Name: rapid characterization of genetic parts with cell-free systems
Uploaded: 2021-08-30T14:00:00
Duration: 5 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Эта работа стала возможной благодаря программе прикладных исследований Управления министра обороны по продвижению приоритетов в области науки и техники. Мы благодарим Скотта Уолпера (Военно-морская исследовательская лаборатория) за предоставление запасов использованного sfGFP, а также Закари Сана и Абеля Чиао (Tierra Biosciences) за плодотворные дискуссии, связанные с прототипированием бесклеточных систем и связанными с этим устранением неполадок при обработке акустических жидкостей.

RMM имеет финансовую долю в Tierra Biosciences, частной компании, которая использует бесклеточные технологии, такие как описанные в этой статье, для экспрессии белка и скрининга.
Другим авторам нечего раскрывать.

Протоколы, описанные здесь, обеспечивают экономически эффективные и быстрые средства для скрининга генетических частей посредством экспрессии репортерного белка CFPS. Хорошо охарактеризованные генетические части имеют решающее значение для разработки предсказуемых генетических схем с полезной функцией. Эта методология увеличивает пропускную способность и уменьшает время, необходимое для скрининга новых генетических частей, устраняя необходимость работы в живых клетках, сохраняя при этом функциональность, которая отражает клеточную среду, сохраняя метаболический процесс экспрессии белка в клеточном лизате. Наш протокол может быть выполнен через 1 день после приема праймеров (~2,5-6 ч для приготовления реакции, 2-16 ч для реакции CFPS; Рисунок 1), по сравнению с по меньшей мере 3 днями для традиционного клонирования (по 1 дню для сборки и преобразования конструкций, проверки последовательности клонов и культивирования клеток для оценки). Мы также оцениваем, что стоимость одной конструкции с использованием линейной ДНК составляет примерно одну треть традиционного клонирования (78 долларов США против 237 долларов США; Дополнительная таблица 1) методика. Коммерческие услуги синтеза в настоящее время котируют минимум 4 рабочих дня в зависимости от размера, хотя они будут иметь аналогичные затраты, чем наш метод, если линейные фрагменты будут отсеиваться непосредственно в CFPS ($78 против $91); мы не проверили этот подход. Стоимость оценки детали с CFPS невелика по сравнению с генерацией ДНК шаблона ($ 0,05 / реакция22 против $ 78 за шаблон), хотя следует отметить, что затраты на запуск объемных реагентов и лизисного оборудования составляют не менее нескольких тысяч долларов. Использование акустического жидкостного погрузчика лишь незначительно снижает затраты, позволяя уменьшить объемы до 0,5 мкл40; более существенным преимуществом является сокращение времени на подготовку реакций (~10 мин против 1 ч, в зависимости от количества реакций), особенно при подготовке большого количества реакций вызывает опасения по поводу подготовленной реакции, сидящей в течение длительного времени перед инкубацией.
Несмотря на быстроту и экономическую эффективность, ограничения на то, когда прототипирование CFPS адекватно предсказывает функцию in vivo , еще предстоит увидеть. Например, любая перекрестная реактивность с геномной ДНК не будет обнаружена из-за удаления генома хозяина во время производства системы CFPS. Кроме того, концентрации компонентов могут быть на 1-2 порядка ниже в CFPS, чем в клетках51, что, вероятно, повлияет на поведение некоторых частей в результате различных условий макромолекулярной скученности. Кроме того, способность линейной ДНК предсказывать функцию in vivo может быть ограничена, например, когда вторичная структура ДНК играет важную роль. Последнее ограничение заключается в том, что конструкции не проверяются последовательностью перед тестированием функций. Могут быть случаи, когда характеризуемая часть фактически не соответствует предполагаемой теоретической последовательности. Все эти ограничения могут быть смягчены путем проверки подмножества деталей, экранированных этим методом, в предполагаемом приложении in vivo .
