie plasmide in BL21(DE3) Rosetta2 expressiecellen of een andere geschikte cellijn.</li>
		<li>Gebruik voor elk eiwit een enkele kolonie om 3 ml LB-medium in een kweekbuis van 10 ml te enten. Incubeer deze buizen bij 37 °C met schudden bij 250 rpm 's nachts.</li>
		<li>Ent een kolf van 2 L met 750 ml LB-medium met 1 ml van de nachtcultuur. Incubeer deze kolven bij 37 °C met schudden bij 250 tpm totdat ze een OD600 van 0,6-1,0 bereiken.</li>
		<li>Eiwitexpressie induceren door 0,75 ml 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in water aan elke kolf toe te voegen en deze kolven verder te incuberen bij 37 °C met schudden bij 250 tpm gedurende 4 uur.</li>
		<li>Oogst de cellen uit elke kolf, met behulp van een centrifugefles van 1 L, door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 12 minuten. Gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Breng de pellets over in een conische buis van 50 ml en weeg elke pellet. Bevries de cellen in vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C of ga verder met stap 3.2. OPMERKING: 2-5 g cellen per 0,75 ml zullen naar verwachting het resultaat zijn van deze stap.</li>
	</ol></li>
	<li>Eiwitzuivering door nikkelaffiniteitskolomchromatografie<ol><li>Bereid de lysisbuffer voor door 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl en 5 mM imidazool te combineren. Stel in op pH 8,0.</li>
		<li>Bereid de wasbuffer voor door 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl en 25 mM imidazool te combineren. Stel in op pH 8,0.</li>
		<li>Bereid de elutiebuffer voor door 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl en 250 mM imidazool te combineren. Stel in op pH 8,0.</li>
		<li>Bereid de dialysebuffer voor door 50 mM NaHPO4, 100 mM NaCl en 2% DMSO te combineren. Stel in op pH 7,5.</li>
		<li>Ontdooi de celkorrels door de buisjes in water op kamertemperatuur te plaatsen. Voeg 5 ml van de lysisbuffer per 1 g van de celpellet toe en resuspensie door vortexing.</li>
		<li>Lyse de cellen door ultrasoonapparaat. Scheid het celhomogenaat zodat er niet meer dan 30 ml per 50 ml conische buis is en houd elke buis op ijs. Lyse de cellen met behulp van een sonicator met een sonde met een diameter van 0,16 cm in rondes van 15 s met 30 s pauzes, 10 keer. OPMERKING: Vermijd schuimvorming, omdat dit het eiwit denatureert. De vorming van schuim kan worden vermeden door de sonicatorpunt ten minste 2/3 ondergedompeld te houden in het lysaat terwijl het operationeel is. Andere methoden van cellyse naast ultrasoonapparaat zijn ook mogelijk44.</li>
		<li>Verwijder het lysaat door centrifugeren bij 15.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C en plaats het supernatant in een nieuwe conische buis van 50 ml.</li>
		<li>Voeg 1 ml nikkel-nitrilotriacetinezuur (Ni-NTA) hars toe voor elke 5 ml supernatant. Verdeel de cellysaat/Ni-NTA slurry zodanig dat er niet meer dan 36 ml per 50 ml conische buis is. Incubeer bij 4 °C op een buisrotator bij 10 tpm gedurende 1 uur.</li>
		<li>Laad de hars door de cellysaat / Ni-NTA-slurry in een 2 ml bedvolumechromatografiekolom te decanteren en verzamel de eluant indien nodig voor verdere analyse, anders weggooien. Was de hars met 10 harsbedvolumes wasbuffer.</li>
		<li>Verzamel het eiwit door drie harsbedvolumes elutiebuffer aan de kolom toe te voegen en concentreer het volume tot 1,5 ml met behulp van een centrifugale concentrator met het juiste moleculaire gewichtsafsnijdingsmembraan voor elk eiwit.</li>
		<li>Dialyseer het eiwit tegen 2 L dialysebuffer bij 4 °C gedurende 1 uur. Dialyseer het eiwit opnieuw tegen 2 L dialysebuffer 's nachts bij 4 °C.</li>
		<li>Kwantificeer het eiwit met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt en absorptie bij 280 nm. Analyseer het eiwit op zuiverheid door het te scheiden met behulp van natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE). Bewaar het eiwit bij -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Celvrije eiwitsynthese
<ol><li>Bereiding van het CFPS-reactiemengsel<ol><li>Bereid de supplementmix voor door de stappen aminozuuroplossingsvoorbereiding, energieoplossingsvoorbereiding en buffervoorbereiding in Sun et al.42 te volgen. Afzonderlijk of gecombineerd bewaren bij -80 °C in aliquots. Zorg ervoor dat de eindconcentraties overeenkomen met de concentraties beschreven in Sun et al.42 in de sectie Experimentele uitvoering van een TX-TL-reactie.</li>
