Name: rapid characterization of genetic parts with cell-free systems
Uploaded: 2021-08-30T14:00:00
Duration: 5 min
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यह काम विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्राथमिकताओं की उन्नति के लिए रक्षा सचिव के एप्लाइड रिसर्च के कार्यालय द्वारा संभव बनाया गया था। हम उपयोग किए गए एसएफजीएफपी के स्टॉक प्रदान करने के लिए स्कॉट वाल्पर (नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला) और सेल-मुक्त प्रणालियों के साथ प्रोटोटाइप और ध्वनिक तरल हैंडलिंग के संबंधित समस्या निवारण से संबंधित फलदायी चर्चाओं के लिए ज़ैचरी सन और एबेल चियाओ (टिएरा बायोसाइंसेज) को धन्यवाद देते हैं।

आरएमएम की टिएरा बायोसाइंसेज में वित्तीय हिस्सेदारी है, जो एक निजी कंपनी है जो प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्क्रीनिंग के लिए इस लेख में वर्णित सेल-मुक्त प्रौद्योगिकियों का उपयोग करती है।
अन्य लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

सिंथेटिक जीव विज्ञान का एक मुख्य प्रयास अच्छी तरह से विशेषता वाले भागों वाले आनुवंशिक उपकरण किट विकसित करना है, जिसका उपयोग आनुवंशिक सर्किट1 के निर्माण के लिए किया जा सकता है जो रोगाणुओं या सेल-मुक्त लाइसेट में तैनात होने पर उपयोगी कार्य करते हैं। जिन क्षेत्रों में इस तरह के आनुवंशिक सर्किट ने कर्षण प्राप्त किया है, वे 2,3,4, मानव प्रदर्शन 5,6, जैव ईंधन 7,8, सामग्री उत्पादन 9,10 और सेलुलर कंप्यूटिंग 11 को महसूस कर रहे हैं। मानकीकृत आनुवंशिक भागों की रजिस्ट्रियां स्थापित की गई हैंताकि नए और मौजूदा भागों को प्रमोटरों, ऑपरेटरों, कोडिंग अनुक्रमों और टर्मिनेटर जैसी श्रेणियों में सूचीबद्ध किया जा सके। आईजीईएम (अंतर्राष्ट्रीय आनुवंशिक रूप से इंजीनियरिंग मशीन) प्रतियोगिता13 जैसे प्रयासों ने इन आनुवंशिक भागों को चिह्नित करने और सूचीबद्ध करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इन भागों को उपयोगी आनुवंशिक सर्किट14,15 में तेजी से इकट्ठा करने की सुविधा के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। सॉफ्टवेयर को अच्छी तरह से विशेषता वाले भागों की संरचना को सर्किट में स्वचालित करने के लिए भी विकसित किया गया है जो वांछित फ़ंक्शन16 प्राप्त करते हैं। हालांकि, अनुमानित कार्यों के साथ उपयोगी आनुवंशिक सर्किट की असेंबली इस धारणा पर टिकी हुई है कि आनुवंशिक उपकरण किट में अच्छी तरह से विशेषता वाले आनुवंशिक भाग होते हैं। सिंथेटिक जीव विज्ञान की प्रगति की दिशा में इन टूल किट की आवश्यकता के कारण, उचित लक्षण वर्णन डेटा के साथ सर्किट और भागों को बेहतर ढंग से सूचीबद्ध करने के कई प्रयासोंको 17,18,19,20,21 वर्णित किया गया है।
आनुवंशिक घटकों को चिह्नित करने के लिए एक दृष्टिकोण सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रणालियों का उपयोग करता है, जो प्रतिलेखन और अनुवाद एक्स विवो22 जैसे सेलुलर कार्यों का पुनर्गठन करते हैं। कई अध्ययनों ने आनुवंशिक घटकों को प्रोटोटाइप करने के लिए सीएफपीएस की क्षमता का प्रदर्शन कियाहै 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 चाहे सेल-मुक्त प्रणालियों में प्रत्यक्ष अनुप्रयोगों के लिए या कोशिकाओं में आनुवंशिक संरचनाओं के कार्य की भविष्यवाणी करने के लिए, जैसे कि पुस्तकालय के भीतर भागों की सापेक्ष गतिविधि। , चयापचय मार्ग अनुकूलन27, और सेलुलर बोझ30। इन अध्ययनों द्वारा हाइलाइट किए गए सीएफपीएस बनाम कोशिकाओं में प्रोटोटाइप के लाभों में समय लेने वाली क्लोनिंग से बचना, डीएनए और अन्य प्रतिक्रिया घटकों की एकाग्रता पर सटीक नियंत्रण और कई डीएनए संरचनाओं को आसानी से मिश्रण और मिलान करने की क्षमता शामिल है। क्लोनिंग से बचने का लाभ रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करते समय विशेष रूप से स्पष्ट होता है, जो नए निर्माणों को इन विट्रो विधियों द्वारा इकट्ठा करने में सक्षम बनाता है जिसमें33 दिनों के बजाय घंटे लगते हैं। पाइपिंग द्वारा डीएनए संरचनाओं और अन्य घटकों की एकाग्रता में हेरफेर करने की क्षमता तरल हैंडलिंग रोबोट34,35 द्वारा संचालित उच्च-थ्रूपुट प्रयोग को सक्षम करके दृष्टिकोण को और भी आकर्षक बनाती है। जबकि प्रोटोटाइप के लिए सीएफपीएस का उपयोग करने वाली सफलताओं की सूचना दी गई है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह देखा जाना बाकी है कि सीएफपीएस परिणाम किन संदर्भों के तहत कोशिकाओं में कार्यक्षमता की विश्वसनीय भविष्यवाणी कर सकते हैं।
