Name: rapid characterization of genetic parts with cell-free systems
Uploaded: 2021-08-30T14:00:00
Duration: 5 min
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この作業は、国防長官室の科学技術の優先順位の進歩のための応用研究プログラムによって可能になりました。使用したsfGFPの在庫を提供してくれたScott Walper氏(海軍研究所)と、無細胞システムによるプロトタイピングと音響液体処理の関連するトラブルシューティングに関する有意義な議論をしてくれたZachary Sun氏とAbel Chiao氏(Tierra Biosciences)に感謝します。

RMMは、タンパク質の発現とスクリーニングにこの記事で説明されているような無細胞技術を利用する民間企業であるTierra Biosciencesに金銭的利害関係を持っています。
他の著者は開示するものは何もありません。

ここで説明するプロトコルは、CFPSによるレポータータンパク質の発現を介して遺伝子部分をスクリーニングするための費用効果が高く迅速な手段を提供します。十分に特徴付けられた遺伝子部分は、有用な機能を備えた予測可能な遺伝子回路の設計に不可欠です。この方法論は、細胞ライセートでのタンパク質発現の代謝プロセスを保持することにより、細胞環境を反映する機能を維持しながら、生細胞で働く必要を排除することにより、スループットを向上させ、新しい遺伝子部分のスクリーニングに必要な時間を短縮します。私たちのプロトコルは、プライマーの受領後1日で実行できます(反応準備の場合は~2.5-6時間、CFPS反応の場合は2-16時間; 図1)、従来のクローニングのための少なくとも3日(構築物の組み立ておよび形質転換、クローンの配列検証、および評価のための細胞の培養のためにそれぞれ1日)と比較した。さらに、線状DNAを使用した構築物あたりのコストは、従来のクローニングの約3分の1であると推定しています(78ドル対237ドル; 別表1)メソッド。現在、商用合成サービスはサイズに応じて最低4営業日を見積もりますが、線形フラグメントをCFPSで直接スクリーニングする場合、当社の方法と同様のコストがかかります(78ドル対91ドル)。このアプローチは検証されていません。CFPSで部品を評価するためのコストは、テンプレートDNAの生成と比較して小さいですが(0.05ドル/反応22 対テンプレートあたり78ドル)、バルク試薬と溶解装置の初期費用は少なくとも数千ドルであることに注意してください。音響液体ハンドラーの使用は、0.5μLまでの小容量を可能にすることにより、コストをわずかに改善するだけです40。より重要な利点は、反応を調製する時間の短縮(反応数に応じて~10分対最大1時間)であり、特に多数の反応を調製すると、インキュベーション前に調製反応を長時間放置する懸念が生じる。
迅速かつ費用対効果は高いものの、CFPSプロトタイピングが in vivo 機能を適切に予測する場合の限界はまだ見られません。例えば、ゲノムDNAとの交差反応性は、CFPSシステムの製造中に宿主ゲノムが除去されるため検出されません。また、成分濃度は、細胞51よりもCFPSで1〜2桁低くなる可能性があり、これは、異なる高分子クラウディング条件の結果として、一部の部分の挙動に影響を与える可能性がある。さらに、線状DNAが in vivo 機能を予測する能力は、例えば、DNA二次構造が重要な役割を果たす場合、制限され得る。最後の制限は、関数をテストする前にコンストラクトがシーケンス検証されないことです。特性評価された部品が、実際には意図した理論シーケンスと整合していない場合があります。これらの制限の全ては、意図された in vivo アプリケーションにおいて、この方法によってスクリーニングされた部品のサブセットを検証することによって軽減することができる。
我々はもともと、ハイブリッドT7-tetOプロモーター32に対するオペレーターの位置を変えることの影響を調べるためにこの方法論を開発しました。ここでは、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合配列、絶縁体、およびターミネーターに適用できるように、より一般的な形式でプロトコルを示しました。これらの遺伝子部分は、各設計のプライマーを使用したPCRによってレポーター遺伝子の5'または3'末端に追加できるため、テストするための各バリアントの合成またはクローニングが不要になります。得られたPCR産物は、レポータータンパク質の発現を介して評価するための鋳型DNAとして機能します。