		<li>Bereid een additief om lineair DNA te beschermen tegen afbraak. Als u GamS33,45 gebruikt, bereidt u zich dan voor via stappen in sectie 3 hierboven, of verkrijg van een commerciële leverancier; voor andere benaderingen, raadpleeg de overeenkomstige literatuur 46,47,48. U kunt ook een CFPS-systeem gebruiken waarvoor geen additieven nodig zijn49.</li>
		<li>Bereid T7-polymerase, repressoreiwitten en andere additieven met behulp van de stappen in sectie 3 hierboven of verkrijg bij een commerciële leverancier.</li>
		<li>Bepaal het aantal uit te voeren CFPS-reacties en bereken de hoeveelheid van elk component die nodig is met behulp van tabel 2. Wijzig de concentraties van de componenten, inclusief het toevoegen of verwijderen van componenten indien nodig, en pas de hoeveelheid water zodanig aan dat het uiteindelijke volume van elk reactiemengsel altijd 10 μL is. Wijzig op dezelfde manier de mastermix om het doseren van andere componenten door akoestische vloeistofverwerking naar wens te vergemakkelijken (zie de sectie Discussie ).</li>
		<li>Ontdooi alle componenten op ijs en bereid een hoofdmengsel door elke component te mengen zoals hierboven berekend. Meng alle componenten grondig door een pipet. Let goed op het vermijden van neerslag, vooral voor het aminozuurmengsel. Houd de mastermix op ijs.</li>
		<li>Koel een plaat met 384 putten op ijs en verdeel de mastermix in 9 μL aliquots in elke put. OPMERKING: Het is mogelijk om deze componenten te distribueren door akoestische vloeistofbehandeling, maar er moet voor worden gezorgd dat de juiste dosering wordt gegarandeerd (zie de sectie Discussie voor het oplossen van problemen).</li>
	</ol></li>
	<li>Distributie van extra componenten door akoestische vloeistofbehandeling<ol><li>Bereken de hoeveelheid repressoreiwit (en andere optionele componenten) die nodig is voor alle CFPS-reacties.</li>
		<li>Ontdooi het repressoreiwit op ijs en verdeel het in een akoestische vloeistofbehandelingsbronplaat of een andere geschikte plaat. Zorg ervoor dat de juiste hoeveelheid dead volume die nodig is voor het gebruikte type bronplaat is opgenomen.</li>
		<li>Verdeel het repressoreiwit in volumes van 1 μL in de juiste putjes via de vloeistofbehandelingskast. Zie de sectie Discussie voor meer informatie over het oplossen van problemen met distributies .</li>
	</ol></li>
	<li>Standaard curves<ol><li>Voeg een seriële verdunning van de gezuiverde verslaggever (zie rubriek 3 voor eiwitzuivering)41 of de juiste chemische norm50 op de plaat toe om vergelijking van de resultaten met andere onderzoeken en andere laboratoria mogelijk te maken. Kies een reeks concentraties die geschikt zijn voor de gebruikte verslaggever en het verwachte expressiebereik van de experimenten.</li>
	</ol></li>
	<li>CFPS-reacties uitvoeren<ol><li>Verwarm de plaatlezer voor tot 30 °C. Stel de plaatlezer in om te lezen op instellingen die geschikt zijn voor de verslaggever die in de kernreeks wordt gebruikt zonder stappen te schudden. OPMERKING: Hoewel hier 30 °C wordt gebruikt, worden 29 °C en 37 °C ook vaak gebruikt en werken ze goed met dit protocol. Andere temperaturen kunnen de voorkeur hebben voor alternatieve celvrije reactiepreparaten. Voor leesintervallen is 10 minuten voldoende om een goede resolutie te bereiken voor de hier gepresenteerde representatieve gegevens; andere resoluties kunnen echter beter zijn, afhankelijk van het rapporteiwit en het specifieke CFPS-recept.</li>
		<li>(Optioneel) Voer eerst een testreactie uit om de juiste versterkings- of gevoeligheidsinstelling in te stellen om de verandering in fluorescentie vast te leggen zonder signaaloverloop.</li>
		<li>Sluit de 384-well plaat af met een ondoordringbaar plastic afsluitbaar deksel om verdamping te voorkomen. Stel indien mogelijk op het instrument een verticale temperatuurgradiënt van 1 °C in om condensatie op de afdichting te beperken. Plaats de 384-well plaat op de plaathouder en begin met lezen.</li>
	</ol></li>
</ol>

RMM heeft een financieel belang in Tierra Biosciences, een particulier bedrijf dat gebruik maakt van celvrije technologieën zoals beschreven in dit artikel voor eiwitexpressie en screening.