यहां, हम सीएफपीएस प्रोटोटाइप के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो पारंपरिक सेल-आधारित दृष्टिकोणों की तुलना में गति, थ्रूपुट और लागत में फायदे पर जोर देता है। दृष्टिकोण हमारे पिछले काम से लिया गया है जहां हमने प्रतिलेखन कारक टेटआर32 द्वारा विनियमित टी 7 प्रमोटर वेरिएंट की एक लाइब्रेरी को तेजी से चिह्नित करने के लिए सीएफपीएस का उपयोग किया, जो36,37 के समय साहित्य में उपलब्ध विनियमित टी 7 प्रमोटर वेरिएंट के छोटे मुट्ठी भर पर काफी विस्तार कर रहा था। तब से अन्य ने ऐसे प्रवर्तकों की सीमा को और बढ़ा दियाहै। हमारी विधि में, पीसीआर का उपयोग करके आनुवंशिक निर्माण असेंबली को प्राइमरों के माध्यम से टेम्पलेट डीएनए को बढ़ाने के लिए तेज किया जाता है जो एक रिपोर्टर जीन में वेरिएंट आनुवंशिक भागों को जोड़ते हैं। 384-वेल प्लेटों में ध्वनिक तरल हैंडलिंग का उपयोग थ्रूपुट बढ़ाने और आवश्यक सामग्री की मात्रा को कम करने के लिए किया जाता है। पिछले काम ने39,40 की मात्रा में ध्वनिक तरल हैंडलिंग के सफल उपयोग का प्रदर्शन किया है, जिसमें बड़ी मात्रा 41 के मैनुअल पिपेटिंग के बराबर परिवर्तनशीलता है। विधि के अलावा, हम समस्या निवारण जानकारी और संभावित लागत और समय की बचत का आकलन प्रदान करते हैं। ध्यान दें कि जब हम यहां सन एट अल.42 के आधार पर सेल-फ्री लाइसेट बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल करते हैं, तो कई अन्य वाणिज्यिक किट और प्रोटोकॉल43,44 भी काम करना चाहिए। इसी तरह, जब हम प्रमोटर वेरिएंट32 के लक्षण वर्णन के लिए विधि का प्रदर्शन करते हैं, तो अन्य भागों को पीसीआर प्रवर्धन द्वारा इंटरचेंज किया जा सकता है, जैसे कि राइबोरेगुलेटर्स, राइबोसोम बाइंडिंग साइट्स (आरबीएस), इन्सुलेटर, प्रोटीन टैग और टर्मिनेटर। हमें उम्मीद है कि यह पद्धति सिंथेटिक जीव विज्ञान समुदाय को उपयोगी कार्य के साथ अनुमानित आनुवंशिक सर्किट की असेंबली के लिए विशेषता वाले भागों की संख्या बढ़ाने में मदद कर सकती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x YT medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2377-250G</td>
			<td>Alternative to making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td>For plating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (5 cm diameter)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>731-1550</td>
			<td>Used for protein purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destination plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc plate</td>
			<td>142761</td>
			<td>For CFPS reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L</td>
			<td>For digestion of plasmid templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>20871723</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) Rosetta2</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70954</td>
			<td>Cell line used for production of lysate and purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>525</td>
			<td>Acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell</td>
			<td>Thermo Spectronic</td>
			<td>FA-078</td>
			<td>For lysing cells for CFPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impermeable plastic sealable lid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>232702</td>
			<td>Plate seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>RPI</td>
			<td>I56000-25.0</td>
			<td>Used for protein induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g1501-500G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo source plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>PL-05525</td>
			<td>For use with Echo acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td>For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>For production of purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR H2O</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>H10</td>
			<td>Plate reader used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494S</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28606</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSonica Ultrasonic Processor</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q700</td>
			<td>Cell disruption during protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>Updated supplier from Sun et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T7293</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid characterization of genetic parts with cell-free systems