私たちの研究では、ここで提供されるアフィニティー精製プロトコルがTetRとGamSに使用されました。同じ手順を、他のリプレッサー、アクチベーター、ポリメラーゼ、シグマ因子、および目的の遺伝的部分に同義の他のタンパク質の発現および精製に使用することができるが、発現される所望のタンパク質には修飾が必要な場合がある。これらのタンパク質を精製してCFPS反応に滴定することで、特定の遺伝子部分のより詳細な特性評価が可能になります。最後に、多数の代替CFPSプロトコルが存在し、それぞれが方法論の部品スクリーニング部分に適している必要があります。一例として、本発明者らは、このプロトコールに透析ステップを含めず、これは、天然細菌プロモーター22からの発現に重要であることを他の人が見出した。CFPSの基礎となる構成成分の濃度を変えることも可能です。リキッドハンドリングの使用は、スループットを増加させ、必要な材料を減らすことにより、無数の条件をテストする能力を高めます34,35。
重要なトラブルシューティングが必要になる可能性のある領域の1つは、音響液体ハンドラーの最適化です。アコースティックリキッドハンドラーディスペンシングは、移送されるコンポーネントごとに最適化する必要があり、データを収集する前に、コントロールを実行して適切な分布と再現性を検証することを強くお勧めします。理想的なソースプレートタイプと液体クラスの設定は、分注する特定の液体とその成分によって異なります。アミンコーティングはDNAと相互作用する可能性があるため、DNAを分注するためにアミンコーティングプレートを使用することはお勧めしません。特定の成分のより高い濃度を分配する能力は、音響液体ハンドラーモデルに依存し得ることにも留意すべきである。試験液の移送は、ホイルプレートシールに分注して、液滴形成の成功を視覚化することによって行うことができます。ただし、このテストでは限られた情報しか提供されず、異なる設定からの液滴が同じように見える場合があります。タートラジンなどの水溶性染料の使用は、所与の設定またはワークフローで分配される正しい量をより正確に検証するために使用され得る( 代表的な結果を参照)。液体移送の最適なプログラミングは、生成されるデータの精度と一貫性にも影響を与える可能性があります。1つのソースウェルから1つのデスティネーションウェルへの>1 μLの移送では、系統的なウェル間の変動を低減するために≤1 μLの順次移送をプログラムする必要があることがわかりました(図4)。最後に、理論上および実際のソースウェルデッドボリュームは、ソースプレートのタイプ、液体クラスの設定、および特定の液体の成分によって大幅に異なる場合があります。プログラムを実行する前に、音響液体ハンドラー調査機能を使用して井戸の体積を評価すると、機器が特定の液体をどれだけ正確に測定できるかを測定するのに役立ちます。
CFPS反応性能は、異なるユーザー、材料のバッチ、プレートリーダー、およびラボ41間で結果を比較するときに異なる場合があります。遺伝子回路のプロトタイピング中にこのような比較が必要な場合は、実験セットアップ間で結果を正規化するために、各反応プレートに標準構成プロモーターを使用した内部制御反応を含めることをお勧めします。DNA調製の方法もCFPS活性に大きく寄与する可能性があります。エタノール沈殿ステップを含めることが推奨されます。加えて、最適な反応組成は、抽出物34のバッチによって変化し得る。最適なグルタミン酸マグネシウムおよびグルタミン酸カリウム濃度は、特に、バッチ42 によって、または使用されたプロモーターまたはレポータータンパク質24によって変動することが示されている。これらの成分の濃度は、タンパク質発現の最適条件を決定するために、遺伝子構築物および細胞抽出物調製物ごとに各成分の数濃度にわたってスクリーニングすることによって最適化されるべきである。最後に、一貫したCFPS反応性能のためのベストプラクティスには、徹底的な混合、慎重なピペッティング、および各試薬成分の調製における一貫性が含まれます。
個々の部品の特性評価を超えて、論理回路16または発振器52、53などの複雑な回路を形成する部品の組み合わせをスクリーニングするために同じ方法を使用してもよい。この方法は、疫学診断54,55,56,57またはハザード検出および定量化3,58,59におけるアプリケーションのためのバイオセンサのスクリーニングおよび最適化にも適用することができる。アクティブラーニング34などのAI駆動型技術の適用は、この方法の高スループットの性質と組み合わせて、複雑な生物学的設計空間の迅速な探索を推進することもできます。最終的には、このアプローチが合成生物学における新しい遺伝子設計の開発期間の短縮をサポートすることを想定しています。

