Name: rapid characterization of genetic parts with cell-free systems
Uploaded: 2021-08-30T14:00:00
Duration: 5 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Dette arbeidet ble gjort mulig av Office of the Secretary of Defense's Applied Research for the Advancement of Science and Technology Priorities-programmet. Vi takker Scott Walper (Naval Research Laboratory) for å levere lageret av sfGFP som brukes, og Zachary Sun og Abel Chiao (Tierra Biosciences) for fruktbare diskusjoner knyttet til prototyping med cellefrie systemer og relatert feilsøking av akustisk væskehåndtering.

1. Fremstilling av celleekstrakt
<ol><li>Klargjøring av medier<ol><li>For 2xYT-medier: Tilsett 16 g trypton, 10 g gjærekstrakt og 5 g NaCl til 900 ml avionisert vann og juster pH til 7,0 med 5 M NaOH. Øk oppløsningsvolumet til 1 L ved bruk av avionisert vann og autoklav eller filtersteriliser. Alternativt kan du kjøpe 2xYT-medier.</li>
		<li>For S30B buffer: Forbered en løsning på 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat og 5 mM Tris i 2 liter avionisert vann. Bruk 2 M Tris for å justere pH til 8,2, autoklav og lagre ved 4 °C. Fullfør løsningen ved å tilsette dithiothreitol (DTT) til en endelig konsentrasjon på 1 mM like før bruk.</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse av celler<ol><li>Strek Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta2 celler eller annen cellelinje av valg (se Cole et al.44 for en nylig omfattende gjennomgang) på en LB (Lysogeny Broth) agar plate og inkubere ved 37 ° C i 10-14 timer.</li>
		<li>Bruk en enkelt E. coli-koloni til å inokulere 3 ml 2xYT medium i et 10 ml kulturrør. Inkuber dette røret ved 37 °C med risting ved 250 o / min i 8 timer.</li>
		<li>Bruk 50 μL fra 3 ml-kulturen for å inokulere 50 ml 2xYT-medium i en 500 ml kolbe. Inkuber denne kolben ved 37 °C med risting ved 250 o / min i 8 timer.</li>
		<li>Bruk 7,5 ml fra 50 ml kulturen til å inokulere hver av fire 4 L ledekolber inneholdende 0,75 l 2xYT medium. Inkuber disse kolbene ved 37 °C med risting ved 220 o / min til de har nådd en optisk tetthet ved 600 nm på 2 til 4, etter ca. 3-4 timer.</li>
		<li>Høst cellene fra hver kolbe ved å overføre dem til 1 l beholdere og sentrifugere ved 5000 x g i 12 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten ved å dekantere i en avfallsbeholder.</li>
		<li>Vask hver cellepellet med 150 ml iskald S30B-buffer ved å resuspendere dem fullstendig ved hjelp av en pipette for å forstyrre cellemassen, og samle deretter cellene igjen ved sentrifugering ved 5000 x g i 12 minutter. Kast supernatanten.</li>
		<li>Vask hver cellepellet igjen i 40 ml iskald S30B-buffer ved å resuspendere dem fullstendig og forstyrre cellemassen ved hjelp av en pipette. Overfør cellene til forhåndsveide 50 ml koniske rør og samle cellene igjen ved sentrifugering ved 2000 x g i 8 minutter ved 4 °C. Forkast supernatanten ved å dekantere.</li>
		<li>Vei våtcellepelletsene. Flash-frys cellepellets ved å plassere rørene direkte i flytende nitrogen og lagre ved -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellelyse<ol><li>Tine cellepellets på is.</li>
		<li>Resuspender hver cellepellet i 1,4 ml S30B buffer per 1 g av cellepelleten ved vortexing.</li>
		<li>Lyse cellene med fransk trykkcelle ved 640 psi ved 4 °C. Samle lysatet i mikrosentrifugerør på is og tilsett 3 μL 1 M DTT per 1 ml lysat umiddelbart etter lysis. MERK: Det er best å trykke på den franske pressemeldingsventilen med en liten metallstang for å opprettholde jevnt trykk og unngå plutselige trykkfall.</li>
		<li>Fjern lysatet ved sentrifugering ved 30 000 x g i 30 minutter ved 4 °C og kast pelleten etter å ha pipettert supernatanten til et nytt iskaldt mikrosentrifugerør, pass på at pelleten ikke forstyrres.</li>
		<li>Sentrifuger supernatanten en gang til ved 30 000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Pipetter den resulterende supernatanten inn i et iskaldt mikrosentrifugerør. Kast pelleten.</li>
		<li>Inkuber supernatanten i et vannbad på 37 °C i 1 time.</li>
		<li>Fjern supernatanten ved sentrifugering ved 15 000 x g i 15 minutter ved 4 °C og overfør den resulterende supernatanten til et iskaldt mikrosentrifugerør, pass på at pelleten ikke forstyrres.</li>
		<li>Sentrifuger supernatanten en gang til ved 15 000 x g i 15 minutter ved 4 °C og overfør den resulterende supernatanten til et iskaldt mikrosentrifugerør, og pass på at du ikke forstyrrer gjenværende pellet.</li>
		<li>Fordel supernatanten i 100 μl alikoter i 1,5 ml mikrosentrifugerør og flashfrys dem ved å plassere dem direkte i flytende nitrogen. Oppbevar supernatanten ved -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lineær malforberedelse
<ol><li>Primer design<ol><li>Velg en kjernesekvens som PCR-mal. Inkluder som et minimum en reportersekvens, for eksempel sfGFP (superfolder Green Fluorescent Protein), LacZ eller Spinat aptamer. Inkluder andre deler som skal festes på tvers av screenede varianter, for eksempel terminatorer, promotører eller RBS-er, etter hva som passer for designet. MERK: Inkludering av en terminator er ikke alltid nødvendig for ekspresjon fra lineært DNA i cellefrie systemer.</li>
		<li>For de fremre grunningene velger du minst 20 bp som samsvarer med 5'-enden av kjernesekvensen som 3ʹ-enden av primeren. Hvis du legger til deler i 5'-enden av konstruksjonen, designer du resten av 5'-enden av primeren for å legge til de genetiske delene av interesse for kjernesekvensen via PCR-amplifisering (figur 1A og figur 2). MERK: Siden primere over ~ 60 bp ofte øker dramatisk i pris, kan flere overlappende primere utformes for å legge til lengre sekvenser eller flere deler. Mens flere primere kan brukes i en enkelt PCR-reaksjon, anbefales det å utføre flere runder med PCR.</li>