उपयोगी आनुवंशिक सर्किट के डिजाइन के लिए आनुवंशिक भागों को चिह्नित करना और सूचीबद्ध करना महत्वपूर्ण है। अच्छी तरह से विशेषता वाले भागों के होने से आनुवंशिक सर्किट की ठीक-ट्यूनिंग की अनुमति मिलती है, जैसे कि उनके कार्य के परिणामस्वरूप अनुमानित परिणाम होते हैं। एक क्षेत्र के रूप में सिंथेटिक जीव विज्ञान के विकास के साथ, आनुवंशिक सर्किट का विस्फोट हुआ है जिसे संवेदन, चयापचय परिवर्तन और सेलुलर कंप्यूटिंग से संबंधित कार्यों को निष्पादित करने के लिए रोगाणुओं में लागू किया गया है। यहां, हम आनुवंशिक भागों को चिह्नित करने के लिए एक तेज़ और लागत प्रभावी विधि दिखाते हैं। हमारी विधि सेल-फ्री लाइसेट का उपयोग करती है, जिसे एक रिपोर्टर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से भागों का मूल्यांकन करने के लिए एक माध्यम के रूप में इन-हाउस तैयार किया जाता है। टेम्पलेट डीएनए पीसीआर प्रवर्धन द्वारा रिपोर्टर जीन में वेरिएंट भागों को जोड़ने के लिए सस्ती प्राइमरों का उपयोग करके तैयार किया जाता है, और टेम्पलेट को क्लोनिंग के बिना रैखिक डीएनए के रूप में प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है। इस तरह से जोड़े जा सकने वाले भागों में प्रमोटर, ऑपरेटर, राइबोसोम बाइंडिंग साइट, इन्सुलेटर और टर्मिनेटर शामिल हैं। यह दृष्टिकोण, एक ध्वनिक तरल हैंडलर और 384-वेल प्लेटों के समावेश के साथ मिलकर, उपयोगकर्ता को एक ही दिन में आनुवंशिक भागों के उच्च-थ्रूपुट मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। तुलनात्मक रूप से, सेल-आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोणों को समय लेने वाली क्लोनिंग की आवश्यकता होती है और रात भर की संस्कृति और संस्कृति घनत्व सामान्यीकरण चरणों के कारण लंबे समय तक परीक्षण समय होता है। इसके अलावा, सेल-मुक्त लाइसेट में काम करने से उपयोगकर्ता को सटीक सांद्रता पर बहिर्जात घटकों और डीएनए को जोड़ने के माध्यम से अभिव्यक्ति की स्थिति पर सटीक सख्त नियंत्रण करने की अनुमति मिलती है। सेल-मुक्त स्क्रीनिंग से प्राप्त परिणामों का उपयोग सीधे सेल-मुक्त प्रणालियों के अनुप्रयोगों में या, कुछ मामलों में, पूरे कोशिकाओं में कार्य की भविष्यवाणी करने के तरीके के रूप में किया जा सकता है।