合成生物学の中核となる取り組みは、微生物や無細胞溶解物に展開されたときに有用な機能を実行する遺伝子回路1を構築するために使用できる、十分に特性化された部品を含む遺伝子ツールキットを開発することです。このような遺伝子回路が牽引力を獲得している分野は、センシング2,3,4、人間のパフォーマンス5,6、バイオ燃料7,8、材料生産9,10、およびセルラーコンピューティング11です。標準化された遺伝子部分のレジストリが確立されました12 新規および既存の部分をプロモーター、オペレーター、コーディング配列、ターミネーターなどのカテゴリにカタログ化します。iGEM(国際遺伝子工学機械)コンペティション13などの取り組みは、これらの遺伝子部分の特性評価とカタログ化に役立っています。これらの部分を有用な遺伝子回路に迅速に組み立てることを容易にするために、多くの方法が開発されてきた14,15。ソフトウェアは、十分に特性化された部品を所望の機能16を達成する回路に自動化することさえ開発されている。しかし、予測可能な機能を持つ有用な遺伝子回路の組み立ては、遺伝子ツールキットが十分に特徴付けられた遺伝子部分を含んでいるという仮定に基づいています。合成生物学の進歩に向けたこれらのツールキットの必要性のために、適切な特性評価データで回路および部品をよりよくカタログ化するための多くの努力が記載されている17、18、19、20、21。
遺伝的構成要素を特徴付けるための1つのアプローチは、転写およびex vivoなどの細胞機能を再構成する無細胞タンパク質合成(CFPS)システムを利用する22。いくつかの研究は、無細胞系での直接適用であろうと、ライブラリー内の部分の相対的な活性など、細胞内の遺伝子構築物の機能を予測するためであろうと、遺伝子成分のプロトタイピングのためのCFPSの可能性を実証しています23,24,25,26,27,28,29,30,31,32、代謝経路最適化27、および細胞負荷30。これらの研究で強調された細胞と比較してCFPSでのプロトタイピングの利点には、時間のかかるクローニングの回避、DNAやその他の反応成分の濃度の正確な制御、複数のDNA構築物を簡単に混合して一致させることができることが含まれます。クローニングを回避する利点は、線形DNAテンプレートを使用する場合に特に顕著であり、33日目ではなく数時間かかるin vitro法で新しい構築物を組み立てることができます。ピペッティングによってDNA構築物および他の成分の濃度を操作する能力は、液体処理ロボット34,35によって駆動されるハイスループット実験を可能にすることによって、アプローチをさらに魅力的にする。プロトタイピングにCFPSを使用した成功が報告されていますが、CFPSの結果が細胞内の機能を確実に予測できるコンテキストではまだ確認されていないことに注意することが重要です。
ここでは、従来のセルベースのアプローチと比較して、速度、スループット、およびコストの利点を強調したCFPSプロトタイピングの方法を紹介します。このアプローチは、CFPSを使用して転写因子TetR32によって調節されるT7プロモーターバリアントのライブラリを迅速に特徴付け、当時の文献で利用可能であった少数の調節されたT7プロモーターバリアントを大幅に拡張した以前の研究に由来しています36,37。他のものは、それ以来、そのようなプロモーター38の範囲をさらに拡大した。私たちの方法では、PCRを使用して、レポーター遺伝子に変異遺伝子部分を追加するプライマーを介してテンプレートDNAを増幅することにより、遺伝子構築物の組み立てを加速します。384ウェルプレートでの音響液体処理は、スループットを向上させ、必要な材料の量を減らすために使用されます。以前の研究では、大幅に低い容量39,40での音響液体処理の使用に成功し、より大きな容量の手動ピペッティングに匹敵する変動性を示しました41。この方法に加えて、トラブルシューティング情報と潜在的なコストと時間の節約の評価を提供します。Sunら42に基づく無細胞ライセートを製造するためのプロトコルをここに含めているが、他の多くの市販のキットおよびプロトコル43,44も機能するはずであることに注意してください。同様に、我々は、プロモーター変異体32の特性評価のための方法を実証するが、リボレギュレーター、リボソーム結合部位(RBS)、絶縁体、タンパク質タグ、およびターミネーターなどの他の部分は、PCR増幅によって交換され得る。この方法論が、合成生物学コミュニティが有用な機能を備えた予測可能な遺伝子回路の組み立てのために特徴付けられた部品の数を増やし続けるのに役立つことを願っています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x YT medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2377-250G</td>
			<td>Alternative to making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td>For plating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (5 cm diameter)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>731-1550</td>
			<td>Used for protein purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destination plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc plate</td>
			<td>142761</td>
			<td>For CFPS reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L</td>
			<td>For digestion of plasmid templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>20871723</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) Rosetta2</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70954</td>
			<td>Cell line used for production of lysate and purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>525</td>
			<td>Acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell</td>
			<td>Thermo Spectronic</td>
			<td>FA-078</td>
			<td>For lysing cells for CFPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impermeable plastic sealable lid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>232702</td>
			<td>Plate seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>RPI</td>
			<td>I56000-25.0</td>
			<td>Used for protein induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g1501-500G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo source plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>PL-05525</td>
			<td>For use with Echo acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td>For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>For production of purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR H2O</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>H10</td>
			<td>Plate reader used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494S</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28606</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSonica Ultrasonic Processor</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q700</td>
			<td>Cell disruption during protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>Updated supplier from Sun et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T7293</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid characterization of genetic parts with cell-free systems