		<li>For omvendt priming, velg minimum 20 bp for å matche 3'-enden av kjernesekvensen som 3'-enden av primeren. Hvis du legger til deler i 3'-enden av konstruksjonen, designer du resten av 5'-enden av primeren for å legge til de genetiske delene av interesse for kjernesekvensen via PCR-amplifikasjon (figur 1A og figur 2). Forsikre deg om at den omvendte primerens glødetemperatur er innenfor 5 °C fra glødetemperaturen til hele den fremre grunningen.</li>
	</ol></li>
	<li>Lineær malforsterkning<ol><li>Bestem antall PCR-reaksjoner som skal utføres basert på antall kjernesekvenser og beregne mengden av hver komponent som kreves ved hjelp av tabell 1.</li>
		<li>Forbered masterblandingen i henhold til tabell 1 og oppbevar den på is. Aliquot 30 eller 40 μL (se tabell 1) av masterblandingen til det bestemte antallet PCR-rør og tilsett 10 μL av hver variabel primer (dvs. primere som koder for en delendring, se tabell 1) ved 5 μM til passende merkede PCR-rør.</li>
		<li>Plasser PCR-rørene i termosyklisten og kjør følgende PCR-program: 98 °C i 3 minutter; 30 sykluser på 98 °C i 15 s, XX °C i 20 s, 72 °C i ÅÅ min; endelig forlengelse ved 72 °C i 10 min. Hold deretter reaksjonen ved 4 °C. Hvor, XX representerer glødetemperaturen for primeren med lavere glødetemperatur og YY representerer forlengelsestiden beregnet for amplikonens lengde basert på produsentens anbefalinger for den anvendte hi-fidelity-polymerasen. Optimaliser disse forholdene etter behov for forskjellige primere og/eller maler.</li>
		<li>(Valgfritt) Legg til 1 μL DpnI-restriksjonsenzym for å fordøye den opprinnelige malen. Inkuber reaksjonen ved 37 °C i 1 time. Utfør dette trinnet bare hvis den opprinnelige malen er plasmid-DNA.</li>
		<li>Analyser 5 μL av hvert PCR-produkt ved gelelektroforese. Separer produktet med en 1% agarosegel ved 180 V i 20 minutter. Se etter riktig båndstørrelse, som vil variere med den valgte kjernesekvensen og lengden på delene som legges til.</li>
	</ol></li>
	<li>Rens den lineære malen ved hjelp av et kommersielt PCR-rensesett eller ved hjelp av den foretrukne PCR-oppryddingsmetoden. Hvis flere bånd var tilstede ved gelelektroforeseanalyse, må du enten optimalisere PCR-forholdene eller rense de riktige molekylvektbåndene ved hjelp av et kommersielt gelekstraksjonssett i henhold til produsentens anbefaling.</li>
	<li>Kvantifiser hver DNA-mal ved hjelp av et spektrofotometer. Vurder DNA-malkvaliteten ved å kontrollere at forholdet mellom 260 nm / 280 nm er omtrent 1,8.</li>
	<li>(Valgfritt) Igjen separerer du en del av DNA-malen ved hjelp av en 1% agarosegel ved 180 V i 20 minutter og sørger for at eventuelle uønskede bånd ble fjernet under malrensing.</li>
	<li>Bruk rensede DNA-maler umiddelbart eller oppbevar ved -20 °C.</li>
</ol>3. Renset proteinpreparat
<ol><li>Protein uttrykk<ol><li>For hvert protein som skal uttrykkes, sett sammen en passende uttrykkskonstruksjon. Kodon-optimalisere genet for ekspresjon i E. coli. Sett genet inn i en pET-22b ekspresjonsvektor eller annen passende ekspresjonsvektor via den foretrukne plasmidmonteringsmetoden. Transformer uttrykksplasmidet til BL21(DE3) Rosetta2-ekspresjonsceller eller en annen passende cellelinje.</li>
		<li>For hvert protein, bruk en enkelt koloni for å inokulere 3 ml LB-medium i et 10 ml kulturrør. Inkuber disse rørene ved 37 °C med risting ved 250 o / min over natten.</li>
		<li>Inokuler en 2 l kolbe som inneholder 750 ml LB-medium med 1 ml av nattens kultur. Inkuber disse kolbene ved 37 °C med risting ved 250 o / min til de når en OD600 på 0,6-1,0.</li>
		<li>Indusere proteinuttrykk ved å tilsette 0,75 ml 1 M isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) i vann til hver kolbe og fortsette å inkubere disse kolbene ved 37 °C med risting ved 250 o / min i 4 timer.</li>
		<li>Høst cellene fra hver kolbe, ved hjelp av en 1 l sentrifugeflaske, ved sentrifugering ved 5000 x g i 12 minutter. Kast supernatanten.</li>
		<li>Overfør pellets til et 50 ml konisk rør og vei hver pellet. Blitzfrys cellene i flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C eller fortsett til trinn 3.2. MERK: 2-5 g celler per 0,75 ml forventes å være et resultat av dette trinnet.</li>
	</ol></li>
	<li>Proteinrensing ved nikkelaffinitetskolonnekromatografi<ol><li>Forbered lysisbufferen ved å kombinere 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl og 5 mM imidazol. Juster til pH 8,0.</li>
		<li>Forbered vaskebufferen ved å kombinere 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl og 25 mM imidazol. Juster til pH 8,0.</li>
		<li>Forbered elueringsbufferen ved å kombinere 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl og 250 mM imidazol. Juster til pH 8,0.</li>
		<li>Forbered dialysebufferen ved å kombinere 50 mM NaHPO4, 100 mM NaCl og 2% DMSO. Juster til pH 7,5.</li>
		<li>Tine cellepellets ved å plassere rørene i romtemperert vann. Tilsett 5 ml lysisbuffer per 1 g av cellepelleten og resuspender ved vortexing.</li>
		<li>Lyse cellene ved sonikering. Separer cellehomogenatet slik at det ikke er mer enn 30 ml per 50 ml konisk rør og hold hvert rør på is. Lyse cellene ved hjelp av en sonisk sonde med en sonde på 0,16 cm i diameter i 15 s runder med 30 s pauser, 10 ganger. MERK: Unngå skumdannelse, da dette denaturerer proteinet. Dannelsen av skum kan unngås ved å holde sonikatorspissen minst 2/3 nedsenket i lysatet mens den er i drift. Andre metoder for cellelyse i tillegg til sonikering er også mulig44.</li>