हमारे तरीकों की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हम ऐसे परिणाम प्रस्तुत करते हैं जो टी 7 आरएनएपी-संचालित अभिव्यक्ति के विनियमन पर टी 7 प्रमोटर के लिए टेटओ अनुक्रम की निकटता के प्रभावों का वर्णन करते हैं। पूर्ण परिणाम और उनके निहितार्थ मैकमैनस एट अल .32 के काम में पाए जा सकते हैं। वर्कफ़्लो चित्र 1 में वर्णित है। पंद्रह रैखिक टेम्प्लेट, जो केवल टेटओ अनुक्रम के सापेक्ष टी 7 प्रमोटर की दूरी में भिन्न होते हैं, पीसीआर द्वारा एसएफजीएफपी रिपोर्टर द्वारा तैयार किए गए थे, जिसमें प्रोटोकॉल के खंड 2 में वर्णित प्रत्येक प्रमोटर संस्करण (चित्रा 2) को जोड़ने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर थे। प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सीएफपीएस प्रतिक्रिया घटक और प्रतिक्रियाएं तैयार की गईं। एसएफजीएफपी की अभिव्यक्ति को ध्वनिक तरल हैंडलर का उपयोग करके, तीन प्रतियों में, टेटआर प्रोटीन की 12 अलग-अलग सांद्रता के अनुमापन के साथ प्रत्येक टेम्पलेट से मापा गया था। प्रति टेम्पलेट 36 सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं और 15 टेम्प्लेट पर, टी 7-टेटओ संयोजनों के पूरे सेट के लिए कुल 540 प्रतिक्रियाएं की गईं। पूरा मूल्यांकन दो प्लेट रीडर में दो प्लेटों पर किया गया था। इस डेटा के विश्लेषण से पता चला है कि टी 7 आरएनएपी टी 7 ट्रांसक्रिप्ट (चित्रा 3) की शुरुआत से 13 बीपी डाउनस्ट्रीम के माध्यम से टी 7-संचालित अभिव्यक्ति को समान रूप से डाउनरेगुलेट करता है। इस परिणाम में अन्य दमनकर्ताओं द्वारा टी 7 के प्रभावी दमन के लिए एक कथित खिड़की का वर्णन करके विनियमित टी 7-संचालित जीन सर्किट के भविष्य के डिजाइन के लिए निहितार्थ हैं। पारंपरिक क्लोनिंग द्वारा तैयार डीएनए के साथ यहां वर्णित प्रोटोकॉल के परिणामों की तुलना से प्रारूपों के बीच टेटआर दमन की डिग्री में एक छोटा लेकिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर सामने आया। हमने अनुमान लगाया कि वेक्टर डीएनए के लिए टेटआर का गैर-विशिष्ट बंधन देखे गए अंतर की व्याख्या कर सकता है। प्रयोगात्मक परिणामों से पता चला है कि रैखिक टेम्पलेट डीएनए के साथ प्रतिक्रियाओं में रैखिक वेक्टर डीएनए को जोड़ने से गैर-सांख्यिकीय महत्व में अंतर कम हो गया, हालांकि इसने अन्य कारकों से योगदान को खारिज नहीं किया, जैसे कि रैखिक बनाम परिपत्र प्रारूपों के लिए डीएनए हेलिक्स की आवधिकता में अंतर, जो बदले में, टेटआर बाइंडिंग को प्रभावित कर सकता है। एप्लिकेशन के आधार पर, रैखिक टेम्पलेट के उपयोग के लिए अतिरिक्त सत्यापन की आवश्यकता हो सकती है।
हम ध्वनिक तरल हैंडलिंग (चित्रा 4) का उपयोग करके सटीक वितरण के साथ संभावित मुद्दों पर प्रतिनिधि डेटा शामिल करते हैं। 