Первоначально мы разработали эту методологию для исследования влияния изменения положения оператора на гибридные промоторы T7-tetO 32. Мы представили протоколы здесь в более общем формате, так что они могут быть применены к промоторам, операторам, последовательностям связывания рибосом, изоляторам и терминаторам. Эти генетические части могут быть добавлены к 5ʹ или 3ʹ концу репортерного гена с помощью ПЦР с использованием праймеров для каждой конструкции, устраняя необходимость синтеза или клонирования каждого варианта для тестирования. Полученные продукты ПЦР служат шаблонной ДНК для оценки через экспрессию репортерного белка. В нашей работе для TetR и GamS использовался приведенный здесь протокол аффинной очистки. Та же процедура может быть использована для экспрессии и очистки других репрессоров, активаторов, полимераз, сигма-факторов и других белков, родственных генетической части, представляющей интерес, хотя для экспрессии желаемого белка могут потребоваться модификации. Очистка и титрование этих белков в реакции CFPS позволяет более детально охарактеризовать конкретную генетическую часть. Наконец, существует множество альтернативных протоколов CFPS, и каждый из них должен поддаваться части методологии, касающейся скрининга частей. В качестве примера мы не включаем в этот протокол этап диализа, который, по мнению других, важен для экспрессии из нативных бактериальных промоторов22. Также возможно изменение концентраций основных составляющих компонентов CFPS. Использование обработки жидкостей повышает способность тестировать множество условий за счет увеличения пропускной способности и уменьшения требуемых материаловна 34,35.
Одной из областей, которая может потребовать значительного устранения неполадок, является оптимизация акустического обработчика жидкостей. Акустическое дозирование жидкости должно быть оптимизировано для каждого передаваемого компонента, и настоятельно рекомендуется запустить средства управления для проверки правильного распределения и воспроизводимости перед сбором данных. Идеальный тип исходной пластины и класс жидкости будут зависеть от конкретной жидкости, которая будет дозироваться, и ее компонентов. Не рекомендуется использовать пластины с аминным покрытием для дозирования ДНК, так как аминное покрытие может взаимодействовать с ДНК. Следует также отметить, что способность дозировать более высокие концентрации определенных компонентов может зависеть от модели акустической жидкости. Перенос испытательной жидкости может проводиться путем дозирования на уплотнение фольгированной пластины для визуализации успешного образования капель; однако этот тест предоставляет ограниченную информацию, и капли из разных настроек могут выглядеть одинаково. Использование водорастворимого красителя, такого как тартразин, может быть использовано для более точной проверки того, что правильный объем обходится без заданной настройки или рабочего процесса (см. Репрезентативные результаты). Оптимальное программирование переноса жидкости также может влиять на точность и согласованность генерируемых данных; для переноса >1 мкл из одной исходной скважины в одну скважину назначения мы обнаружили, что последовательные переносы ≤1 мкл должны быть запрограммированы для снижения систематической изменчивости скважины к скважине (рисунок 4). Наконец, теоретические и фактические объемы мертвых скважин могут резко варьироваться в зависимости от типа исходной пластины, настроек класса жидкости и компонентов конкретной жидкости; использование функции обследования акустической жидкости для оценки объемов скважины перед запуском программы может помочь оценить, насколько точно прибор способен измерять конкретную жидкость.
Эффективность реакции CFPS может варьироваться при сравнении результатов между различными пользователями, партиями материалов, считывателями пластин и лабораториями41. Для случаев, когда такие сравнения необходимы при прототипировании генетических схем, мы рекомендуем включать реакции внутреннего контроля со стандартными конститутивными промоторами в каждую реакционную пластину, чтобы помочь нормализовать результаты в экспериментальных установках. Метод получения ДНК также может в значительной степени способствовать активности CFPS; рекомендуется включить стадию осаждения этанола. Кроме того, оптимальный реакционный состав может варьироваться в зависимости от партии экстракта34. Было показано, что оптимальные концентрации глутамата магния и глутамата калия, в частности, варьируются в зависимости от партии42 или от используемого промоторного или репортерного белка24. Концентрации этих компонентов должны быть оптимизированы путем скрининга нескольких концентраций каждого компонента на генетическую конструкцию и на препарат экстракта клетки для определения оптимальных условий экспрессии белка. Наконец, наилучшие методы обеспечения стабильной реакционной реакции CFPS включают тщательное перемешивание, тщательное дозирование и консистенцию при приготовлении каждого компонента реагента.
