Name: rapid characterization of genetic parts with cell-free systems
Uploaded: 2021-08-30T14:00:00
Duration: 5 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

עבודה זו התאפשרה הודות לתוכנית המחקר היישומי לקידום סדרי עדיפויות במדע וטכנולוגיה של משרד מזכיר ההגנה. אנו מודים לסקוט וולפר (מעבדת המחקר הימית) על אספקת מלאי sfGFP בשימוש, ולזאכרי סאן והבל צ'יאו (Tierra Biosciences) על דיונים פוריים הקשורים לאב-טיפוס עם מערכות נטולות תאים ולפתרון בעיות הקשורות לטיפול בנוזלים אקוסטיים.

ל-RMM יש נתח פיננסי ב-Tierra Biosciences, חברה פרטית שעושה שימוש בטכנולוגיות נטולות תאים כמו אלה המתוארות במאמר זה לצורך ביטוי וסינון חלבונים.
למחברים האחרים אין מה לחשוף.

הפרוטוקולים המתוארים כאן מספקים אמצעי חסכוני ומהיר לסינון חלקים גנטיים באמצעות ביטוי של חלבון עיתונאי על ידי CFPS. חלקים גנטיים מאופיינים היטב חיוניים לתכנון מעגלים גנטיים צפויים עם תפקוד שימושי. מתודולוגיה זו מגדילה את התפוקה ומקטינה את הזמן הדרוש לסינון חלקים גנטיים חדשים על ידי הסרת הדרישה לעבוד בתאים חיים, תוך שמירה על פונקציונליות המשקפת את הסביבה התאית על ידי שמירה על התהליך המטבולי של ביטוי חלבונים בליזט התא. ניתן לבצע את הפרוטוקול שלנו תוך יום אחד לאחר קבלת פריימרים (~ 2.5-6 שעות להכנת תגובה, 2-16 שעות לתגובת CFPS; איור 1), בהשוואה ל-3 ימים לפחות עבור שיבוט מסורתי (יום אחד כל אחד לבנייה, הרכבה וטרנספורמציה, אימות רצף של שיבוטים ותרבית תאים לצורך הערכה). אנו מעריכים עוד כי העלות למבנה המשתמש בדנ"א ליניארי היא בערך שליש מהשיבוט המסורתי (78 דולר לעומת 237 דולר; טבלה משלימה 1) שיטות. שירותי סינתזה מסחריים מציעים כיום מינימום של 4 ימי עסקים בהתאם לגודל, אם כי יהיו להם עלויות דומות לשיטה שלנו אם מקטעים ליניאריים יוקרנו ישירות ב- CFPS ($78 לעומת $91); לא אימתנו גישה זו. עלות הערכת חלק עם CFPS קטנה בהשוואה ליצירת DNA של התבנית ($0.05/reaction22 לעומת $78 לתבנית), אם כי יש לציין כי עלויות ההפעלה עבור ריאגנטים בתפזורת וציוד ליזיס הן לפחות כמה אלפי דולרים. השימוש במטפל אקוסטי בנוזלים משפר את העלויות רק באופן שולי בכך שהוא מאפשר נפחים קטנים יותר עד 0.5 μL40; היתרון המשמעותי יותר הוא קיצור הזמן להכנת תגובות (~10 דקות לעומת עד שעה, תלוי במספר התגובות), במיוחד כאשר הכנת מספר רב של תגובות מעלה חשש לתגובה מוכנה שיושבת זמן ממושך לפני הדגירה.