遺伝子部分の特性評価とカタログ化は、有用な遺伝子回路の設計にとって重要です。十分に特徴付けられた部品を持つことは、それらの機能が予測可能な結果をもたらすように、遺伝子回路の微調整を可能にする。合成生物学の分野としての成長に伴い、センシング、代謝変化、セルラーコンピューティングに関連する機能を実行するために微生物に実装された遺伝子回路が爆発的に増加しています。ここでは、遺伝子部分を特徴付けるための迅速かつ費用対効果の高い方法を示します。私たちの方法は、レポータータンパク質の発現を介して部品を評価するための培地として社内で調製された無細胞ライセートを利用します。テンプレートDNAは、安価なプライマーを用いたPCR増幅によりレポーター遺伝子に変異部分を付加し、クローニングせずに直鎖状DNAとして反応に鋳型を付加します。このようにして添加することができる部分には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、絶縁体、およびターミネーターが含まれる。このアプローチは、音響液体ハンドラーと384ウェルプレートの組み込みと組み合わせることで、ユーザーは1日で遺伝子部分のハイスループット評価を実行できます。比較すると、細胞ベースのスクリーニングアプローチは、時間のかかるクローニングを必要とし、一晩の培養および培養密度の標準化ステップのためにテスト時間が長くなります。さらに、無細胞ライセートで作業することで、外因性成分とDNAを正確な濃度で添加することにより、発現条件を正確に厳密に制御できます。無細胞スクリーニングから得られた結果は、無細胞系のアプリケーションに直接使用したり、場合によっては細胞全体の機能を予測する方法として使用したりできます。