Помимо характеристик отдельных частей, тот же метод может быть использован для экранирования комбинаций деталей, которые образуют сложные схемы, такие как логические схемы16 или генераторы 52,53. Этот метод также может быть применен для скрининга и оптимизации биосенсоров для применения в эпидемиологической диагностике 54,55,56,57 или обнаружении и количественной оценке опасности 3,58,59. Применение методов, управляемых ИИ, таких как активное обучение34, также может сочетаться с высокопроизводительным характером этого метода для быстрого исследования сложных биологических пространств проектирования. В конечном счете, мы предполагаем, что этот подход поддерживает ускоренное время разработки новых генетических конструкций в синтетической биологии.

Основные усилия синтетической биологии заключаются в разработке наборов генетических инструментов, содержащих хорошо охарактеризованные части, которые могут быть использованы для построения генетических схем1, которые выполняют полезные функции при развертывании в микробах или бесклеточных лизатах. Области, в которых такие генетические схемы набрали обороты: зондирование 2,3,4, производительность человека 5,6, биотопливо 7,8, производство материалов 9,10 и клеточные вычисления11. Реестры стандартизированных генетических частей были созданы12 для каталогизации новых и существующих частей по категориям, таким как промоутеры, операторы, кодирующие последовательности и терминаторы, и это лишь некоторые из них. Такие усилия, как iGEM (международный конкурс генетически модифицированных машин)13, сыграли важную роль в характеристике и каталогизации этих генетических частей. Было разработано много методов, облегчающих быструю сборку этих деталей в полезные генетическиесхемы 14,15. Программное обеспечение даже было разработано для автоматизации композиции хорошо охарактеризованных частей в схемы, которые достигают желаемой функции16. Однако сборка полезных генетических схем с предсказуемыми функциями основывается на предположении, что наборы генетических инструментов содержат хорошо охарактеризованные генетические части. Из-за необходимости этих наборов инструментов для развития синтетической биологии были описаны многочисленные усилия по улучшению каталогизации схем и деталей с соответствующими характеристиками 17,18,19,20,21.
Один из подходов к характеристике генетических компонентов использует бесклеточные системы синтеза белка (CFPS), которые воссоздают клеточные функции, такие как транскрипция и трансляция ex vivo22. Несколько исследований продемонстрировали потенциал CFPS для прототипирования генетических компонентов 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32, будь то для прямого применения в бесклеточных системах или для прогнозирования функции генетических конструкций в клетках, таких как относительная активность частей в библиотеке 29 , оптимизация метаболического пути27 и клеточной нагрузки30. Преимущества прототипирования в CFPS по сравнению с клетками, подчеркнутые этими исследованиями, включают в себя избежание трудоемкого клонирования, точный контроль над концентрацией ДНК и других компонентов реакции и способность легко смешивать и сопоставлять несколько конструкций ДНК. Преимущество избегания клонирования особенно очевидно при использовании линейных шаблонов ДНК, что позволяет собирать новые конструкции методами in vitro, которые занимают часы вместо33 дней. Возможность манипулировать концентрацией конструкций ДНК и других компонентов просто путем пипетирования делает этот подход еще более привлекательным, позволяя проводить эксперименты с высокой пропускной способностью на основе роботов для обработки жидкостей34,35. Хотя сообщалось об успехах использования CFPS для прототипирования, важно отметить, что еще предстоит увидеть, в каких контекстах результаты CFPS могут надежно предсказать функциональность в клетках.