למרות שהוא מהיר וחסכוני, עדיין לא ניתן לראות את המגבלות על מתי אב טיפוס CFPS מנבא כראוי את תפקוד in vivo . לדוגמה, כל תגובתיות צולבת עם DNA גנומי לא תזוהה עקב הסרת הגנום המארח במהלך הייצור של מערכת CFPS. כמו כן, ריכוזי רכיבים יכולים להיות נמוכים ב-1-2 סדרי גודל ב-CFPS מאשר בתאים51, מה שעשוי להשפיע על ההתנהגות של חלקים מסוימים כתוצאה מתנאי צפיפות מקרומולקולריים שונים. יתר על כן, היכולת של דנ"א ליניארי לחזות תפקוד in vivo עשויה להיות מוגבלת, למשל, כאשר המבנה המשני של הדנ"א משחק תפקיד חשוב. מגבלה אחרונה היא שמבנים אינם מאומתים ברצף לפני בדיקת פונקציות. ייתכנו מקרים בהם החלק המאופיין אינו מיושר בפועל עם הרצף התיאורטי המיועד. ניתן להקל על כל המגבלות הללו על ידי אימות קבוצת משנה של החלקים שנסקרו בשיטה זו ביישום in vivo המיועד.
במקור פיתחנו מתודולוגיה זו כדי לחקור את ההשפעות של שינוי מיקום המפעיל על מקדמי T7-tetO היברידיים32. הצגנו את הפרוטוקולים כאן בפורמט גנרי יותר, כך שניתן יהיה ליישם אותם על מקדמים, אופרטורים, רצפי קשירת ריבוזומים, מבודדים וטרמינטורים. ניתן להוסיף חלקים גנטיים אלה לקצה 5ʹ או 3ʹ של גן המדווח על ידי PCR באמצעות פריימרים לכל עיצוב, ובכך לייתר את הצורך בסינתזה או שיבוט של כל וריאנט לבדיקה. תוצרי ה-PCR המתקבלים משמשים כתבנית DNA להערכה באמצעות ביטוי של חלבון מדווח. בעבודתנו, פרוטוקול טיהור הזיקה המסופק כאן שימש עבור TetR ו- GamS. אותו הליך יכול לשמש לביטוי וטיהור של מדכאים אחרים, אקטיבטורים, פולימראזות, גורמי סיגמא וחלבונים אחרים התואמים לחלק גנטי מעניין, אם כי ייתכן שיהיה צורך בשינויים עבור החלבון הרצוי המתבטא. טיהור וטיטרציה של חלבונים אלה לתגובות CFPS מאפשר אפיון מפורט יותר של חלק גנטי מסוים. לבסוף, קיימים פרוטוקולי CFPS חלופיים רבים וכל אחד מהם צריך להיות מקובל על החלק של סינון החלקים של המתודולוגיה. לדוגמה, איננו כוללים שלב דיאליזה בפרוטוקול זה, שאחרים מצאו כחשוב לביטוי ממקדמי חיידקים מקומיים22. שינוי הריכוזים של המרכיבים הבסיסיים של CFPS אפשרי גם כן. השימוש בטיפול בנוזלים משפר את היכולת לבדוק את התנאים הרבים על ידי הגדלת התפוקה והקטנת החומרים הדרושים34,35.
תחום אחד שיכול לדרוש פתרון בעיות משמעותי הוא אופטימיזציה של המטפל בנוזלים אקוסטיים. יש למטב את ניפוק המטפל בנוזלים אקוסטיים עבור כל רכיב מועבר ומומלץ מאוד להפעיל בקרות כדי לוודא פיזור ושחזור נאותים לפני איסוף הנתונים. סוג צלחת המקור האידיאלי והגדרת מחלקת הנוזל יהיו תלויים בנוזל הספציפי שיש לחלק ובמרכיביו. לא מומלץ להשתמש בלוחות מצופים אמין כדי לחלק DNA, מכיוון שציפוי האמין עשוי לתקשר עם ה- DNA. כמו כן יש לציין כי היכולת לחלק ריכוזים גבוהים יותר של רכיבים מסוימים עשויה להיות תלויה במודל המטפל