		<li>Fjern lysatet ved sentrifugering ved 15 000 x g i 30 minutter ved 4 °C og plasser supernatanten i et nytt 50 ml konisk rør.</li>
		<li>Tilsett 1 ml nikkel-nitrilotrieddiksyre (Ni-NTA) harpiks for hver 5 ml supernatant. Del cellelysatet/Ni-NTA-slammet slik at det ikke er mer enn 36 ml per 50 ml konisk rør. Inkuber ved 4 °C på en rørrotator ved 10 o / min i 1 time.</li>
		<li>Legg harpiksen ved å dekantere cellelysatet/Ni-NTA-oppslemmingen i en 2 ml sengevolumkromatografikolonne og samle eluanten om nødvendig for videre analyse, ellers kastes. Vask harpiksen med 10 harpikssengvolumer vaskebuffer.</li>
		<li>Samle proteinet ved å tilsette tre harpikssengvolumer av elueringsbuffer til kolonnen og konsentrere volumet til 1,5 ml ved hjelp av en sentrifugalkonsentrator med passende molekylvektsmembran for hvert protein.</li>
		<li>Dialyser proteinet mot 2 liter dialysebuffer ved 4 °C i 1 time. Dialyser proteinet igjen mot 2 l dialysebuffer over natten ved 4 °C.</li>
		<li>Kvantifiser proteinet ved hjelp av dets molare utryddelseskoeffisient og absorbans ved 280 nm. Analyser proteinet for renhet ved å separere det ved hjelp av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Oppbevar proteinet ved -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Cellefri proteinsyntese
<ol><li>Fremstilling av CFPS reaksjonsblanding<ol><li>Forbered tilskuddsblandingen ved å følge trinnene for fremstilling av aminosyreoppløsning, forberedelse av energiløsning og bufferforberedelse i Sun et al.42. Oppbevares separat eller kombinert ved -80 °C i alikoter. Sørg for at endelige konsentrasjoner samsvarer med de som er beskrevet i Sun et al.42 i avsnittet Experimental Execution of a TX-TL Reaction.</li>
		<li>Forbered et tilsetningsstoff for å beskytte lineært DNA mot nedbrytning. Hvis du bruker GamS33,45, må du forberede deg via trinnene i avsnitt 3 ovenfor, eller få fra en kommersiell leverandør; For andre tilnærminger, sjekk tilsvarende litteratur46,47,48. Alternativt kan du bruke et CFPS-system som ikke krever tilsetningsstoffer49.</li>
		<li>Klargjør T7-polymerase, repressorproteiner og andre tilsetningsstoffer ved hjelp av trinnene i avsnitt 3 ovenfor, eller få fra en kommersiell leverandør.</li>
		<li>Bestem antall CFPS-reaksjoner som skal utføres, og beregne mengden av hver komponent som kreves ved hjelp av tabell 2. Endre konsentrasjonene av komponentene, inkludert tilsetning eller fjerning av komponenter etter behov, og juster mengden vann slik at det endelige volumet av hver reaksjonsblanding alltid er 10 μL. På samme måte kan du modifisere masterblandingen for å lette dispensering av andre komponenter ved akustisk væskehåndtering etter ønske ( se diskusjonsdelen ).</li>
		<li>Tine alle komponentene på is og tilberede en masterblanding ved å blande hver komponent som beregnet ovenfor. Bland alle komponentene grundig med pipette. Vær nøye med å unngå nedbør, spesielt for aminosyreblandingen. Hold mastermiksen på is.</li>
		<li>Avkjøl en plate med 384 brønner på is og fordel masterblandingen i 9 μL alikoter i hver brønn. MERK: Det er mulig å distribuere disse komponentene ved akustisk væskehåndtering, men forsiktighet bør utvises for å sikre riktig dispensering ( se diskusjonsdelen for feilsøking).</li>
	</ol></li>
	<li>Distribusjon av tilleggskomponenter ved akustisk væskehåndtering<ol><li>Beregn mengden repressorprotein (og andre valgfrie komponenter) som kreves for alle CFPS-reaksjonene.</li>
		<li>Tine repressorproteinet på is og distribuer det til en akustisk væskehåndteringskildeplate eller annen passende plate. Forsikre deg om at riktig mengde dødvolum som kreves for typen kildeplate som brukes, er inkludert.</li>
		<li>Fordel repressorproteinet i 1 μL volum i passende brønner via væskehåndtereren. Hvis du vil ha mer informasjon om feilsøking av distribusjon, kan du se Diskusjon-delen .</li>
	</ol></li>
	<li>Standard kurver<ol><li>Inkluder en seriell fortynning av den rensede reporteren (se avsnitt 3 for proteinrensing)41 eller passende kjemisk standard50 på platen for å muliggjøre sammenligning av resultater med andre studier og andre laboratorier. Velg et konsentrasjonsområde som passer for reporteren som brukes, og det forventede uttrykksområdet for eksperimentene.</li>
	</ol></li>
	<li>Kjører CFPS-reaksjoner<ol><li>Forvarm tallerkenleseren til 30 °C. Still inn plateleseren til å lese ved innstillinger som passer for reporteren som brukes i kjernesekvensen, uten å riste trinnene. MERK: Mens 30 °C brukes her, er 29 °C og 37 °C også ofte brukt og fungerer godt med denne protokollen. Andre temperaturer kan foretrekkes for alternative cellefrie reaksjonspreparater. For leseintervaller er 10 min tilstrekkelig for å oppnå en god oppløsning for de representative dataene som presenteres her; Imidlertid kan andre oppløsninger være bedre, avhengig av reporterproteinet og den spesielle CFPS-oppskriften.</li>
		<li>(Valgfritt) Kjør en testreaksjon først for å angi riktig forsterknings- eller følsomhetsinnstilling for å fange opp endringen i fluorescens uten signaloverløp.</li>
		<li>Forsegl platen med 384 brønner med et ugjennomtrengelig plastforseglingslokk for å forhindre fordampning. Hvis mulig, still om mulig en vertikal temperaturgradient på 1 °C for å begrense kondens på tetningen. Plasser platen med 384 brønner på plateholderen og begynn å lese.</li>
	</ol></li>
</ol>

RMM har en finansiell eierandel i Tierra Biosciences, et privat selskap som benytter seg av cellefrie teknologier som de som er beskrevet i denne artikkelen for proteinuttrykk og screening.