Здесь мы представляем метод прототипирования CFPS, который подчеркивает преимущества в скорости, пропускной способности и стоимости по сравнению с традиционными подходами на основе ячеек. Этот подход основан на нашей предыдущей работе, где мы использовали CFPS для быстрой характеристики библиотеки вариантов промотора T7, регулируемых фактором транскрипции TetR32, значительно расширяя небольшую горстку регулируемых вариантов промотора T7, которые были доступны в литературе в то время36,37. С тех пор другие еще больше расширили круг таких промоутеров38. В нашем методе сборка генетической конструкции ускоряется с помощью ПЦР для амплификации шаблонной ДНК с помощью праймеров, которые добавляют вариантные генетические части к гену-репортеру. Акустическая обработка жидкости в 384-скважинных плитах используется для увеличения пропускной способности и уменьшения объема необходимых материалов. Предыдущая работа продемонстрировала успешное использование акустической обработки жидкостей при значительно меньших объемах39,40 с изменчивостью, сопоставимой с ручным пипетированием больших объемов41. В дополнение к методу, мы предоставляем информацию об устранении неполадок и оценку потенциальных затрат и экономии времени. Обратите внимание, что, хотя мы включаем здесь протокол для производства бесклеточных лизатов на основе Sun et al.42, многие другие коммерческие наборы и протоколы43,44 также должны работать. Аналогичным образом, в то время как мы демонстрируем метод характеристики вариантовпромотора 32, другие части могут быть заменены амплификацией ПЦР, такие как риборегуляторы, сайты связывания рибосом (RBS), изоляторы, белковые метки и терминаторы. Мы надеемся, что эта методология может помочь сообществу синтетической биологии продолжать увеличивать количество характерных деталей для сборки предсказуемых генетических цепей с полезной функцией.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x YT medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2377-250G</td>
			<td>Alternative to making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td>For plating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (5 cm diameter)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>731-1550</td>
			<td>Used for protein purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destination plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc plate</td>
			<td>142761</td>
			<td>For CFPS reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L</td>
			<td>For digestion of plasmid templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>20871723</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) Rosetta2</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70954</td>
			<td>Cell line used for production of lysate and purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>525</td>
			<td>Acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell</td>
			<td>Thermo Spectronic</td>
			<td>FA-078</td>
			<td>For lysing cells for CFPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impermeable plastic sealable lid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>232702</td>
			<td>Plate seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>RPI</td>
			<td>I56000-25.0</td>
			<td>Used for protein induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g1501-500G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo source plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>PL-05525</td>
			<td>For use with Echo acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td>For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>For production of purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR H2O</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>H10</td>
			<td>Plate reader used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494S</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28606</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSonica Ultrasonic Processor</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q700</td>
			<td>Cell disruption during protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>Updated supplier from Sun et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T7293</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid characterization of genetic parts with cell-free systems

Характеристика и каталогизация генетических частей имеют решающее значение для разработки полезных генетических схем. Наличие хорошо охарактеризованных частей позволяет точно настроить генетические схемы, так что их функция приводит к предсказуемым результатам. С ростом синтетической биологии как области произошел взрыв генетических схем, которые были реализованы в микробах для выполнения функций, относящихся к зондированию, метаболическим изменениям и клеточным вычислениям. Здесь мы показываем быстрый и экономически эффективный метод характеристики генетических частей. Наш метод использует бесклеточный лизат, приготовленный собственными силами в качестве среды для оценки частей посредством экспрессии репортерного белка. Шаблон ДНК получают путем амплификации ПЦР с использованием недорогих праймеров для добавления вариантных частей к репортерскому гену, а шаблон добавляют в реакцию в виде линейной ДНК без клонирования. Части, которые могут быть добавлены таким образом, включают промоутеры, операторы, сайты связывания рибосом, изоляторы и терминаторы. Такой подход в сочетании с включением акустического жидкостного погрузчика и плит на 384 скважины позволяет пользователю проводить высокопроизводительные оценки генетических деталей за один день. Для сравнения, клеточные подходы к скринингу требуют трудоемкого клонирования и имеют более длительное время тестирования из-за ночных этапов нормализации культуры и плотности культуры. Кроме того, работа в бесклеточном лизате позволяет пользователю более жестко контролировать условия экспрессии путем добавления экзогенных компонентов и ДНК в точных концентрациях. Результаты, полученные в результате бесклеточного скрининга, могут быть использованы непосредственно в приложениях бесклеточных систем или, в некоторых случаях, как способ прогнозирования функции в целых клетках.