1x फॉस्फेट बफ़र्ड सलाइन (PBS), pH 7.4 जिसमें 0.25 mM टारट्राज़िन डाई होती है, का उपयोग ध्वनिक तरल हैंडलर को प्रोग्रामिंग के दो तरीकों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था ताकि वॉल्यूम >1 μL दिया जा सके। तरल वितरण के बाद, गंतव्य प्लेट को सील कर दिया गया और 1 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और 425 एनएम पर अवशोषण को प्लेट रीडर के साथ मापा गया। नौ प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं और आठ गंतव्य कुओं की श्रृंखला में अधिक सुसंगत वितरण प्रदर्शित करते हैं जब 5 μL स्थानांतरण को अलग-अलग 1 μL डिस्पेंसर में विभाजित किया जाता है। इन टिप्पणियों के आधार पर, यह अनुशंसा की जाती है कि >1 μL के स्थानांतरण को ≤1 μL के कई स्थानान्तरणों में विभाजित किया जाए। प्रोटोकॉल के इस महत्वपूर्ण पहलू के समस्या निवारण के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig01.jpg"> चित्र 1: सेल-मुक्त अर्क में प्रमोटर भागों के मूल्यांकन के लिए एकल-दिवसीय वर्कफ़्लो। (A) एक रिपोर्टर को मूल्यांकन किए जाने वाले आनुवंशिक भागों वाले प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर-प्रवर्धित किया जाता है (2-5 घंटे)। (बी) सेल-मुक्त प्रतिक्रिया मिश्रण प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप से तैयार किया जाता है और पीसीआर-प्रवर्धित टेम्पलेट्स (30 मिनट) के साथ 384-वेल प्लेट में वितरित किया जाता है। (सी) ध्वनिक तरल हैंडलिंग का उपयोग अतिरिक्त घटकों को वितरित करने के लिए किया जाता है, जिसमें दमनकारी प्रोटीन, प्रभावक अणु और कोई अन्य सशर्त प्रभावक (10 मिनट) शामिल हो सकते हैं। (डी) प्रत्येक प्रतिक्रिया से रिपोर्टर प्रोटीन अभिव्यक्ति को एक प्लेट रीडर (सीएफपीएस नुस्खा और निर्माण के आधार पर 2-16 घंटे) में मापा जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig02.jpg"> चित्रा 2: पीसीआर प्रवर्धन द्वारा रिपोर्टर जीन में आनुवंशिक भागों को जोड़ने के लिए प्राइमर डिजाइन। (ए) एसएफजीएफपी रिपोर्टर जीन (हरा) को पीसीआर द्वारा एक आरबीएस (लाल) और टी 7 प्रमोटर (नीला) जोड़ने के लिए प्रवर्धित किया जाएगा। (बी) एसएफजीएफपी (हरा) और एक आरबीएस (लाल) को पीसीआर द्वारा एक टेटओ अनुक्रम (सोना) और टी 7 प्रमोटर (नीला) जोड़ने के लिए प्रवर्धित किया जाएगा। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig03.jpg"> चित्रा 3: टी 7-संचालित अभिव्यक्ति के विनियमन पर टेटओ स्थिति का प्रभाव। टेटओ स्थिति के एक फ़ंक्शन के रूप में रैखिक और परिपत्र टेम्पलेट के लिए सामान्यीकृत अधिकतम दमन मान। निशान तीन प्रतिकृतियों के लिए औसत और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को क्रिएटिव कॉमन्स सीसी-बीवाई लाइसेंस के तहत मैकमैनस एट अल.32 से संशोधित किया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig04.jpg"> चित्रा 4: ध्वनिक तरल हैंडलर के साथ तरल वितरण को मान्य करने के लिए टारट्राज़िन डाई का उपयोग करना। ब्लैक बार एक ही प्रोग्रामिंग कमांड का उपयोग करके 384-वेल प्लेट के लगातार आठ गंतव्य कुओं में से प्रत्येक में एक स्रोत से 5 μL टारट्राज़िन समाधान वितरित करने का संकेत देते हैं। ग्रे बार एकल प्रोग्रामिंग कमांड का उपयोग करके लगातार आठ गंतव्य कुओं में से प्रत्येक में एक स्रोत से 1 μL वितरित करने का संकेत देते हैं, और फिर प्रत्येक गंतव्य में वितरित कुल 5 μL के लिए इस चरण को चार बार दोहराते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>घटक का नाम</td>