De andere auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven protocollen bieden een kosteneffectief en snel middel om genetische delen te screenen via de expressie van een reporter-eiwit door CFPS. Goed gekarakteriseerde genetische delen zijn cruciaal voor het ontwerp van voorspelbare genetische circuits met een nuttige functie. Deze methodologie verhoogt de doorvoer en vermindert de tijd die nodig is om nieuwe genetische delen te screenen door de vereiste om in levende cellen te werken te verwijderen, met behoud van functionaliteit die de cellulaire omgeving weerspiegelt door het metabolische proces van eiwitexpressie in het cellysaat te behouden. Ons protocol kan worden uitgevoerd in 1 dag na ontvangst van primers (~ 2,5-6 uur voor reactievoorbereiding, 2-16 uur voor CFPS-reactie; Figuur 1), vergeleken met ten minste 3 dagen voor traditioneel klonen (elk 1 dag voor constructassemblage en -transformatie, sequentieverificatie van klonen en het kweken van cellen voor beoordeling). We schatten verder dat de kosten per construct met behulp van lineair DNA ongeveer een derde zijn van het traditionele klonen ($ 78 versus $ 237; Aanvullende tabel 1) Methoden. Commerciële synthesediensten citeren momenteel een minimum van 4 werkdagen, afhankelijk van de grootte, hoewel ze vergelijkbare kosten zouden hebben als onze methode als lineaire fragmenten rechtstreeks in CFPS worden gescreend ($ 78 versus $ 91); we hebben deze aanpak niet geverifieerd. De kosten om een onderdeel met CFPS te evalueren zijn klein in vergelijking met het genereren van het sjabloon-DNA ($ 0,05 / reactie22 versus $ 78 per sjabloon), hoewel moet worden opgemerkt dat de opstartkosten voor bulkreagentia en lysisapparatuur ten minste enkele duizenden dollars bedragen. Het gebruik van een akoestische vloeistofbehandelingskast verbetert slechts marginaal de kosten door kleinere volumes tot 0,5 μL40 mogelijk te maken; het belangrijkste voordeel is de vermindering van de tijd om reacties voor te bereiden (~ 10 min versus tot 1 uur, afhankelijk van het aantal reacties), vooral wanneer het voorbereiden van een groot aantal reacties bezorgdheid oproept over voorbereide reactiezitting gedurende langere tijd vóór incubatie.
Hoewel snel en kosteneffectief, moeten de beperkingen worden afgewacht wanneer CFPS prototyping de in vivo functie adequaat voorspelt. Een kruisreactiviteit met genomisch DNA wordt bijvoorbeeld niet gedetecteerd als gevolg van verwijdering van het gastheergenoom tijdens de productie van het CFPS-systeem. Ook kunnen componentconcentraties 1-2 ordes van grootte lager zijn in CFPS dan in cellen51, wat waarschijnlijk het gedrag van sommige delen beïnvloedt als gevolg van verschillende macromoleculaire drukteomstandigheden. Verder kan het vermogen van lineair DNA om de in vivo functie te voorspellen beperkt zijn, bijvoorbeeld wanneer de secundaire structuur van DNA een belangrijke rol speelt. Een laatste beperking is dat constructen niet worden geverifieerd voordat ze op functies worden getest. Er kunnen gevallen zijn waarin het gekarakteriseerde deel niet daadwerkelijk is afgestemd op de beoogde theoretische volgorde. Al deze beperkingen kunnen worden verzacht door een subset van de onderdelen die met deze methode worden gescreend te valideren in de beoogde in vivo toepassing.
We hebben deze methodologie oorspronkelijk ontwikkeld om de effecten van het veranderen van de positie van de operator op hybride T7-tetO-promotors 32 te onderzoeken. We hebben de protocollen hier in een meer generiek formaat gepresenteerd, zodat ze kunnen worden toegepast op promotors, operators, ribosoombindingssequenties, isolatoren en terminators. Deze genetische delen kunnen worden toegevoegd aan het 5ʹ of 3ʹ-uiteinde van het reportergen door PCR met behulp van primers voor elk ontwerp, waardoor synthese of klonen van elke variant om te testen wordt vermeden. De resulterende PCR-producten dienen als sjabloon-DNA voor evaluatie via de expressie van een reporter-eiwit. In ons werk werd het affiniteitszuiveringsprotocol dat hier werd verstrekt, gebruikt voor TetR en GamS. Dezelfde procedure kan worden gebruikt voor de expressie en zuivering van andere repressoren, activatoren, polymerasen, sigmafactoren en andere eiwitten die verwant zijn aan een genetisch deel van belang, hoewel modificaties nodig kunnen zijn om het gewenste eiwit tot expressie te brengen. Zuivering en titratie van deze eiwitten in CFPS-reacties maakt een meer gedetailleerde karakterisering van een bepaald genetisch deel mogelijk. Ten slotte bestaan er tal van alternatieve CFPS-protocollen en elk moet ontvankelijk zijn voor het deel van de screening van de methodologie. Als voorbeeld nemen we geen dialysestap op in dit protocol, waarvan anderen hebben vastgesteld dat het belangrijk is voor expressie van inheemse bacteriële promotors22. Het variëren van de concentraties van onderliggende samenstellende componenten van het CFPS is ook mogelijk. Het gebruik van vloeistofbehandeling verbetert het vermogen om de talloze omstandigheden te testen door de doorvoer te verhogen en de benodigde materialente verminderen 34,35.