De andre forfatterne har ingenting å avsløre.

Protokollene beskrevet her gir en kostnadseffektiv og rask måte å screene genetiske deler via ekspresjon av et reporterprotein av CFPS. Velkarakteriserte genetiske deler er avgjørende for utformingen av forutsigbare genetiske kretser med nyttig funksjon. Denne metoden øker gjennomstrømningen og reduserer tiden som trengs for å skjerme nye genetiske deler ved å fjerne kravet om å arbeide i levende celler, samtidig som den beholder funksjonalitet som speiler det cellulære miljøet ved å beholde den metabolske prosessen med proteinuttrykk i cellelysatet. Vår protokoll kan utføres på 1 dag etter mottak av primere (~ 2,5-6 timer for reaksjonsforberedelse, 2-16 timer for CFPS-reaksjon; Figur 1), sammenlignet med minst 3 dager for tradisjonell kloning (1 dag hver for konstruksjonsmontering og transformasjon, sekvensverifisering av kloner og dyrking av celler for vurdering). Vi anslår videre at kostnaden per konstruksjon ved bruk av lineært DNA er omtrent en tredjedel av den tradisjonelle kloningen ($ 78 vs. $ 237; Tilleggstabell 1) Metoder. Kommersielle syntesetjenester siterer for tiden minst 4 virkedager, avhengig av størrelse, selv om de vil ha lignende kostnader som vår metode hvis lineære fragmenter screenes direkte i CFPS ($ 78 vs $ 91); Vi har ikke bekreftet denne tilnærmingen. Kostnaden for å evaluere en del med CFPS er liten sammenlignet med genereringen av mal-DNA ($ 0.05 / reaksjon22 vs. $ 78 per mal), selv om det bør bemerkes at oppstartskostnadene for bulkreagenser og lysisutstyr er minst flere tusen dollar. Bruken av en akustisk væskebehandler forbedrer bare kostnadene marginalt ved å muliggjøre mindre volumer ned til 0,5 μL40; Den mer signifikante fordelen er reduksjonen av tiden for å forberede reaksjoner (~ 10 min vs. opptil 1 time, avhengig av antall reaksjoner), spesielt når du forbereder et stort antall reaksjoner, reiser bekymringer for forberedt reaksjon som sitter i lengre tid før inkubasjon.
Selv om det er raskt og kostnadseffektivt, gjenstår det å se begrensningene for når CFPS-prototyping tilstrekkelig forutsier in vivo-funksjon . For eksempel vil ingen kryssreaktivitet med genomisk DNA bli oppdaget på grunn av fjerning av vertsgenomet under produksjonen av CFPS-systemet. Komponentkonsentrasjoner kan også være 1-2 størrelsesordener lavere i CFPS enn i celle51, noe som sannsynligvis vil påvirke oppførselen til enkelte deler som følge av forskjellige makromolekylære trengningsforhold. Videre kan lineært DNAs evne til å forutsi in vivo-funksjon være begrenset, for eksempel når DNA-sekundærstruktur spiller en viktig rolle. En siste begrensning er at konstruksjoner ikke er sekvensverifisert før testing for funksjoner. Det kan være tilfeller der den karakteriserte delen faktisk ikke er i tråd med den tiltenkte teoretiske sekvensen. Alle disse begrensningene kan reduseres ved å validere et delsett av delene som er screenet med denne metoden i den tiltenkte in vivo-applikasjonen .
Vi utviklet opprinnelig denne metodikken for å undersøke effekten av å endre operatørposisjonen på hybride T7-tetO-promotorer 32. Vi har presentert protokollene her i et mer generisk format, slik at de kan brukes på promotorer, operatører, ribosombindingssekvenser, isolatorer og terminatorer. Disse genetiske delene kan legges til 5'eller 3ʹ-enden av reportergenet ved PCR ved hjelp av primere for hvert design, og unngår behovet for syntese eller kloning av hver variant for å teste. De resulterende PCR-produktene fungerer som mal-DNA for evaluering via ekspresjonen av et reporterprotein. I vårt arbeid ble affinitetsrensingsprotokollen gitt her brukt for TetR og GamS. Den samme prosedyren kan brukes til ekspresjon og rensing av andre repressorer, aktivatorer, polymeraser, sigmafaktorer og andre proteiner som er kognitive til en genetisk del av interesse, selv om modifikasjoner kan være nødvendig for det ønskede proteinet som uttrykkes. Rensing og titrering av disse proteinene i CFPS-reaksjoner muliggjør en mer detaljert karakterisering av en bestemt genetisk del. Endelig finnes det mange alternative CFPS-protokoller, og hver bør være mottagelig for delscreeningsdelen av metodikken. Som et eksempel inkluderer vi ikke et dialysetrinn i denne protokollen, som andre har funnet å være viktig for uttrykk fra innfødte bakterielle promotorer22. Det er også mulig å variere konsentrasjonene av underliggende bestanddeler i CFPS. Bruken av væskehåndtering forbedrer evnen til å teste de utallige forholdene ved å øke gjennomstrømningen og redusere materialene som kreves34,35.