我々の方法の有用性を実証するために、T7 RNA駆動発現の制御に対するT7プロモーターへのtetO配列の近接性の影響を説明する結果を提示します。完全な結果とその含意は、McManusらの研究32で見つけることができます。このワークフローを図 1 に示します。プロトコルのセクション2に記載されているように、各プロモーター変異体(図2)を追加するように設計されたプライマーでsfGFPレポーターをPCR増幅することにより、tetO配列に対するT7プロモーターの距離のみが変化する15の線形テンプレートを調製しました。CFPS反応成分および反応は、プロトコールに従って調製した。sfGFPの発現を、音響液体ハンドラーを用いて、12の異なる濃度のTetRタンパク質の滴定で各鋳型から三重に測定した。テンプレートあたり36のCFPS反応と15のテンプレートで、T7-tetOの組み合わせのセット全体で合計540の反応が行われました。全体の評価は、2つのプレートリーダーで2つのプレートで行った。このデータの分析により、T7 RNAPは、T7転写産物の開始から13 bp下流まで、T7駆動型発現を均等にダウンレギュレートすることが示されました(図3)。この結果は、他のリプレッサーによるT7の効果的な抑制のための推定ウィンドウを記述することにより、制御可能なT7駆動遺伝子回路の将来の設計に影響を及ぼします。ここで説明したプロトコルの結果と従来のクローニングによって調製されたDNAを比較すると、フォーマット間のTetR抑制の程度に小さいながらも統計的に有意な違いがあることが明らかになりました。我々は、TetRのベクターDNAへの非特異的結合が観察された違いを説明できると仮定した。実験結果は、線形テンプレートDNAとの反応に線形ベクターDNAを追加すると、非統計的有意性への差が減少することを示しましたが、線形フォーマットと円形フォーマットのDNAらせんの周期性の違いなど、TetR結合に影響を与える可能性のある他の要因からの寄与を排除しませんでした。アプリケーションによっては、リニアテンプレートの使用に追加の検証が必要になる場合があります。
さらに、音響液体処理を使用した正確な分注に関する潜在的な問題に関する代表的なデータを含めます(図4)。0.25 mMのタートラジン色素を含む1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4の溶液を使用して、容量>1 μLを分注するように音響液体ハンドラーをプログラミングする2つの方法を評価しました。液体分注後、宛先プレートを密閉し、1,500 x gで1分間遠心分離し、プレートリーダーで425 nmの吸光度を測定しました。9つの実験の代表的な結果が示され、5 μLの移送を別々の1 μL分注に分割した場合、一連の8つのデスティネーションウェル間でより一貫した分注が実証されています。これらの観察結果に基づいて、>1 μLのトランスファーを≤1 μLの複数のトランスファーに分解することが推奨されます。プロトコルのこの重要な側面のトラブルシューティングの詳細については、「 ディスカッション 」セクションを参照してください。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig01.jpg"> 図1:無細胞抽出物中のプロモーター部分を評価するための1日のワークフロー。 (A)レポーターは、評価対象の遺伝子部分を含むプライマーを使用してPCR増幅されます(2〜5時間)。(B)無細胞反応ミックスは、プロトコルに詳述されているように調製され、PCR増幅テンプレートとともに384ウェルプレートに分配されます(30分)。(C)アコースティックリキッドハンドリングは、リプレッサータンパク質、エフェクター分子、およびその他の条件付きエフェクター(10分)を含む追加のコンポーネントを分配するために使用されます。(D)各反応からのレポータータンパク質発現をプレートリーダーで測定する(CFPSレシピおよび構築物に応じて2〜16時間)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig02.jpg"> 図2:PCR増幅によりレポーター遺伝子に遺伝子部分を付加するためのプライマー設計 。 (A)sfGFPレポーター遺伝子(緑)を増幅し、PCRによりRBS(赤)とT7プロモーター(青)を追加します。(B)sfGFP(緑)とRBS(赤)を増幅し、 PCRによってtetO 配列(金)とT7プロモーター(青)を追加します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig03.jpg"> 図3:T7駆動発現の制御に対する tetO 位置の影響。 線形および円形テンプレートの最大抑圧値を tetO 位置の関数として正規化しました。トレースは、3回の反復の平均と標準偏差を表します。この図は、クリエイティブ・コモンズのCC-BYライセンスの下でMcManus et al.32 から修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig04.jpg"> 図4:タートラジン染料を使用して、音響液体ハンドラーで液体の分注を検証します。 黒いバーは、単一のプログラミングコマンドを使用して、単一のソースウェルから384ウェルプレートの8つの連続したデスティネーションウェルのそれぞれに5 μLのタートラジン溶液を分注することを示します。灰色のバーは、1つのプログラミングコマンドを使用して、1つのソースウェルから8つの連続するデスティネーションウェルのそれぞれに1 μLを分注し、このステップを4回繰り返して、各デスティネーションウェルに合計5 μLを分注することを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コンポーネント名</td>
			<td>1反応容量(μL)</td>
			<td>X反応数の110%に対する体積(μL)</td>
		</tr><tr><td>Q5 PCRプレミックス</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>水</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>テンプレート (1–3 ng/μL)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(固定の場合 1)フォワードプライマー (5 μM)</td>
			<td>0 または 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(固定の場合 1)リバースプライマー (5 μM)</td>
			<td>0 または 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>マスターミックス合計:</td>
			<td>30 または 40</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(変数1 の場合)フォワードプライマー (5 μM)</td>
			<td>0 または 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(変数1 の場合)リバースプライマー (5 μM)</td>
			<td>0 または 10</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>表1:PCR反応用試薬の調製のためのワークシート。 右端の列の値は、意図した反応数に応じてユーザーが入力できます。 1可変プライマーは、PCR反応で添加される特定の部分を含み、フォワードプライマー、リバースプライマー、またはその両方にすることができます。固定プライマーは一部を追加せず、フォワードプライマーまたはリバースプライマーにすることができますが、両方にすることはできません。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コンポーネント名</td>
			<td>1反応容量(μL)</td>
			<td>X反応数の110%に対する体積(μL)</td>
		</tr><tr><td>細胞エキス</td>
			<td>4.2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>サプリメントミックス</td>
			<td>3.3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ガムSタンパク質 (207 μM)</td>
			<td>0.15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>テンプレート DNA (20 nM)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>T7ポリメラーゼ (13 mg/mL)</td>
			<td>0.12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>水</td>
			<td>0.73 (この数値は異なる場合があります)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>マスターミックス合計:</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>リプレッサータンパク質:</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>表2:CFPS反応用試薬の調製のためのワークシート。 右端の列の値は、意図した反応数に応じてユーザーが入力できます。
補足表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/Table%20S1%20-%20cost%20estimates_REV%20EDITS.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