			<td>1 अभिक्रिया के लिए आयतन (μL)</td>
			<td>प्रतिक्रियाओं की X संख्या के 110% के लिए मात्रा (μL)</td>
		</tr><tr><td>Q5 पीसीआर प्रीमिक्स</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>पानी</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>टेम्पलेट (1–3 ng/μL)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(यदि तयकिया गया है 1) फॉरवर्ड प्राइमर (5 μM)</td>
			<td>0 या 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(यदि तयकिया गया है 1) रिवर्स प्राइमर (5 μM)</td>
			<td>0 या 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>मास्टर मिक्स कुल:</td>
			<td>30 या 40</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(यदि चर1) फॉरवर्ड प्राइमर (5 μM)</td>
			<td>0 या 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(यदि चर1) रिवर्स प्राइमर (5 μM)</td>
			<td>0 या 10</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>तालिका 1: पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए अभिकर्मकों की तैयारी के लिए कार्यपत्रक। प्रतिक्रियाओं की इच्छित संख्या के आधार पर उपयोगकर्ताओं द्वारा दाएं कॉलम में मान भरे जा सकते हैं। 1 परिवर्तनीय प्राइमरों में पीसीआर प्रतिक्रिया में जोड़ा जाने वाला एक विशिष्ट हिस्सा होता है और यह फॉरवर्ड प्राइमर, रिवर्स प्राइमर या दोनों हो सकता है। फिक्स्ड प्राइमर एक हिस्सा नहीं जोड़ते हैं और फॉरवर्ड प्राइमर या रिवर्स प्राइमर हो सकते हैं लेकिन दोनों नहीं।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>घटक का नाम</td>
			<td>1 अभिक्रिया के लिए आयतन (μL)</td>
			<td>प्रतिक्रियाओं की X संख्या के 110% के लिए मात्रा (μL)</td>
		</tr><tr><td>सेल निकालने</td>
			<td>4.2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>पूरक मिश्रण</td>
			<td>3.3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GamS प्रोटीन (207 μM)</td>
			<td>0.15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>टेम्पलेट डीएनए (20 एनएम)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>टी 7 पोलीमरेज़ (13 मिलीग्राम /</td>
			<td>0.12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>पानी</td>
			<td>0.73 (यह संख्या भिन्न हो सकती है)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>मास्टर मिक्स कुल:</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>दमनकारी प्रोटीन:</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>तालिका 2: सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं के लिए अभिकर्मकों की तैयारी के लिए कार्यपत्रक। प्रतिक्रियाओं की इच्छित संख्या के आधार पर उपयोगकर्ताओं द्वारा दाएं कॉलम में मान भरे जा सकते हैं।
अनुपूरक तालिका। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/Table%20S1%20-%20cost%20estimates_REV%20EDITS.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