Et område som kan kreve betydelig feilsøking er optimalisering av den akustiske væskebehandleren. Dispensering av akustisk væskehåndtering bør optimaliseres for hver komponent som overføres, og det anbefales på det sterkeste å kjøre kontroller for å verifisere riktig distribusjon og reproduserbarhet før data samles inn. Den ideelle innstillingen for kildeplatetype og væskeklasse vil avhenge av den spesifikke væsken som skal dispenseres og dens komponenter. Det anbefales ikke å bruke aminbelagte plater for å dispensere DNA, da aminbelegget kan interagere med DNA. Det skal også bemerkes at evnen til å dispensere høyere konsentrasjoner av visse komponenter kan avhenge av den akustiske væskehåndteringsmodellen. En test væskeoverføring kan utføres ved å dispensere på en folieplateforsegling for å visualisere vellykket dråpedannelse; Denne testen gir imidlertid begrenset informasjon, og slippverktøy fra forskjellige innstillinger kan virke identiske. Bruk av et vannløselig fargestoff, slik som tartrazin, kan brukes til å mer nøyaktig verifisere at riktig volum dispenseres med en gitt innstilling eller arbeidsflyt (se Representative resultater). Optimal programmering av væskeoverføringer kan også påvirke nøyaktigheten og konsistensen av data som genereres; For overføringer >1 μL fra en kildebrønn til en destinasjonsbrønn har vi funnet at sekvensielle overføringer på ≤1 μL bør programmeres for å redusere systematisk variasjon fra brønn til brønn (figur 4). Til slutt kan teoretiske og faktiske kildebrønndøde volumer variere dramatisk avhengig av kildeplatetype, væskeklasseinnstilling og komponenter i den spesifikke væsken; Bruk av undersøkelsesfunksjonen for akustisk væskehåndtering for å vurdere brønnvolumene før et program kjøres, kan bidra til å måle hvor nøyaktig instrumentet er i stand til å måle en bestemt væske.
CFPS-reaksjonsytelsen kan variere når man sammenligner resultater mellom forskjellige brukere, partier av materialer, platelesere og laboratorier41. For tilfeller der slike sammenligninger kreves under prototyping av genetiske kretser, anbefaler vi å inkludere interne kontrollreaksjoner med standard konstitutive promotorer i hver reaksjonsplate for å bidra til å normalisere resultatene på tvers av eksperimentelle oppsett. Metoden for DNA-forberedelse kan også bidra vesentlig til CFPS-aktivitet; Inkludering av et etanolutfellingstrinn anbefales. I tillegg kan den optimale reaksjonssammensetningen variere ved batchen av ekstrakt34. Spesielt optimale magnesiumglutamat- og kaliumglutamatkonsentrasjoner har vist seg å variere etter batch42 eller med promotor- eller reporterproteinet som brukes24. Konsentrasjoner av disse komponentene bør optimaliseres ved screening over flere konsentrasjoner av hver komponent per genetisk konstruksjon og per celleekstraktpreparat for å bestemme de optimale forholdene for proteinuttrykk. Til slutt inkluderer beste praksis for konsistent CFPS-reaksjonsytelse grundig blanding, forsiktig pipettering og konsistens i fremstillingen av hver reagenskomponent.
Utover karakterisering av individuelle deler, kan samme metode brukes til å skjerme kombinasjoner av deler som danner komplekse kretser, for eksempel logiske kretser16 eller oscillatorer52,53. Denne metoden kan også brukes til screening og optimalisering av biosensorer for applikasjoner i epidemiologisk diagnostikk 54,55,56,57 eller faredeteksjon og kvantifisering 3,58,59. Anvendelsen av AI-drevne teknikker som aktiv læring34 kan også kobles sammen med den høye gjennomstrømningen til denne metoden for å drive rask utforskning av komplekse biologiske designrom. Til syvende og sist ser vi for oss at denne tilnærmingen støtter akselererte utviklingstider for nye genetiske design innen syntetisk biologi.

En kjerneinnsats innen syntetisk biologi er å utvikle genetiske verktøysett som inneholder godt karakteriserte deler, som kan brukes til å konstruere genetiske kretser1 som utfører nyttige funksjoner når de brukes i mikrober eller cellefrie lysater. Områder der slike genetiske kretser har fått trekkraft er sensing 2,3,4, menneskelig ytelse 5,6, biodrivstoff7,8, materialproduksjon 9,10 og cellulær databehandling 11. Registre over standardiserte genetiske deler er etablert12 for å katalogisere nye og eksisterende deler i kategorier som promotorer, operatører, kodesekvenser og terminatorer, for å nevne noen få. Innsats som iGEM (international Genetically Engineered Machines) konkurranse13 har vært medvirkende til å karakterisere og katalogisere disse genetiske delene. Mange metoder er utviklet for å lette rask montering av disse delene i nyttige genetiske kretser14,15. Programvare er til og med utviklet for å automatisere sammensetningen av godt karakteriserte deler i kretser som oppnår en ønsket funksjon16. Samlingen av nyttige genetiske kretser med forutsigbare funksjoner hviler imidlertid på antagelsen om at de genetiske verktøysettene inneholder velkarakteriserte genetiske deler. På grunn av nødvendigheten av disse verktøysettene for å fremme syntetisk biologi, har mange anstrengelser for å bedre katalogisere kretser og deler med passende karakteriseringsdata blitt beskrevet 17,18,19,20,21.
En tilnærming til karakterisering av genetiske komponenter gjør bruk av cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS), som rekonstituerer cellulære funksjoner som transkripsjon og oversettelse ex vivo22. Flere studier har vist potensialet til CFPS for prototyping av genetiske komponenter 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 enten for direkte applikasjoner i cellefrie systemer eller for å forutsi funksjonen til genetiske konstruksjoner i celler, for eksempel den relative aktiviteten til deler i et bibliotek 29 , optimalisering av metabolsk vei27 og cellulær byrde30. Fordeler med prototyping i CFPS versus celler fremhevet av disse studiene inkluderer å unngå tidkrevende kloning, presis kontroll over konsentrasjonen av DNA og andre reaksjonskomponenter, og muligheten til enkelt å blande og matche flere DNA-konstruksjoner. Fordelen med å unngå kloning er spesielt tydelig når man bruker lineære DNA-maler, som gjør det mulig å sette sammen nye konstruksjoner ved in vitro-metoder som tar timer i stedet for dag33. Evnen til å manipulere konsentrasjonen av DNA-konstruksjoner og andre komponenter ganske enkelt ved pipettering gjør tilnærmingen enda mer attraktiv ved å muliggjøre eksperimentering med høy gjennomstrømning drevet av væskehåndteringsroboter34,35. Mens suksesser som bruker CFPS for prototyping har blitt rapportert, er det viktig å merke seg at det gjenstår å se under hvilke sammenhenger CFPS-resultater pålitelig kan forutsi funksjonalitet i celler.