בנוזלים אקוסטיים. ניתן לבצע בדיקת העברת נוזלים על ידי ניפוק על אטם צלחת נייר כסף כדי לדמיין היווצרות טיפות מוצלחת; עם זאת, בדיקה זו מספקת מידע מוגבל וטיפות מהגדרות שונות עשויות להיראות זהות. ניתן להשתמש בצבע מסיס במים, כגון טרטרזין, כדי לוודא בצורה מדויקת יותר שהנפח הנכון נמסר מהגדרה או זרימת עבודה נתונה (ראה תוצאות מייצגות). תכנות אופטימלי של העברות נוזלים יכול גם להשפיע על הדיוק והעקביות של הנתונים שנוצרו; עבור העברות >1 μL מבאר מקור אחת לבאר יעד אחת, מצאנו שיש לתכנת העברות רציפות של ≤1 μL כדי להפחית את השונות השיטתית מבאר לבאר (איור 4). לבסוף, נפחי באר מתים תיאורטיים וממשיים יכולים להשתנות באופן דרמטי בהתאם לסוג לוחית המקור, הגדרת מחלקת הנוזל ורכיבי הנוזל הספציפי; שימוש בפונקציית Acoustic Liquid Handler Survey כדי להעריך את נפחי הבאר לפני הפעלת תוכנית עשוי לעזור לאמוד את מידת הדיוק שבה המכשיר מסוגל למדוד נוזל מסוים.
ביצועי תגובת CFPS עשויים להשתנות בעת השוואת תוצאות בין משתמשים שונים, אצוות חומרים, קוראי לוחות ומעבדות41. במקרים שבהם נדרשות השוואות כאלה בעת יצירת אב-טיפוס של מעגלים גנטיים, אנו ממליצים לכלול תגובות בקרה פנימיות עם מקדמים מכוננים סטנדרטיים בכל לוחית תגובה כדי לסייע בנרמול התוצאות בין מערכי ניסוי. שיטת הכנת הדנ"א יכולה גם לתרום במידה רבה לפעילות CFPS; מומלץ לכלול שלב משקעים אתנול. בנוסף, הרכב התגובה האופטימלי יכול להשתנות על ידי אצווה של תמצית34. בפרט, הודגם כי ריכוזי מגנזיום גלוטמט ואשלגן גלוטמט אופטימליים משתנים לפי אצווה42 או לפי חלבון מקדם או מדווח המשמש24. ריכוזים של רכיבים אלה צריכים להיות אופטימליים על ידי סינון על פני מספר ריכוזים של כל רכיב לכל מבנה גנטי ולכל הכנת תמצית התא כדי לקבוע את התנאים האופטימליים לביטוי חלבון. לבסוף, שיטות עבודה מומלצות לביצועי תגובת CFPS עקביים כוללות ערבוב יסודי, פיפטינג זהיר ועקביות בהכנה של כל רכיב מגיב.
מעבר לאפיון חלקים בודדים, ניתן להשתמש באותה שיטה כדי לסנן שילובים של חלקים היוצרים מעגלים מורכבים, כגון מעגלים לוגיים16 או מתנדים52,53. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לסינון ואופטימיזציה של חיישנים ביולוגיים ליישומים באבחון אפידמיולוגי 54,55,56,57 או זיהוי וכימות סיכונים 3,58,59. היישום של טכניקות מונחות בינה מלאכותית כגון למידה פעילה34 יכול גם להיות משולב עם אופי התפוקה הגבוהה של שיטה זו כדי להניע חקירה מהירה של מרחבי תכנון ביולוגיים מורכבים. בסופו של דבר, אנו רואים גישה זו תומכת בזמני פיתוח מואצים עבור עיצובים גנטיים חדשים בביולוגיה סינתטית.