Een gebied dat aanzienlijke probleemoplossing kan vereisen, is optimalisatie van de akoestische vloeistofhandler. De afgifte van akoestische vloeistofhandlers moet worden geoptimaliseerd voor elk onderdeel dat wordt overgedragen en het wordt ten zeerste aanbevolen om controles uit te voeren om de juiste distributie en reproduceerbaarheid te verifiëren voordat gegevens worden verzameld. Het ideale type bronplaat en de instelling van de vloeistofklasse zijn afhankelijk van de specifieke vloeistof die moet worden afgegeven en de componenten ervan. Het wordt niet aanbevolen om amine-gecoate platen te gebruiken om DNA af te geven, omdat de aminecoating kan interageren met het DNA. Er moet ook worden opgemerkt dat het vermogen om hogere concentraties van bepaalde componenten af te geven, afhankelijk kan zijn van het akoestische vloeistofbehandelingsmodel. Een testvloeistofoverdracht kan worden uitgevoerd door op een folieplaatafdichting te doseren om succesvolle druppelvorming te visualiseren; Deze test biedt echter beperkte informatie en druppels uit verschillende instellingen kunnen identiek lijken. Het gebruik van een in water oplosbare kleurstof, zoals tartrazine, kan worden gebruikt om nauwkeuriger te controleren of het juiste volume wordt achterwege gelaten met een bepaalde instelling of workflow (zie Representatieve resultaten). Optimale programmering van vloeistofoverdrachten kan ook de nauwkeurigheid en consistentie van de gegenereerde gegevens beïnvloeden; voor overdrachten >1 μL van één bronput naar één bestemmingsput, hebben we ontdekt dat sequentiële overdrachten van ≤1 μL moeten worden geprogrammeerd om de systematische well-to-well variabiliteit te verminderen (figuur 4). Ten slotte kunnen theoretische en werkelijke volumes van de bronputten dramatisch variëren, afhankelijk van het type bronplaat, de instelling van de vloeistofklasse en de componenten van de specifieke vloeistof; het gebruik van de akoestische vloeistofbehandelingstestfunctie om de putvolumes te beoordelen voordat een programma wordt uitgevoerd, kan helpen meten hoe nauwkeurig het instrument in staat is om een bepaalde vloeistof te meten.
CFPS-reactieprestaties kunnen variëren bij het vergelijken van resultaten tussen verschillende gebruikers, batches materialen, plaatlezers en laboratoria41. In gevallen waarin dergelijke vergelijkingen vereist zijn tijdens het prototypen van genetische circuits, raden we aan om interne controlereacties met standaard constitutieve promotors in elke reactieplaat op te nemen om de resultaten in experimentele opstellingen te helpen normaliseren. De methode van DNA-bereiding kan ook een belangrijke bijdrage leveren aan de activiteiten van het GVB; het opnemen van een stap voor de neerslag van ethanol wordt aanbevolen. Bovendien kan de optimale reactiesamenstelling variëren per partij extract34. Met name van optimale magnesiumglutamaat- en kaliumglutamaatconcentraties is aangetoond dat ze variëren per batch42 of met het gebruikte promotor- of reportereiwit24. Concentraties van deze componenten moeten worden geoptimaliseerd door screening op verschillende concentraties van elke component per genetisch construct en per cel extractpreparaat om de optimale omstandigheden voor eiwitexpressie te bepalen. Ten slotte omvatten de beste praktijken voor consistente CFPS-reactieprestaties grondig mengen, zorgvuldig pipetteren en consistentie bij de bereiding van elk reagenscomponent.
Naast de karakterisering van afzonderlijke onderdelen, kan dezelfde methode worden gebruikt om combinaties van onderdelen te screenen die complexe circuits vormen, zoals logische circuits16 of oscillatoren52,53. Deze methode kan ook worden toegepast op het screenen en optimaliseren van biosensoren voor toepassingen in epidemiologische diagnostiek 54,55,56,57 of gevarendetectie en kwantificering 3,58,59. De toepassing van AI-gestuurde technieken zoals actief leren34 kan ook worden gecombineerd met het high-throughput karakter van deze methode om een snelle verkenning van complexe biologische ontwerpruimten te stimuleren. Uiteindelijk zien we deze aanpak die versnelde ontwikkelingstijden voor nieuwe genetische ontwerpen in de synthetische biologie ondersteunt.

Een kerninspanning van synthetische biologie is het ontwikkelen van genetische gereedschapskits met goed gekarakteriseerde onderdelen, die kunnen worden gebruikt om genetische circuits te construeren1 die nuttige functies uitvoeren wanneer ze worden ingezet in microben of celvrije lysaten. Gebieden waarin dergelijke genetische circuits tractie hebben gekregen, zijndetectie 2,3,4, menselijke prestaties 5,6, biobrandstoffen 7,8, materiaalproductie 9,10 en cellulaire computing11. Registers van gestandaardiseerde genetische delen zijn opgericht12 om nieuwe en bestaande delen te catalogiseren in categorieën zoals promotors, operators, coderingssequenties en terminators, om er maar een paar te noemen. Inspanningen zoals de iGEM (international Genetically Engineered Machines) competitie13 hebben een belangrijke rol gespeeld bij het karakteriseren en catalogiseren van deze genetische delen. Er zijn veel methoden ontwikkeld om de snelle assemblage van deze delen in bruikbare genetische circuitste vergemakkelijken 14,15. Er is zelfs software ontwikkeld om de samenstelling van goed gekarakteriseerde onderdelen te automatiseren tot circuits die een gewenste functie bereiken16. De assemblage van nuttige genetische circuits met voorspelbare functies berust echter op de veronderstelling dat de genetische gereedschapskist goed gekarakteriseerde genetische delen bevat. Vanwege de noodzaak van deze toolkits voor de vooruitgang van synthetische biologie, zijn talloze inspanningen om circuits en onderdelen met de juiste karakteriseringsgegevens te catalogiserenbeschreven 17,18,19,20,21.