उपन्यास आनुवंशिक सर्किट के डिजाइन के लिए अच्छी तरह से विशेषता वाले आनुवंशिक भाग आवश्यक हैं। यहां हम आनुवंशिक भागों को तेजी से चिह्नित करने के लिए एक लागत प्रभावी, उच्च-थ्रूपुट विधि का वर्णन करते हैं। हमारी विधि सेल-मुक्त लाइसेट, क्लोनिंग से बचने के लिए रैखिक डीएनए और थ्रूपुट बढ़ाने और प्रतिक्रिया की मात्रा को कम करने के लिए ध्वनिक तरल हैंडलिंग के संयोजन से लागत और समय को कम करती है।

सेल-फ्री सिस्टम के साथ आनुवंशिक भागों का तेजी से लक्षण वर्णन

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

हमारी विधि क्लोनिंग के बजाय सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली और पीसीआर का उपयोग करके आनुवंशिक भागों के तेजी से लक्षण वर्णन की अनुमति देती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि आमतौर पर कोशिकाओं में दिन से लेकर हफ्तों तक का समय लगता है, इस विधि का उपयोग करके घंटों से दिनों तक किया जा सकता है। हमारे प्रोटोकॉल में आपके स्वयं के सेल-मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम बनाने के लिए कदम शामिल हैं, जो कई स्थानों पर मुश्किल हो सकते हैं और उपयोग के मामले के आधार पर समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।पहली बार शुरू करते समय, हम वाणिज्यिक किट के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं। पांडुलिपि में दिए गए निर्देशों के अनुसार पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करके शुरू करें और इसे बर्फ पर स्टोर करें। मास्टर के एलिकोट 30 या 40 माइक्रोलीटर पीसीआर ट्यूबों की निर्धारित संख्या में मिश्रण करते हैं और प्रत्येक पांच माइक्रोमोलर चर प्राइमरों के 10 माइक्रोलीटर को उचित रूप से लेबल किए गए पीसीआर ट्यूबों में जोड़ते हैं।पीसीआर ट्यूबों को थर्मोसाइक्लर में रखें और टेक्स्ट पांडुलिपि में उल्लिखित पीसीआर प्रोग्राम चलाएं। फिर, प्रतिक्रियाओं को चार डिग्री सेल्सियस पर रखें। यदि मूल टेम्पलेट प्लाज्मा डीएनए है, तो मूल टेम्पलेट को पचाने के लिए डीपीएनआई प्रतिबंध एंजाइम का एक माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रतिक्रियाओं को एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के पांच माइक्रोलीटर का विश्लेषण करें और उन्हें 20 मिनट के लिए 180 वोल्ट पर 1% अगारोस जेल का उपयोग करके अलग करें। सही बैंड आकार की जांच करें, जो चुने हुए कोर अनुक्रम और जोड़े गए भागों की लंबाई के साथ भिन्न होगा। एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके रैखिक टेम्पलेट्स को शुद्ध करें।यदि जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा कई बैंड मौजूद थे, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार, जेल से रुचि के बैंड का उत्पादन करें और वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक डीएनए टेम्पलेट की मात्रा निर्धारित करें, यह जांचकर इसकी गुणवत्ता का आकलन करें कि 260 से 280 नैनोमीटर अनुपात लगभग 1.8 है। बर्फ पर सभी घटकों को पिघलाएं और सभी घटकों को पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाकर एक मास्टर मिश्रण तैयार करें, जैसा कि पांडुलिपि में उल्लेख किया गया है।वर्षा से बचने के लिए सावधानीपूर्वक ध्यान दें, खासकर अमीनो एसिड मिश्रण के लिए। मास्टर मिश्रण को बर्फ पर रखें। बर्फ पर एक 384-वेल प्लेट को ठंडा करें और मास्टर मिश्रण को नौ-माइक्रोलीटर एलिकोट में प्रत्येक कुएं में वितरित करें।बर्फ पर दमनकारी प्रोटीन को पिघलाएं और इसे ध्वनिक तरल हैंडलिंग स्रोत प्लेट में वितरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि उपयोग किए गए स्रोत प्लेट के प्रकार के लिए आवश्यक मृत मात्रा की उचित मात्रा शामिल है। एक-माइक्रोलीटर वॉल्यूम में दमनकारी प्रोटीन को तरल हैंडलर के माध्यम से उपयुक्त गंतव्य कुओं में वितरित करें। अन्य अध्ययनों और अन्य प्रयोगशालाओं के साथ परिणामों की तुलना करने के लिए शुद्ध रिपोर्टर या प्लेट पर एक उपयुक्त रासायनिक मानक का एक सीरियल कमजोर पड़ना शामिल करें।प्रयोगों की अपेक्षित अभिव्यक्ति सीमा में उपयोग किए जाने वाले रिपोर्टर के लिए उपयुक्त सांद्रता की एक श्रृंखला चुनें। प्लेट रीडर को 30 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म करें। यदि संभव हो, तो उपकरण पर, सील पर संघनन को सीमित करने के लिए एक डिग्री सेल्सियस ऊर्ध्वाधर तापमान ढाल सेट करें।चरणों को हिलाए बिना, कोर अनुक्रम में उपयोग किए जाने वाले रिपोर्टर के लिए उपयुक्त सेटिंग्स पर पढ़ने के लिए प्लेट रीडर सेट करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक अभेद्य प्लास्टिक सील के साथ 384-वेल प्लेट को सील करें। प्लेट धारक पर 384-वेल प्लेट रखें और पढ़ना शुरू करें।15 रैखिक टेम्प्लेट, जो केवल टेटो अनुक्रम के सापेक्ष टी 7 प्रमोटर की दूरी में भिन्न होते हैं, पीसीआर द्वारा तैयार किए गए थे, जो सुपरफ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर को बढ़ाते थे, जिसमें प्राइमर प्रत्येक प्रमोटर संस्करण को जोड़ने के लिए डिज़ाइन किए गए थे। टी 7 टेटओ संयोजनों के पूरे सेट के लिए कुल 540 प्रतिक्रियाओं के डेटा के विश्लेषण से पता चला है कि टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ टी 7 ट्रांसक्रिप्ट की शुरुआत से 13 बेस जोड़े के माध्यम से टी 7-संचालित अभिव्यक्ति को समान रूप से डाउनरेगुलेट करता है। ध्वनिक तरल हैंडलर का उपयोग करके आठ गंतव्य कुओं की श्रृंखला में अधिक सुसंगत वितरण देखा गया था जब पांच-माइक्रोलीटर स्थानांतरण को अलग-अलग एक-माइक्रोलीटर डिस्पेंसर में विभाजित किया गया था।हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग आनुवंशिक घटकों को तेजी से स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है, चाहे नए बायोसेंसर की स्क्रीनिंग के लिए या आनुवंशिक भागों के पुस्तकालयों के निर्माण के लिए।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