מאמץ מרכזי של ביולוגיה סינתטית הוא לפתח ערכות כלים גנטיים המכילות חלקים מאופיינים היטב, אשר ניתן להשתמש בהם לבניית מעגלים גנטיים1 המבצעים פונקציות שימושיות כאשר הם פרוסים במיקרובים או בליזטים נטולי תאים. תחומים שבהם מעגלים גנטיים כאלה צברו תאוצה הם חישה 2,3,4, ביצועים אנושיים 5,6, דלקים ביולוגיים 7,8, ייצור חומרים 9,10 ומחשוב תאי 11. רישומים של חלקים גנטיים מתוקננים הוקמו12 כדי לקטלג חלקים חדשים וקיימים לקטגוריות כגון מקדמים, אופרטורים, רצפי קידוד וטרמינטורים, אם להזכיר רק כמה. מאמצים כגון תחרות iGEM (מכונות מהונדסות-גנטית בינלאומית)13 סייעו באפיון וקטלוג חלקים גנטיים אלה. שיטות רבות פותחו כדי להקל על הרכבה מהירה של חלקים אלה למעגלים גנטיים שימושיים14,15. תוכנה אף פותחה כדי להפוך את הרכב החלקים המאופיינים היטב לאוטומטיים למעגלים המשיגים פונקציה רצויה16. עם זאת, הרכבת מעגלים גנטיים שימושיים בעלי פונקציות צפויות נשענת על ההנחה שערכות הכלים הגנטיים מכילות חלקים גנטיים מאופיינים היטב. בשל נחיצותן של ערכות כלים אלה לקידום הביולוגיה הסינתטית, תוארו מאמצים רבים לקטלג טוב יותר מעגלים וחלקים עם נתוני אפיון מתאימים 17,18,19,20,21.
גישה אחת לאפיון רכיבים גנטיים עושה שימוש במערכות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS), המשחזרות תפקודים תאיים כגון שעתוק ותרגום ex vivo22. מספר מחקרים הדגימו את הפוטנציאל של CFPS ליצירת אבות-טיפוס של רכיבים גנטיים 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 בין אם ליישומים ישירים במערכות נטולות תאים ובין אם לחיזוי תפקודם של מבנים גנטיים בתאים, כגון הפעילות היחסית של חלקים בתוך ספרייה 29 אופטימיזציה של מסלול מטבולי27, ועומס תאי30., היתרונות לאב-טיפוס ב-CFPS לעומת תאים שהודגשו במחקרים אלה כוללים הימנעות משיבוט הגוזל זמן, שליטה מדויקת בריכוז הדנ"א ומרכיבי תגובה אחרים, והיכולת לערבב ולהתאים בקלות מבני דנ"א מרובים. היתרון של הימנעות משיבוט בולט במיוחד בעת שימוש בתבניות DNA ליניאריות, המאפשרות להרכיב מבנים חדשים בשיטות חוץ גופיות שאורכות שעות במקום ימים33. היכולת לתפעל את ריכוז מבני הדנ"א ורכיבים אחרים פשוט על ידי פיפטינג הופכת את הגישה לאטרקטיבית עוד יותר בכך שהיא מאפשרת ניסויים בתפוקה גבוהה המופעלים על ידי רובוטים לטיפול בנוזלים34,35. בעוד שדווחו הצלחות בשימוש ב- CFPS ליצירת אב טיפוס, חשוב לציין כי נותר לראות באילו הקשרים תוצאות CFPS יכולות לחזות באופן אמין פונקציונליות בתאים.
כאן, אנו מציגים שיטה לאב טיפוס CFPS המדגישה את היתרונות במהירות, תפוקה ועלות בהשוואה לגישות מסורתיות מבוססות תאים. הגישה נגזרת מעבודתנו הקודמת בה השתמשנו ב- CFPS כדי לאפיין במהירות ספרייה של גרסאות מקדם T7 המווסתות על ידי גורם התמלול TetR32, והרחבנו באופן משמעותי את הקומץ הקטן של גרסאות מקדם T7 מוסדרות שהיו זמינות בספרות באותה עת36,37. אחרים, מאז, הרחיבו עוד יותר את טווח המקדמים האלה38. בשיטה שלנו, הרכבת המבנה הגנטי מואצת על ידי שימוש ב- PCR כדי להגביר את ה- DNA של התבנית באמצעות פריימרים המוסיפים חלקים גנטיים שונים לגן המדווח. טיפול בנוזל אקוסטי בצלחות 384 בארות משמש להגדלת התפוקה ולהפחתת נפח החומרים הנדרשים. עבודות קודמות הדגימו שימוש מוצלח בטיפול בנוזל אקוסטי בנפחים נמוכים משמעותית39,40 עם שונות דומה לפיפטינג ידני בנפחים גדולים יותר 41. בנוסף לשיטה, אנו מספקים מידע לפתרון בעיות והערכה של חיסכון פוטנציאלי בעלויות ובזמן. שים לב שבעוד שאנו כוללים פרוטוקול לייצור ליזטים ללא תאים המבוסס על Sun et al.42 כאן, ערכות מסחריות רבות אחרות ופרוטוקולים43,44 צריכים גם לעבוד. באופן דומה, בעוד אנו מדגימים את השיטה לאפיון גרסאות מקדם32, חלקים אחרים יכולים להיות מוחלפים על ידי הגברה PCR, כגון riboregulators, Ribosome Binding Sites (RBSs), מבודדים, תגי חלבון, ו terminators. אנו מקווים כי מתודולוגיה זו תוכל לסייע לקהילת הביולוגיה הסינתטית להמשיך להגדיל את מספר החלקים המאופיינים להרכבת מעגלים גנטיים צפויים בעלי תפקוד שימושי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x YT medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2377-250G</td>
			<td>Alternative to making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td>For plating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (5 cm diameter)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>731-1550</td>
			<td>Used for protein purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destination plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc plate</td>
			<td>142761</td>
			<td>For CFPS reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L</td>
			<td>For digestion of plasmid templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>20871723</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) Rosetta2</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70954</td>
			<td>Cell line used for production of lysate and purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>525</td>
			<td>Acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell</td>
			<td>Thermo Spectronic</td>
			<td>FA-078</td>
			<td>For lysing cells for CFPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impermeable plastic sealable lid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>232702</td>
			<td>Plate seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>RPI</td>
			<td>I56000-25.0</td>
			<td>Used for protein induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g1501-500G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo source plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>PL-05525</td>
			<td>For use with Echo acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td>For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>For production of purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR H2O</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>H10</td>
			<td>Plate reader used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494S</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28606</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSonica Ultrasonic Processor</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q700</td>
			<td>Cell disruption during protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>Updated supplier from Sun et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T7293</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid characterization of genetic parts with cell-free systems