Een benadering voor het karakteriseren van genetische componenten maakt gebruik van celvrije eiwitsynthese (CFPS) -systemen, die cellulaire functies zoals transcriptie en translatie ex vivo reconstitueren 22. Verschillende studies hebben het potentieel van CFPS aangetoond voor het prototypen van genetische componenten 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32, hetzij voor directe toepassingen in celvrije systemen, hetzij om de functie van genetische constructen in cellen te voorspellen, zoals de relatieve activiteit van delen binnen een bibliotheek29 , metabole pathway optimalisatie27, en cellulaire belasting30. Voordelen van prototyping in CFPS ten opzichte van cellen die door deze studies worden benadrukt, zijn onder meer het vermijden van tijdrovend klonen, nauwkeurige controle over de concentratie van DNA en andere reactiecomponenten en het vermogen om eenvoudig meerdere DNA-constructies te mixen en matchen. Het voordeel van het vermijden van klonen is vooral duidelijk bij het gebruik van lineaire DNA-sjablonen, waardoor nieuwe constructies kunnen worden samengesteld met in vitro methoden die uren duren in plaats van dag33. De mogelijkheid om de concentratie van DNA-constructies en andere componenten eenvoudigweg te manipuleren door te pipetteren, maakt de aanpak nog aantrekkelijker door experimenten met hoge doorvoer mogelijk te maken, aangedreven door robots voor vloeistofbehandeling34,35. Hoewel successen met cfps voor prototyping zijn gemeld, is het belangrijk op te merken dat het nog maar de vraag is onder welke context CFPS-resultaten op betrouwbare wijze functionaliteit in cellen kunnen voorspellen.
Hier presenteren we een methode voor CFPS-prototyping die de voordelen in snelheid, doorvoer en kosten benadrukt in vergelijking met traditionele celgebaseerde benaderingen. De aanpak is afgeleid van ons eerdere werk waarbij we CFPS gebruikten om snel een bibliotheek van T7-promotorvarianten te karakteriseren die worden gereguleerd door de transcriptiefactor TetR32, waarmee we aanzienlijk voortbouwen op het kleine handjevol gereguleerde T7-promotorvarianten die op dat moment beschikbaar waren in de literatuur36,37. Anderen hebben sindsdien het bereik van dergelijke promotors verder uitgebreid38. In onze methode wordt de assemblage van genetische constructen versneld door PCR te gebruiken om sjabloon-DNA te versterken via primers die variant genetische delen toevoegen aan een reportergen. Akoestische vloeistofbehandeling in 384-well platen wordt gebruikt om de doorvoer te verhogen en het benodigde volume aan materialen te verminderen. Eerder werk heeft succesvol gebruik van akoestische vloeistofbehandeling aangetoond bij aanzienlijk lagere volumes39,40 met een variabiliteit die vergelijkbaar is met handmatig pipetteren van grotere volumes41. Naast de methode bieden we informatie over het oplossen van problemen en een beoordeling van potentiële kosten- en tijdsbesparingen. Merk op dat hoewel we hier een protocol opnemen voor het produceren van celvrije lysaten op basis van Sun et al.42, tal van andere commerciële kits en protocollen43,44 ook zouden moeten werken. Evenzo, terwijl we de methode demonstreren voor de karakterisering van promotorvarianten32, kunnen andere delen worden verwisseld door PCR-versterking, zoals riboregulatoren, ribosoombindingsplaatsen (RBSs), isolatoren, eiwittags en terminators. We hopen dat deze methodologie de synthetische biologiegemeenschap kan helpen om het aantal gekarakteriseerde delen voor de assemblage van voorspelbare genetische circuits met een nuttige functie te blijven laten groeien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x YT medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2377-250G</td>
			<td>Alternative to making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td>For plating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (5 cm diameter)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>731-1550</td>
			<td>Used for protein purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destination plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc plate</td>
			<td>142761</td>
			<td>For CFPS reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L</td>
			<td>For digestion of plasmid templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>20871723</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) Rosetta2</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70954</td>
			<td>Cell line used for production of lysate and purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>525</td>
			<td>Acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell</td>
			<td>Thermo Spectronic</td>
			<td>FA-078</td>
			<td>For lysing cells for CFPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impermeable plastic sealable lid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>232702</td>
			<td>Plate seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>RPI</td>
			<td>I56000-25.0</td>
			<td>Used for protein induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g1501-500G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo source plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>PL-05525</td>