Her presenterer vi en metode for CFPS-prototyping som understreker fordelene i hastighet, gjennomstrømning og kostnad sammenlignet med tradisjonelle cellebaserte tilnærminger. Tilnærmingen er hentet fra vårt tidligere arbeid der vi brukte CFPS til raskt å karakterisere et bibliotek med T7-promotorvarianter regulert av transkripsjonsfaktoren TetR32, og utvidet betydelig på den lille håndfull regulerte T7-promotorvarianter som var tilgjengelige i litteraturen på den tiden36,37. Andre har siden den gang ytterligere utvidet utvalget av slike promotører38. I vår metode akselereres genetisk konstruksjonsmontering ved å bruke PCR for å amplifisere mal-DNA via primere som legger til variantgenetiske deler til et reportergen. Akustisk væskehåndtering i 384-brønnsplater brukes til å øke gjennomstrømningen og redusere volumet av materialer som kreves. Tidligere arbeid har vist vellykket bruk av akustisk væskehåndtering ved betydelig lavere volumer39,40 med variabilitet sammenlignbar med manuell pipettering av større volumer41. I tillegg til metoden gir vi feilsøkingsinformasjon og en vurdering av potensielle kostnads- og tidsbesparelser. Merk at mens vi inkluderer en protokoll for produksjon av cellefrie lysater basert på Sun et al.42 her, bør mange andre kommersielle sett og protokoller43,44 også fungere. På samme måte, mens vi demonstrerer metoden for karakterisering av promotorvarianter32, kan andre deler byttes ut ved PCR-amplifikasjon, for eksempel riboregulatorer, ribosombindingssteder (RBS), isolatorer, proteinkoder og terminatorer. Vi håper at denne metoden kan hjelpe det syntetiske biologisamfunnet til å fortsette å øke antall karakteriserte deler for montering av forutsigbare genetiske kretser med nyttig funksjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x YT medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2377-250G</td>
			<td>Alternative to making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td>For plating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (5 cm diameter)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>731-1550</td>
			<td>Used for protein purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destination plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc plate</td>
			<td>142761</td>
			<td>For CFPS reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L</td>
			<td>For digestion of plasmid templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>20871723</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) Rosetta2</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70954</td>
			<td>Cell line used for production of lysate and purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>525</td>
			<td>Acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell</td>
			<td>Thermo Spectronic</td>
			<td>FA-078</td>
			<td>For lysing cells for CFPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impermeable plastic sealable lid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>232702</td>
			<td>Plate seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>RPI</td>
			<td>I56000-25.0</td>
			<td>Used for protein induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g1501-500G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo source plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>PL-05525</td>
			<td>For use with Echo acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td>For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>For production of purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR H2O</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>H10</td>
			<td>Plate reader used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494S</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28606</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSonica Ultrasonic Processor</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q700</td>
			<td>Cell disruption during protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>Updated supplier from Sun et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T7293</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid characterization of genetic parts with cell-free systems

Karakterisering og katalogisering av genetiske deler er avgjørende for utformingen av nyttige genetiske kretser. Å ha godt karakteriserte deler muliggjør finjustering av genetiske kretser, slik at deres funksjon resulterer i forutsigbare utfall. Med veksten av syntetisk biologi som et felt, har det vært en eksplosjon av genetiske kretser som har blitt implementert i mikrober for å utføre funksjoner knyttet til sensing, metabolsk endring og cellulær databehandling. Her viser vi en rask og kostnadseffektiv metode for karakterisering av genetiske deler. Vår metode benytter cellefritt lysat, fremstilt internt som et medium for å evaluere deler via ekspresjonen av et reporterprotein. Mal-DNA fremstilles ved PCR-amplifisering ved hjelp av billige primere for å legge til variantdeler i reportergenet, og malen legges til reaksjonen som lineært DNA uten kloning. Deler som kan legges til på denne måten inkluderer promotorer, operatører, ribosombindingssteder, isolatorer og terminatorer. Denne tilnærmingen, kombinert med inkorporering av en akustisk væskebehandler og 384-brønnplater, tillater brukeren å utføre evalueringer med høy gjennomstrømning av genetiske deler på en enkelt dag. Til sammenligning krever cellebaserte screeningtilnærminger tidkrevende kloning og har lengre testtider på grunn av nattkultur og normaliseringstrinn for kulturtetthet. Videre tillater arbeid i cellefritt lysat brukeren å nøyaktig strammere kontroll over ekspresjonsbetingelsene gjennom tilsetning av eksogene komponenter og DNA ved presise konsentrasjoner. Resultater oppnådd fra cellefri screening kan brukes direkte i applikasjoner av cellefrie systemer eller, i noen tilfeller, som en måte å forutsi funksjon i hele celler.