אפיון וקטלוג של חלקים גנטיים הם קריטיים לתכנון מעגלים גנטיים שימושיים. חלקים מאופיינים היטב מאפשרים כוונון עדין של מעגלים גנטיים, כך שתפקודם מביא לתוצאות צפויות. עם צמיחת הביולוגיה הסינתטית כשדה, חלה התפוצצות של מעגלים גנטיים שיושמו במיקרובים כדי לבצע פונקציות הנוגעות לחישה, שינוי מטבולי ומחשוב תאי. כאן אנו מציגים שיטה מהירה וחסכונית לאפיון חלקים גנטיים. השיטה שלנו משתמשת בליזט ללא תאים, המוכן בבית כמדיום להערכת חלקים באמצעות ביטוי של חלבון כתב. הדנ"א של התבנית מוכן על ידי הגברת PCR באמצעות פריימרים זולים כדי להוסיף חלקי וריאנט לגן המדווח, והתבנית מתווספת לתגובה כדנ"א ליניארי ללא שיבוט. חלקים שניתן להוסיף בדרך זו כוללים מקדמים, מפעילים, אתרי קשירת ריבוזום, מבודדים וטרמינטורים. גישה זו, בשילוב עם שילוב של מטפל נוזלים אקוסטי ולוחות 384 בארות, מאפשרת למשתמש לבצע הערכות תפוקה גבוהה של חלקים גנטיים ביום אחד. לשם השוואה, גישות סינון מבוססות תאים דורשות שיבוט הגוזל זמן רב ויש להן זמני בדיקה ארוכים יותר בשל צעדי נורמליזציה של תרביות לילה וצפיפות תרביות. יתר על כן, עבודה בליזט ללא תאים מאפשרת למשתמש לשלוט בצורה הדוקה יותר על תנאי הביטוי באמצעות הוספת רכיבים אקסוגניים ודנ"א בריכוזים מדויקים. תוצאות המתקבלות מסינון ללא תאים יכולות לשמש ישירות ביישומים של מערכות נטולות תאים או, במקרים מסוימים, כדרך לחזות תפקוד בתאים שלמים.