			<td>For use with Echo acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td>For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>For production of purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR H2O</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>H10</td>
			<td>Plate reader used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494S</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28606</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSonica Ultrasonic Processor</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q700</td>
			<td>Cell disruption during protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>Updated supplier from Sun et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T7293</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid characterization of genetic parts with cell-free systems

Het karakteriseren en catalogiseren van genetische delen is van cruciaal belang voor het ontwerp van nuttige genetische circuits. Het hebben van goed gekarakteriseerde onderdelen maakt het mogelijk om genetische circuits te verfijnen, zodat hun functie resulteert in voorspelbare uitkomsten. Met de groei van synthetische biologie als een veld, is er een explosie van genetische circuits geweest die zijn geïmplementeerd in microben om functies uit te voeren met betrekking tot detectie, metabole verandering en cellulaire computing. Hier tonen we een snelle en kosteneffectieve methode voor het karakteriseren van genetische delen. Onze methode maakt gebruik van celvrij lysaat, in eigen huis bereid als medium om delen te evalueren via de expressie van een reporter-eiwit. Template DNA wordt voorbereid door PCR-amplificatie met behulp van goedkope primers om variantdelen aan het reporter-gen toe te voegen, en de sjabloon wordt aan de reactie toegevoegd als lineair DNA zonder te klonen. Onderdelen die op deze manier kunnen worden toegevoegd, zijn promotors, operators, ribosoombindingsplaatsen, isolatoren en terminators. Deze aanpak, gecombineerd met de integratie van een akoestische vloeistofbehandelingskast en 384-well platen, stelt de gebruiker in staat om high-throughput evaluaties van genetische onderdelen in één dag uit te voeren. Ter vergelijking: celgebaseerde screeningsbenaderingen vereisen tijdrovend klonen en hebben langere testtijden als gevolg van nachtelijke kweek- en cultuurdichtheidsnormalisatiestappen. Verder stelt het werken in celvrij lysaat de gebruiker in staat om een strakkere controle over de expressieomstandigheden te krijgen door de toevoeging van exogene componenten en DNA bij precieze concentraties. Resultaten verkregen uit celvrije screening kunnen direct worden gebruikt in toepassingen van celvrije systemen of, in sommige gevallen, als een manier om de functie in hele cellen te voorspellen.

Om het nut van onze methoden aan te tonen, presenteren we resultaten die de effecten beschrijven van de nabijheid van de tetO-sequentie tot de T7-promotor op de regulatie van T7 RNAP-gestuurde expressie. De volledige resultaten en hun implicaties zijn te vinden in het werk van McManus et al.32. De workflow wordt beschreven in figuur 1. Vijftien lineaire sjablonen, die alleen variëren in de afstand van de T7-promotor ten opzichte van de tetO-sequentie , werden voorbereid door pcr-amplificatie van de sfGFP-reporter met primers die zijn ontworpen om elke promotorvariant toe te voegen (figuur 2) zoals beschreven in sectie 2 van het protocol. CFPS-reactiecomponenten en -reacties werden volgens het protocol voorbereid. De expressie van sfGFP werd gemeten vanuit elke sjabloon met een titratie van 12 verschillende concentraties van het TetR-eiwit, in drievoud, met behulp van een akoestische vloeistofhandler. Bij 36 CFPS-reacties per template en 15 templates werden in totaal 540 reacties voor de gehele set T7-tetO combinaties uitgevoerd. De hele evaluatie werd uitgevoerd op twee platen in twee plaatlezers. Analyse van deze gegevens toonde aan dat de T7 RNAP T7-gestuurde expressie gelijkelijk tot 13 bp stroomafwaarts vanaf het begin van het T7-transcript downreguleert (figuur 3). Dit resultaat heeft implicaties voor het toekomstige ontwerp van regelbare T7-aangedreven gencircuits door een vermeend venster te beschrijven voor een effectieve onderdrukking van T7 door andere repressoren. Vergelijking van de resultaten van het hier beschreven protocol met DNA bereid door traditioneel klonen onthulde een klein maar statistisch significant verschil in de mate van TetR-repressie tussen formaten. We veronderstelden dat niet-specifieke binding van TetR aan het vector-DNA het waargenomen verschil zou kunnen verklaren. Experimentele resultaten toonden aan dat toevoeging van lineair vector-DNA aan reacties met lineair sjabloon-DNA het verschil verminderde tot niet-statistische significantie, hoewel het bijdragen van andere factoren niet uitsloot, zoals verschillen in periodiciteit van de DNA-helix voor lineaire versus circulaire formaten, die op hun beurt de TetR-binding konden beïnvloeden. Afhankelijk van de toepassing kan het gebruik van een lineaire sjabloon aanvullende validatie vereisen.