新しい遺伝子回路の設計には、十分に特徴付けられた遺伝的部分が必要です。ここでは、遺伝子部分を迅速に特性評価するための費用対効果の高いハイスループットの方法について説明します。私たちの方法は、無細胞溶解物、クローニングを回避するための線状DNA、およびスループットを向上させ、反応量を減らすための音響液体処理を組み合わせることにより、コストと時間を削減します。

無細胞システムによる遺伝子部分の迅速な特性評価

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

私たちの方法は、クローニングの代わりに無細胞発現システムとPCRを使用して遺伝子部分の迅速な特性評価を可能にします。この技術の主な利点は、細胞内で通常数日から数週間かかるものが、この方法を使用して数時間から数日で行うことができることである。私たちのプロトコルには、独自の無細胞発現システムを作成するための手順が含まれていますが、これは多くの場所でトリッキーであり、ユースケースによっては調整が必要になる場合があります。最初に始めるときは、市販のキットから始めることをお勧めします。原稿の指示に従ってPCRマスターミックスを準備し、氷上に保存することから始めます。30または40マイクロリットルのマスターミックスを決定された数のPCRチューブに分注し、適切に標識されたPCRチューブに各5マイクロモル可変プライマー10マイクロリットルを追加します。PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、テキスト原稿に記載されているようにPCRプログラムを実行します。次に、反応を摂氏4度に保持します。元のテンプレートが血漿DNAの場合は、1マイクロリットルのDpnI制限酵素を加えて元のテンプレートを消化し、摂氏37度で1時間インキュベートします。各PCR産物の5マイクロリットルを、1%アガロースゲルを使用して180ボルトで20分間分離して分析します。選択したコア シーケンスと追加されたパーツの長さによって異なる正しいバンド サイズを確認します。市販のPCR精製キットを使用してリニアテンプレートを精製します。ゲル電気泳動で複数のバンドが存在する場合は、製造元の指示に従って、ゲルから目的のバンドを切除し、市販のゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。分光光度計を使用して各DNAテンプレートを定量し、260〜280ナノメートルの比率が約1.8であることを確認して品質を評価します。原稿に記載されているように、すべての成分を氷上で解凍し、すべての成分をピペットで完全に混合してマスターミックスを準備します。特にアミノ酸混合物については、沈殿を避けるために細心の注意を払ってください。マスターミックスを氷の上に置いておきます。384ウェルプレートを氷上で冷却し、マスターミックスを9マイクロリットルのアリコートで各ウェルに分配します。リプレッサータンパク質を氷上で解凍し、音響液体処理ソースプレートに分配して、使用するソースプレートのタイプに必要な適切な量のデッドボリュームが含まれていることを確認します。リプレッサータンパク質を1マイクロリットルの容量で、リキッドハンドラーを介して適切な宛先ウェルに分配します。精製レポーターの段階希釈または適切な化学標準をプレートに含めて、結果を他の研究や他のラボと比較します。実験の予想される発現範囲で使用されるレポーターに適した濃度の範囲を選択してください。プレートリーダーを摂氏30度に予熱します。可能であれば、機器で摂氏1度の垂直温度勾配を設定して、シールの結露を制限します。プレートリーダーは、ステップを振ることなく、コアシーケンスで使用されるレポーターに適した設定で読み取るように設定します。蒸発を防ぐために、384ウェルプレートを不浸透性のプラスチックシールでシールします。384ウェルプレートをプレートホルダーに置き、読み取りを開始します。tetO配列に対するT7プロモーターの距離のみが変化する15個の線形テンプレートをPCRによって調製し、各プロモーター変異体を追加するように設計されたプライマーを用いて、スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質レポーターを増幅した。T7 tetO結合のセット全体について合計540の反応からのデータを分析したところ、T7 RNAポリメラーゼは、T7転写産物の開始から13塩基対下流まで、T7駆動発現を等しく下方制御することが示されました。音響液体ハンドラーを使用した一連の8つの宛先ウェル間でより一貫した分注が観察されたのは、5マイクロリットルの移送を別々の1マイクロリットルの分注に分割した場合でした。私たちのプロトコルは、新しいバイオセンサーのスクリーニングや遺伝子部品のライブラリの構築など、遺伝子成分を迅速にスクリーニングするために使用できます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

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Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

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OnePot PURE Cell-Free System

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This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...