उच्च दक्षता, siRNA microelectrode arrays का उपयोग करने के साथ पक्षपाती कोशिकाओं के अभिकर्मक साइट विशेष (विदेश मंत्रालय)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

AFM आधारित एकल अणु शक्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ Cellulosome के रिसेप्टर ligand सिस्टम की जांच कर

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

एक केस स्टडी के रूप में तंबाकू में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति: प्रयोगों दृष्टिकोण की डिजाइन का उपयोग कर परिसर सिस्टम की विशेषता

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

सेल मुक्त जीवविज्ञान के लिए sealable Femtoliter चैंबर सारणियों

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

एक microfluidic जांच के साथ लाइव सेल परतों की रैपिड Subtractive patterning के

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

एक ई. कोलाईआधारित कोशिका-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में संक्रामक Bacteriophages का संश्लेषण

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

नैनो में Endotoxin का पता लगाने-योगों Limulus Amoebocyte Lysate (लाल) परख का उपयोग

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

लंबे समय तक सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के संचालन के लिए एक बहुपरत Microfluidic मंच

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

OnePot PURE Cell-Free System

वनपॉट शुद्ध सेल-फ्री सिस्टम

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

सेल-फ्री सिस्टम का उपयोग करके प्रोटीन प्रोटोटाइप के लिए न्यूनतम, रैखिक टेम्पलेट्स के प्रवर्धन के लिए रैपिड, एंजाइमेटिक तरीके

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...