We nemen verder representatieve gegevens op over mogelijke problemen met nauwkeurige dosering met behulp van akoestische vloeistofbehandeling (figuur 4). Een oplossing van 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 met 0,25 mM tartrazinekleurstof, werd gebruikt om twee methoden te evalueren voor het programmeren van een akoestische vloeistofbehandelingskast om volumes >1 μL af te geven. Na vloeistofdosering werd de bestemmingsplaat verzegeld en gecentrifugeerd bij 1.500 x g gedurende 1 minuut, en de absorptie bij 425 nm gemeten met een platenlezer. Representatieve resultaten van negen experimenten worden getoond en tonen een meer consistente dosering over de reeks van acht doelputten wanneer de 5 μL-overdracht wordt verdeeld in afzonderlijke 1 μL-dispensen. Op basis van deze waarnemingen wordt aanbevolen om transfers >1 μL op te splitsen in meerdere transfers van ≤1 μL. Zie de sectie Discussie voor meer informatie over het oplossen van problemen met dit belangrijke aspect van het protocol.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig01.jpg"> Figuur 1: Eendaagse workflow voor de evaluatie van promotordelen in celvrij extract. (A) Een verslaggever wordt PCR-versterkt met behulp van primers met genetische delen die moeten worden geëvalueerd (2-5 uur). (B) De celvrije reactiemix wordt bereid zoals beschreven in het protocol en verdeeld in een plaat met 384 putten met de PCR-versterkte sjablonen (30 min). (C) Akoestische vloeistofbehandeling wordt gebruikt om extra componenten te verdelen, waaronder repressoreiwitten, effectormoleculen en andere voorwaardelijke effectoren (10 min). (D) Reporter eiwitexpressie van elke reactie wordt gemeten in een plaatlezer (2-16 uur, afhankelijk van het CFPS-recept en de constructie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig02.jpg"> Figuur 2: Primer-ontwerp voor het toevoegen van genetische delen aan een reportergen door PCR-amplificatie. (A) Het sfGFP-reportergen (groen) wordt versterkt om een RBS (rood) en een T7-promotor (blauw) toe te voegen door PCR. (B) De sfGFP (groen) en een RBS (rood) worden versterkt om een tetO-sequentie (goud) en een T7-promotor (blauw) toe te voegen door PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig03.jpg"> Figuur 3: Het effect van de tetO-positie op de regulatie van een T7-gestuurde expressie. Genormaliseerde maximale repressiewaarden voor lineaire en circulaire template als functie van tetO positie. Sporen vertegenwoordigen de gemiddelde en standaarddeviaties voor drie replicaties. Dit cijfer is gewijzigd van McManus et al.32 onder een Creative Commons CC-BY licentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig04.jpg"> Figuur 4: Tartrazinekleurstof gebruiken om vloeistofdosering te valideren met een akoestische vloeistofbehandelingskast. Zwarte balken geven aan dat 5 μL tartrazine-oplossing uit een enkele bron goed in elk van de acht opeenvolgende doelputten van een 384-well plaat wordt afgegeven met behulp van een enkel programmeercommando. Grijze balken geven aan dat 1 μL uit een enkele bron goed in elk van de acht opeenvolgende doelputten wordt afgegeven met behulp van een enkel programmeercommando en vervolgens deze stap vier keer herhaalt voor een totaal van 5 μL die in elke bestemmingsput wordt afgegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Naam van component</td>
			<td>Volume voor 1 reactie (μL)</td>
			<td>Volume voor 110% van X aantal reacties (μL)</td>
		</tr><tr><td>Q5 PCR Premix</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Water</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sjabloon (1–3 ng/μL)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(indien vastgesteld1) Voorwaartse primer (5 μM)</td>
			<td>0 of 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(indien vastgesteld1) Omgekeerde primer (5 μM)</td>
			<td>0 of 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Master Mix Totaal:</td>
			<td>30 of 40</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(indien variabel1) Voorwaartse primer (5 μM)</td>
			<td>0 of 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(indien variabel1) Omgekeerde primer (5 μM)</td>
			<td>0 of 10</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Werkblad voor de bereiding van reagentia voor PCR-reacties. Waarden in de meest rechtse kolom kunnen door gebruikers worden ingevuld, afhankelijk van het beoogde aantal reacties. 1 Variabele primers bevatten een specifiek onderdeel dat moet worden toegevoegd in de PCR-reactie en kunnen de voorwaartse primer, omgekeerde primer of beide zijn. Vaste primers voegen geen deel toe en kunnen de voorwaartse primer of omgekeerde primer zijn, maar niet beide.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Naam van component</td>
			<td>Volume voor 1 reactie (μL)</td>
			<td>Volume voor 110% van X aantal reacties (μL)</td>
		</tr><tr><td>Celextract</td>
			<td>4.2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Supplement Mix</td>
			<td>3.3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GamS-eiwit (207 μM)</td>
			<td>0.15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sjabloon DNA (20 nM)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>T7 Polymerase (13 mg/ml)</td>
			<td>0.12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Water</td>
			<td>0,73 (dit aantal kan variëren)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Master Mix Totaal:</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Repressor Eiwit:</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Werkblad voor de bereiding van reagentia voor CFPS-reacties. Waarden in de meest rechtse kolom kunnen door gebruikers worden ingevuld, afhankelijk van het beoogde aantal reacties.
Aanvullende tabel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/Table%20S1%20-%20cost%20estimates_REV%20EDITS.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Goed gekarakteriseerde genetische delen zijn noodzakelijk voor het ontwerp van nieuwe genetische circuits. Hier beschrijven we een kosteneffectieve, high-throughput methode voor het snel karakteriseren van genetische delen. Onze methode vermindert kosten en tijd door celvrije lysaten, lineair DNA om klonen te voorkomen en akoestische vloeistofverwerking te combineren om de doorvoer te verhogen en reactievolumes te verminderen.