כדי להדגים את התועלת של השיטות שלנו, אנו מציגים תוצאות המתארות את ההשפעות של הקרבה של רצף tetO למקדם T7 על ויסות ביטוי מונע RNAP T7. את התוצאות המלאות ואת השלכותיהן ניתן למצוא בעבודתם של McManus et al.32. זרימת העבודה מתוארת באיור 1. חמש עשרה תבניות ליניאריות, הנבדלות רק במרחק של מקדם T7 ביחס לרצף tetO , הוכנו על ידי הגברה של PCR לכתב sfGFP עם פריימרים שנועדו להוסיף כל וריאנט מקדם (איור 2) כמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול. רכיבי התגובה והתגובות של CFPS הוכנו בהתאם לפרוטוקול. הביטוי של sfGFP נמדד מכל תבנית עם טיטרציה של 12 ריכוזים שונים של חלבון TetR, במשולש, באמצעות מטפל בנוזל אקוסטי. ב-36 תגובות CFPS לכל תבנית ו-15 תבניות, בוצעו בסך הכל 540 תגובות לכל קבוצת צירופי T7-teto. ההערכה כולה בוצעה על שתי צלחות בשני קוראי צלחות. ניתוח נתונים אלה הראה כי T7 RNAP מווסת כלפי מטה ביטוי מונחה T7 באופן שווה עד 13 bp במורד הזרם מתחילת תעתיק T7 (איור 3). לתוצאה זו יש השלכות על התכנון העתידי של מעגלי גנים המונעים על ידי T7 הניתנים לוויסות על ידי תיאור חלון משוער לדיכוי יעיל של T7 על ידי מדכאים אחרים. השוואת תוצאות הפרוטוקול המתואר כאן עם דנ"א שהוכן על ידי שיבוט מסורתי חשפה הבדל קטן אך מובהק סטטיסטית במידת הדיכוי TetR בין פורמטים. שיערנו שקשירה לא ספציפית של TetR לדנ"א הווקטורי יכולה להסביר את ההבדל שנצפה. תוצאות הניסוי הראו כי הוספת דנ"א וקטורי ליניארי לתגובות עם דנ"א תבנית ליניארית הפחיתה את ההבדל למובהקות לא סטטיסטית, אם כי היא לא שללה תרומות מגורמים אחרים, כגון הבדלים במחזוריות של סליל הדנ"א עבור תבניות ליניאריות לעומת מעגליות, אשר בתורן יכולות להשפיע על קשירת TetR. בהתאם ליישום, השימוש בתבנית ליניארית עשוי לדרוש אימות נוסף.
אנו כוללים גם נתונים מייצגים על בעיות פוטנציאליות עם ניפוק מדויק באמצעות טיפול בנוזלים אקוסטיים (איור 4). תמיסה של 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS), pH 7.4 המכיל 0.25 mM צבע טרטרזין שימש להערכת שתי שיטות של תכנות מטפל נוזל אקוסטי כדי לחלק נפחים >1 μL. לאחר ניפוק נוזלים, לוחית היעד נאטמה וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך דקה אחת, והספיגה ב-425 ננומטר נמדדה באמצעות קורא לוחות. תוצאות מייצגות של תשעה ניסויים מוצגות ומדגימות חלוקה עקבית יותר על פני סדרה של שמונה בארות יעד כאשר העברת 5 μL מחולקת לחלוקה נפרדת של 1 μL. בהתבסס על תצפיות אלה, מומלץ לפרק העברות >1 μL להעברות מרובות של ≤1 μL. עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים על פתרון בעיות בהיבט חשוב זה של הפרוטוקול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig01.jpg"> איור 1: זרימת עבודה חד-יומית להערכת חלקי מקדם בתמצית נטולת תאים. (A) כתב מוגבר PCR באמצעות פריימרים המכילים חלקים גנטיים להערכה (2-5 שעות). (B) תערובת התגובה נטולת התאים מוכנה כמפורט בפרוטוקול ומופצת לצלחת של 384 בארות עם תבניות מוגברות PCR (30 דקות). (C) טיפול בנוזל אקוסטי משמש לפיזור רכיבים נוספים, שיכולים לכלול חלבונים מדכאים, מולקולות אפקטור, וכל אפקט מותנה אחר (10 דקות). (D) ביטוי חלבון הכתב מכל תגובה נמדד בקורא צלחות (2-16 שעות, תלוי במתכון ובמבנה של CFPS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig02.jpg"> איור 2: תכנון פריימר להוספת חלקים גנטיים לגן מדווח על-ידי הגברה של PCR. (A) הגן sfGFP reporter (ירוק) יוגבר כדי להוסיף RBS (אדום) ומקדם T7 (כחול) על ידי PCR. (B) sfGFP (ירוק) ו-RBS (אדום) יוגברו כדי להוסיף רצף tetO (זהב) ומקדם T7 (כחול) על ידי PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig03.jpg"> איור 3: ההשפעה של מיקום tetO על ויסות ביטוי מונחה T7. ערכי דיכוי מרביים מנורמלים עבור תבנית ליניארית ומעגלית כפונקציה של מיקום teto. עקבות מייצגות את הממוצע וסטיות התקן עבור שלושה עותקים משוכפלים. נתון זה שונה מ- McManus et al.32 תחת רישיון Creative Commons CC-BY. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig04.jpg"> איור 4: שימוש בצבע טרטרזין כדי לאמת ניפוק נוזלים עם מטפל בנוזל אקוסטי. פסים שחורים מציינים ניפוק של 5 μL של תמיסת טרטרזין ממקור יחיד לתוך כל אחת משמונה בארות היעד העוקבות של לוח 384 בארות באמצעות פקודת תכנות יחידה. פסים אפורים מציינים ניפוק של 1 μL ממקור יחיד לתוך כל אחת משמונה בארות יעד רצופות באמצעות פקודת תכנות יחידה, ולאחר מכן חזרה על שלב זה ארבע פעמים עבור סך של 5 μL שניתנו בכל באר יעד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שם רכיב</td>
			<td>נפח עבור תגובה אחת (μL)</td>
			<td>נפח עבור 110% ממספר X התגובות (μL)</td>
		</tr><tr><td>Q5 PCR Premix</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>מים</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תבנית (1–3 ng/μL)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(אם קבוע1) פריימר קדמי (5 מיקרומטר)</td>
			<td>0 או 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(אם קבוע1) פריימר הפוך (5 מיקרומטר)</td>
			<td>0 או 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>סה"כ מיקס מאסטר:</td>
			<td>30 או 40</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(אם משתנה1) פריימר קדמי (5 מיקרומטר)</td>
			<td>0 או 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(אם משתנה1) פריימר הפוך (5 מיקרומטר)</td>
			<td>0 או 10</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: דף עבודה להכנת ריאגנטים לתגובות PCR. ערכים בעמודה השמאלית ביותר ניתנים למילוי על-ידי משתמשים בהתאם למספר התגובות המיועד. 1 פריימרים משתנים מכילים חלק מסוים שיש להוסיף בתגובת PCR ויכולים להיות פריימר קדמי, פריימר הפוך או שניהם. פריימרים קבועים אינם מוסיפים חלק ויכולים להיות פריימר קדמי או פריימר הפוך, אך לא שניהם.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שם רכיב</td>
			<td>נפח עבור תגובה אחת (μL)</td>
			<td>נפח עבור 110% ממספר X התגובות (μL)</td>
		</tr><tr><td>תמצית תאים</td>
			<td>4.2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תמהיל תוספים</td>
			<td>3.3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>חלבון GamS (207 מיקרומטר)</td>
			<td>0.15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תבנית DNA (20 ננומטר)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>T7 פולימראז (13 מ"ג/מ"ל)</td>
			<td>0.12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>מים</td>
			<td>0.73 (מספר זה עשוי להשתנות)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>סה"כ מיקס מאסטר:</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>חלבון מדכא:</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: גליון עבודה להכנת ריאגנטים לתגובות CFPS. ערכים בעמודה השמאלית ביותר ניתנים למילוי על-ידי משתמשים בהתאם למספר התגובות המיועד.
טבלה משלימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/Table%20S1%20-%20cost%20estimates_REV%20EDITS.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