For å demonstrere nytten av våre metoder, presenterer vi resultater som beskriver effekten av nærhet av tetO-sekvensen til T7-promotoren på reguleringen av T7 RNAP-drevet uttrykk. De fullstendige resultatene og deres implikasjoner finnes i arbeidet til McManus et al.32. Arbeidsflyten er beskrevet i figur 1. Femten lineære maler, som bare varierte i avstanden til T7-promotoren i forhold til tetO-sekvensen, ble utarbeidet ved PCR-amplififisering av sfGFP-reporteren med primere designet for å legge til hver promotorvariant (figur 2) som beskrevet i avsnitt 2 i protokollen. CFPS-reaksjonskomponenter og reaksjoner ble utarbeidet etter protokollen. Ekspresjonen av sfGFP ble målt fra hver mal med en titrering på 12 forskjellige konsentrasjoner av TetR-proteinet, i triplikat, ved hjelp av en akustisk væskehåndterer. Ved 36 CFPS-reaksjoner per mal og 15 maler ble det utført totalt 540 reaksjoner for hele settet med T7-tetO-kombinasjoner. Hele evalueringen ble utført på to plater i to platelesere. Analyse av disse dataene viste at T7 RNAP nedregulerer T7-drevet uttrykk likt opp gjennom 13 bp nedstrøms fra starten av T7-transkriptet (figur 3). Dette resultatet har implikasjoner for fremtidig utforming av regulerbare T7-drevne genkretser ved å beskrive et antatt vindu for en effektiv undertrykkelse av T7 av andre repressorer. Sammenligning av resultater fra protokollen beskrevet her med DNA fremstilt ved tradisjonell kloning viste en liten, men statistisk signifikant forskjell i graden av TetR-undertrykkelse mellom formater. Vi antydet at ikke-spesifikk binding av TetR til vektor-DNA kunne forklare den observerte forskjellen. Eksperimentelle resultater viste at tilsetning av lineært vektor-DNA til reaksjoner med lineært mal-DNA reduserte forskjellen til ikke-statistisk signifikans, selv om det ikke utelukket bidrag fra andre faktorer, for eksempel forskjeller i periodicitet av DNA-helixen for lineære vs. sirkulære formater, som igjen kan påvirke TetR-binding. Avhengig av applikasjonen kan bruk av lineær mal kreve ytterligere validering.
Videre inkluderer vi representative data om potensielle problemer med nøyaktig dispensering ved bruk av akustisk væskehåndtering (figur 4). En løsning av 1x fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4 inneholdende 0,25 mM tartrazinfargestoff ble brukt til å evaluere to metoder for å programmere en akustisk væskebehandler for å dispensere volumer >1 μL. Etter væskedispensering ble destinasjonsplaten forseglet og sentrifugert ved 1 500 x g i 1 min, og absorbansen ved 425 nm målt med en plateleser. Representative resultater fra ni eksperimenter er vist og viser mer konsistent dispensering over serien av åtte destinasjonsbrønner når overføringen på 5 μL er delt inn i separate 1 μL-dispenser. Basert på disse observasjonene anbefales det at overføringer >1 μL brytes ned i flere overføringer på ≤1 μL. Se delen Diskusjon hvis du vil ha mer informasjon om feilsøking av dette viktige aspektet ved protokollen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig01.jpg"> Figur 1: Endags arbeidsflyt for evaluering av promotordeler i cellefritt ekstrakt. (A) En reporter PCR-amplifiseres ved hjelp av primere som inneholder genetiske deler som skal evalueres (2-5 timer). (B) Den cellefrie reaksjonsblandingen fremstilles som beskrevet i protokollen og fordeles i en 384-brønnplate med PCR-forsterkede maler (30 min). (C) Akustisk væskehåndtering brukes til å distribuere ytterligere komponenter, som kan inkludere repressorproteiner, effektormolekyler og andre betingede effektorer (10 min). (D) Reporterproteinuttrykk fra hver reaksjon måles i en plateleser (2-16 timer, avhengig av CFPS-oppskriften og konstruksjonen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig02.jpg"> Figur 2: Primerdesign for tilsetning av genetiske deler til et reportergen ved PCR-amplifikasjon . (A) SfGFP-reportergenet (grønt) vil bli forsterket for å legge til en RBS (rød) og en T7-promotor (blå) ved PCR. (B) sfGFP (grønn) og en RBS (rød) vil bli forsterket for å legge til en tetO-sekvens (gull) og en T7-promotor (blå) ved PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig03.jpg"> Figur 3: Effekten av tetO-posisjon på reguleringen av et T7-drevet uttrykk. Normaliserte maksimale undertrykkelsesverdier for lineær og sirkulær mal som en funksjon av tetO-posisjon . Spor representerer gjennomsnittet og standardavvikene for tre replikater. Denne figuren er modifisert fra McManus et al.32 under en Creative Commons CC-BY-lisens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig04.jpg"> Figur 4: Bruk av tartrazinfargestoff for å validere væskedispensering med en akustisk væskehåndterer. Svarte søyler indikerer dispensering av 5 μL tartrazinoppløsning fra en enkelt kilde godt inn i hver av de åtte påfølgende destinasjonsbrønnene i en 384-brønnplate ved hjelp av en enkelt programmeringskommando. Grå søyler indikerer dispensering av 1 μL fra en enkelt kilde godt inn i hver av de åtte påfølgende destinasjonsbrønnene ved hjelp av en enkelt programmeringskommando, og deretter gjentas dette trinnet fire ganger for totalt 5 μL dispensert i hver destinasjonsbrønn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Navn på komponent</td>
			<td>Volum for 1 reaksjon (μL)</td>
			<td>Volum for 110 % av X antall reaksjoner (μL)</td>
		</tr><tr><td>Q5 PCR Premix</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vann</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Mal (1–3 ng/μL)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(hvis fast1) Forward Primer (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(hvis fast1) Omvendt grunning (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Master Mix Totalt:</td>
			<td>30 eller 40</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(hvis variabel1) Forward Primer (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(hvis variabel1) Omvendt grunning (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Regneark for fremstilling av reagenser for PCR-reaksjoner. Verdier i kolonnen lengst til høyre kan fylles ut av brukere avhengig av det tiltenkte antallet reaksjoner. 1 Variable primere inneholder en spesifikk del som skal tilsettes i PCR-reaksjonen og kan være fremoverprimeren, omvendt primer eller begge deler. Faste primere legger ikke til en del og kan være fremoverprimer eller omvendt primer, men ikke begge deler.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Navn på komponent</td>
			<td>Volum for 1 reaksjon (μL)</td>
			<td>Volum for 110 % av X antall reaksjoner (μL)</td>
		</tr><tr><td>Cell ekstrakt</td>
			<td>4.2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Supplement Mix</td>
			<td>3.3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GamS-protein (207 μM)</td>
			<td>0.15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Mal DNA (20 nM)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>T7-polymerase (13 mg/ml)</td>
			<td>0.12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vann</td>
			<td>0,73 (dette tallet kan variere)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Master Mix Totalt:</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Repressor Protein:</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Regneark for fremstilling av reagenser for CFPS-reaksjoner. Verdier i kolonnen lengst til høyre kan fylles ut av brukere avhengig av det tiltenkte antallet reaksjoner.