Snelle karakterisering van genetische delen met celvrije systemen

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

Onze methode maakt de snelle karakterisering van genetische delen mogelijk met behulp van celvrije expressiesystemen en PCR in plaats van klonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat wat meestal dagen tot weken in cellen duurt, met behulp van deze methode in uren tot dagen kan worden gedaan. Ons protocol bevat stappen om uw eigen celvrije expressiesystemen te maken, wat op een aantal plaatsen lastig kan zijn en aanpassingen kan vereisen, afhankelijk van de use case.Wanneer u voor het eerst begint, raden we aan om te beginnen met commerciële kits. Begin met het bereiden van de PCR-mastermix volgens de instructies in het manuscript en bewaar deze op ijs. Aliquot 30 of 40 microliter van de master mix in het bepaalde aantal PCR-buizen en voeg 10 microliter van elke vijf micromolaire variabele primers toe aan correct gelabelde PCR-buizen.Plaats de PCR-buizen in de thermocycler en voer het PCR-programma uit zoals vermeld in het tekstmanuscript. Houd vervolgens de reacties op vier graden Celsius. Als de oorspronkelijke sjabloon plasma-DNA is, voeg dan één microliter DpnI-restrictie-enzym toe om de oorspronkelijke sjabloon te verteren en de reacties gedurende een uur bij 37 graden Celsius te incuberen.Analyseer vijf microliter van elk PCR-product door ze gedurende 20 minuten te scheiden met een 1% agarose-gel op 180 volt. Controleer op de juiste bandgrootte, die varieert met de gekozen kernvolgorde en de lengte van de toegevoegde onderdelen. Zuiver de lineaire sjablonen met behulp van een commerciële PCR-zuiveringskit.Als er meerdere banden aanwezig waren door gel-elektroforese, snijd dan de banden van belang uit de gel en zuiver het DNA met behulp van een commerciële gelextractiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeer elk DNA-sjabloon met behulp van een spectrofotometer en beoordeel de kwaliteit ervan door te controleren of de verhouding van 260 tot 280 nanometer ongeveer 1,8 is. Ontdooi alle componenten op ijs en bereid een hoofdmix voor door alle componenten grondig te mengen met een pipet, zoals vermeld in het manuscript.Let goed op het vermijden van neerslag, vooral voor het aminozuurmengsel. Houd de mastermix op ijs. Koel een plaat met 384 putten op ijs en verdeel de mastermix in aliquots van negen microliter in elke put.Ontdooi het repressereiwit op ijs en verdeel het in een akoestische vloeistofbehandelingsbronplaat, waarbij u ervoor zorgt dat de juiste hoeveelheid dood volume die nodig is voor het type bronplaat dat wordt gebruikt, is inbegrepen. Verdeel het repressereiwit in volumes van één microliter in de juiste bestemmingsputten via de vloeistofbehandelingskast. Neem een seriële verdunning van de gezuiverde verslaggever of een geschikte chemische standaard op de plaat op om de resultaten te vergelijken met andere onderzoeken en andere laboratoria.Kies een reeks concentraties die geschikt zijn voor de verslaggever die wordt gebruikt in het verwachte expressiebereik van de experimenten. Verwarm de plaatlezer voor op 30 graden Celsius. Stel indien mogelijk op het instrument een verticale temperatuurgradiënt van één graad Celsius in om condensatie op de afdichting te beperken.Stel de plaatlezer in om te lezen op instellingen die geschikt zijn voor de verslaggever die in de kernreeks wordt gebruikt, zonder stappen te schudden. Sluit de 384-well plaat af met een ondoordringbare plastic afdichting om verdamping te voorkomen. Plaats de 384-well plaat op de plaathouder en begin met lezen.15 lineaire sjablonen, die alleen variëren in de afstand van de T7-promotor ten opzichte van de tetO-sequentie, werden voorbereid door PCR, waarbij de superfolder groene fluorescerende eiwitrapportage werd versterkt, met primers ontworpen om elke promotorvariant toe te voegen. Analyse van gegevens van in totaal 540 reacties voor de hele set T7 tetO-combinaties toonde aan dat het T7-RNA-polymerase de T7-aangedreven expressie gelijkelijk downreguleert, tot 13 basenparen stroomafwaarts vanaf het begin van het T7-transcript. Meer consistente dosering over de reeks van acht bestemmingsputten met behulp van de akoestische vloeistofhandler werd waargenomen wanneer een overdracht van vijf microliter werd verdeeld in afzonderlijke doses van één microliter.Ons protocol kan worden gebruikt om snel genetische componenten te screenen, of het nu gaat om screening van nieuwe biosensoren of het bouwen van bibliotheken voor genetische delen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Hoog rendement, Site-specific Transfectie van adherente cellen met siRNA Met behulp van micro-elektrode arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Afsluitbare Femtoliter Kamer Arrays voor Celvrije Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

OnePot PURE Cell-Free System

OnePot PURE Celvrij Systeem

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire sjablonen voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...