חלקים גנטיים מאופיינים היטב נחוצים לתכנון מעגלים גנטיים חדשים. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לאפיון מהיר של חלקים גנטיים. השיטה שלנו מפחיתה עלויות וזמן על ידי שילוב ליזטים נטולי תאים, DNA ליניארי למניעת שיבוט וטיפול בנוזלים אקוסטיים כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית את נפחי התגובה.

אפיון מהיר של חלקים גנטיים עם מערכות נטולות תאים

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

השיטה שלנו מאפשרת אפיון מהיר של חלקים גנטיים באמצעות מערכות ביטוי ללא תאים ו-PCR במקום שיבוט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מה שבדרך כלל לוקח ימים עד שבועות בתאים, ניתן לעשות זאת תוך שעות עד ימים בשיטה זו. הפרוטוקול שלנו כולל שלבים ליצירת מערכות ביטוי ללא תאים משלך, שיכולות להיות מסובכות במספר מקומות ועשויות לדרוש התאמות בהתאם למקרה השימוש.בתחילת הדרך, אנו ממליצים להתחיל עם ערכות מסחריות. התחילו בהכנת תערובת מאסטר PCR בהתאם להוראות בכתב היד ואחסנו אותה על קרח. Aliquot 30 או 40 מיקרוליטר של תערובת האב למספר שנקבע של צינורות PCR ולהוסיף 10 מיקרוליטר של כל חמישה פריימרים משתנים מיקרומולרים לצינורות PCR מסומנים כראוי.הכנס את צינורות ה- PCR ל- thermocycler והפעל את תוכנית ה- PCR כפי שהוזכר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, החזיקו את התגובות בארבע מעלות צלזיוס. אם התבנית המקורית היא DNA פלזמה, הוסף מיקרוליטר אחד של אנזים הגבלת DpnI כדי לעכל את התבנית המקורית ולדגור על התגובות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לנתח חמישה מיקרוליטר של כל מוצר PCR על ידי הפרדתם באמצעות ג'ל agarose 1% ב 180 וולט במשך 20 דקות. בדוק את גודל הרצועה הנכון, אשר ישתנה עם רצף הליבה שנבחר ואת אורך החלקים שנוספו. טהרו את התבניות הליניאריות באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית.אם היו מספר רצועות על ידי אלקטרופורזה בג'ל, הוציאו את הפסים המעניינים מהג'ל וטיהרו את הדנ"א באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. כמת כל תבנית DNA באמצעות ספקטרופוטומטר, הערכת איכותה על ידי בדיקה שהיחס בין 260 ל -280 ננומטר הוא בערך 1.8. מפשירים את כל המרכיבים על קרח ומכינים תערובת מאסטר על ידי ערבוב יסודי של כל המרכיבים עם פיפטה, כפי שמוזכר בכתב היד.שימו לב היטב כדי למנוע משקעים, במיוחד עבור תערובת חומצות אמינו. שומרים את תערובת האב על קרח. מצננים צלחת של 384 בארות על קרח ומפזרים את תערובת המאסטר באליציטוטים של תשעה מיקרוליטר לכל באר.הפשירו את חלבון המדכא על קרח והפיצו אותו לצלחת מקור אקוסטית לטיפול בנוזל, תוך הבטחת הכמות המתאימה של נפח מת הנדרשת לסוג צלחת המקור בה נעשה שימוש. פזרו את חלבון המדכא בנפחים של מיקרוליטר אחד לבארות היעד המתאימות באמצעות המטפל בנוזלים. כלול דילול סדרתי של המדווח המטוהר או תקן כימי מתאים על הצלחת כדי להשוות תוצאות עם מחקרים אחרים ומעבדות אחרות.בחר טווח ריכוזים המתאים לכתב המשמש בטווח הביטוי הצפוי של הניסויים. מחממים מראש את קורא הצלחות ל-30 מעלות. במידת האפשר, על המכשיר, להגדיר שיפוע טמפרטורה אנכי של מעלה אחת צלזיוס כדי להגביל את העיבוי על האטם.הגדר את קורא הלוחות לקריאה בהגדרות המתאימות לכתב המשמש ברצף הליבה, מבלי לרעוד צעדים. אטמו את הצלחת בעלת 384 הבארות באטם פלסטיק בלתי חדיר למניעת אידוי. הניחו את הצלחת בעלת 384 הבארות על מחזיק הצלחת והתחילו לקרוא.15 תבניות ליניאריות, הנבדלות רק במרחק של מקדם T7 ביחס לרצף ה-tetO, הוכנו על ידי PCR, והעצימו את כתב-החלבון הפלואורסצנטי הירוק, עם פריימרים שנועדו להוסיף כל גרסה של מקדם. ניתוח נתונים מ-540 תגובות עבור כל קבוצת צירופי T7 tetO הראה כי ה-T7 RNA פולימראז מווסת את הביטוי מונחה T7 באופן שווה, עד 13 זוגות בסיסים במורד הזרם מתחילת תעתיק T7. חלוקה עקבית יותר על פני סדרה של שמונה בארות יעד באמצעות מטפל הנוזלים האקוסטי נצפתה כאשר העברה של חמישה מיקרוליטר חולקה למתקנים נפרדים של מיקרוליטר אחד.ניתן להשתמש בפרוטוקול שלנו כדי לסנן במהירות רכיבים גנטיים, בין אם לצורך סינון של ביו-חיישנים חדשים או בניית ספריות של חלקים גנטיים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

מערכים רבים סגר Femtoliter הלשכה לביולוגיה ללא סלולארי

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

OnePot PURE Cell-Free System

מערכת ללא תאים טהורים של OnePot

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...