Supplerende tabell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/Table%20S1%20-%20cost%20estimates_REV%20EDITS.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Velkarakteriserte genetiske deler er nødvendige for utformingen av nye genetiske kretser. Her beskriver vi en kostnadseffektiv metode med høy gjennomstrømning for rask karakterisering av genetiske deler. Vår metode reduserer kostnader og tid ved å kombinere cellefrie lysater, lineært DNA for å unngå kloning og akustisk væskehåndtering for å øke gjennomstrømningen og redusere reaksjonsvolumet.

Rask karakterisering av genetiske deler med cellefrie systemer

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

Vår metode muliggjør rask karakterisering av genetiske deler ved hjelp av cellefrie ekspresjonssystemer og PCR i stedet for kloning. Den største fordelen med denne teknikken er at det som vanligvis tar dager til uker i celler, kan gjøres i timer til dager ved hjelp av denne metoden. Protokollen vår inneholder trinn for å lage dine egne cellefrie uttrykkssystemer, noe som kan være vanskelig flere steder og kan kreve justeringer avhengig av brukstilfelle.Når du først starter, anbefaler vi at du starter med kommersielle sett. Begynn med å forberede PCR-masterblandingen i henhold til instruksjonene i manuskriptet og oppbevar den på is. Aliquot 30 eller 40 mikroliter av masterblandingen i det bestemte antall PCR-rør og tilsett 10 mikroliter av hver fem mikromolære variable primere til passende merkede PCR-rør.Plasser PCR-rørene i termosykleren og kjør PCR-programmet som nevnt i tekstmanuskriptet. Hold deretter reaksjonene ved fire grader Celsius. Hvis den opprinnelige malen er plasma-DNA, tilsett en mikroliter DpnI-restriksjonsenzym for å fordøye den opprinnelige malen og inkubere reaksjonene ved 37 grader Celsius i en time.Analyser fem mikroliter av hvert PCR-produkt ved å skille dem ved hjelp av en 1% agarosegel ved 180 volt i 20 minutter. Se etter riktig båndstørrelse, som vil variere med den valgte kjernesekvensen og lengden på delene som legges til. Rens de lineære malene ved hjelp av et kommersielt PCR-rensesett.Hvis flere bånd var tilstede ved gelelektroforese, skjær båndene av interesse fra gelen og rens DNA ved hjelp av et kommersielt gelekstraksjonssett, i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantifiser hver DNA-mal ved hjelp av et spektrofotometer, og vurder kvaliteten ved å kontrollere at forholdet 260 til 280 nanometer er omtrent 1,8. Tine alle komponentene på is og tilberede en masterblanding ved å blande alle komponentene grundig med en pipette, som nevnt i manuskriptet.Vær nøye med å unngå nedbør, spesielt for aminosyreblandingen. Hold mastermiksen på is. Avkjøl en plate med 384 brønner på is og fordel masterblandingen i ni mikroliters alikoter i hver brønn.Tine represserproteinet på is og distribuer det til en akustisk væskehåndteringskildeplate, og sørg for at riktig mengde dødvolum som kreves for typen kildeplate som brukes, er inkludert. Fordel represserproteinet i volum på én mikroliter til passende destinasjonsbrønner via væskehåndtereren. Inkluder en seriell fortynning av den rensede reporteren eller en passende kjemisk standard på platen for å sammenligne resultater med andre studier og andre laboratorier.Velg et konsentrasjonsområde som passer for reporteren som brukes i det forventede uttrykksområdet for eksperimentene. Forvarm tallerkenleseren til 30 grader Celsius. Hvis mulig, sett en vertikal temperaturgradient på instrumentet for å begrense kondens på tetningen.Still inn plateleseren til å lese med innstillinger som passer for reporteren som brukes i kjernesekvensen, uten å riste trinnene. Forsegl platen med 384 brønner med en ugjennomtrengelig plastforsegling for å forhindre fordampning. Plasser platen med 384 brønner på plateholderen og begynn å lese.15 lineære maler, som bare varierte i avstanden til T7-promotoren i forhold til tetO-sekvensen, ble utarbeidet ved PCR, og forsterket supermappen grønn fluorescerende proteinreporter, med primere designet for å legge til hver promotorvariant. Analyse av data fra totalt 540 reaksjoner for hele settet av T7 tetO-kombinasjoner viste at T7 RNA-polymerasen nedregulerer T7-drevet uttrykk likt, opp gjennom 13 basepar nedstrøms fra starten av T7-transkriptet. Mer konsistent dispensering over serien av åtte destinasjonsbrønner ved hjelp av den akustiske væskebehandleren ble observert når en overføring på fem mikroliter ble delt inn i separate en-mikroliters dispensere.Vår protokoll kan brukes til å raskt screene genetiske komponenter, enten for screening av nye biosensorer eller bygging av genetiske deler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Høy effektivitet, stedsspesifikk Transfeksjon av tilhenger Celler med siRNA Bruke microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Gransker Receptor-ligandsysternene med Cellulosome med AFM-baserte Single-molekyl kraft spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering av Complex Systems Bruke Design of Experiments Approach: Forbigående Protein Expression i tobakk som et Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Lukkbar Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Subtraktiv Mønstring av levende cellelag med en mikrofluid Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese av smittsomme Bacteriophages i en E. coli -basert Cell-free uttrykk System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Deteksjon av Endotoxin i Nano-formuleringer bruker Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En flerlags Mikrovæskebasert plattform for gjennomføring av langvarig Cell-gratis Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

OnePot PURE Cell-Free System

OnePot PURE cellefritt system

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Raske, enzymatiske metoder for forsterkning av minimale, lineære maler for proteinprototyping ved hjelp av cellefrie systemer

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...