Чтобы продемонстрировать полезность наших методов, мы представляем результаты, которые описывают влияние близости последовательности тетО к промотору Т7 на регуляцию экспрессии, управляемой T7 RNAP. Полные результаты и их последствия можно найти в работе McManus et al.32. Рабочий процесс описан на рисунке 1. Пятнадцать линейных шаблонов, варьирующихся только на расстоянии промотора T7 относительно последовательности тетО , были подготовлены методом ПЦР-амплифицирующего репортер sfGFP праймерами, предназначенными для добавления каждого варианта промотора (рисунок 2), как описано в разделе 2 протокола. Реакционные компоненты и реакции CFPS были приготовлены в соответствии с протоколом. Экспрессию sfGFP измеряли из каждого шаблона с титрованием 12 различных концентраций белка TetR в трех экземплярах с использованием акустического жидкостного обработчика. При 36 реакциях CFPS на шаблон и 15 шаблонах было выполнено в общей сложности 540 реакций для всего набора комбинаций T7-tetO . Вся оценка проводилась на двух пластинах в двух пластинчатых считывателях. Анализ этих данных показал, что T7 RNAP понижает экспрессию, управляемую T7, в равной степени до 13 bp вниз по течению от начала транскрипта T7 (рисунок 3). Этот результат имеет значение для будущего проектирования регулируемых генных цепей, управляемых Т7, описывая предполагаемое окно для эффективного подавления Т7 другими репрессорами. Сравнение результатов описанного здесь протокола с ДНК, полученной путем традиционного клонирования, выявило небольшую, но статистически значимую разницу в степени подавления TetR между форматами. Мы предположили, что неспецифическое связывание TetR с векторной ДНК может объяснить наблюдаемую разницу. Экспериментальные результаты показали, что добавление линейной векторной ДНК к реакциям с линейной шаблонной ДНК уменьшало разницу до нестатистической значимости, хотя это не исключало вклада других факторов, таких как различия в периодичности спирали ДНК для линейных и круговых форматов, что, в свою очередь, могло повлиять на связывание TetR. В зависимости от приложения использование линейного шаблона может потребовать дополнительной проверки.
Кроме того, мы приводим репрезентативные данные о потенциальных проблемах с точным дозированием с использованием акустической обработки жидкостей (рисунок 4). Раствор 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS), рН 7,4, содержащий 0,25 мМ тартразинового красителя, был использован для оценки двух методов программирования акустического жидкого обработчика для дозирования объемов >1 мкл. После дозирования жидкости пластину назначения герметизировали и центрифугировали при 1 500 х г в течение 1 мин, а поглощение при 425 нм измеряли с помощью пластинчатого считывателя. Показаны репрезентативные результаты девяти экспериментов, которые демонстрируют более последовательное дозирование в серии из восьми целевых скважин, когда перенос 5 мкл разделен на отдельные дозы по 1 мкл. На основе этих наблюдений рекомендуется разбивать переносы >1 мкл на множественные переносы ≤1 мкл. Дополнительные сведения об устранении неполадок этого важного аспекта протокола см. в разделе Обсуждение .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig01.jpg"> Рисунок 1: Однодневный рабочий процесс для оценки промоторных частей в бесклеточном экстракте. (А) Репортер амплифицируется ПЦР с использованием праймеров, содержащих генетические части, подлежащие оценке (2-5 ч). (B) Бесклеточную реакционную смесь готовят, как описано в протоколе, и распределяют в 384-луночную пластину с ПЦР-амплифицированными шаблонами (30 мин). (C) Акустическая обработка жидкости используется для распределения дополнительных компонентов, которые могут включать белки-репрессоры, молекулы-эффекторы и любые другие условные эффекторы (10 мин). (D) Экспрессия белка репортера от каждой реакции измеряется в пластинчатом считывателе (2-16 ч, в зависимости от рецептуры и конструкции CFPS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig02.jpg"> Рисунок 2: Дизайн праймера для добавления генетических частей к репортерному гену путем амплификации ПЦР. (A) Репортерный ген sfGFP (зеленый) будет амплифицирован для добавления RBS (красный) и промотора T7 (синий) с помощью ПЦР. (B) sfGFP (зеленый) и RBS (красный) будут усилены для добавления последовательности тетО (золото) и промотора T7 (синий) с помощью ПЦР. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig03.jpg"> Рисунок 3: Влияние положения тетО на регуляцию выражения, управляемого Т7. Нормализованы максимальные значения подавления для линейного и кругового шаблона в зависимости от положения тетО . Трассировки представляют среднее и стандартное отклонения для трех реплик. Эта цифра была изменена из McManus et al.32 под лицензией Creative Commons CC-BY. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig04.jpg"> Рисунок 4: Использование тартразинового красителя для проверки дозирования жидкости с помощью акустического обработчика жидкости. Черные полосы указывают на дозирование 5 мкл раствора тартразина из одного источника скважины в каждую из восьми последовательных целевых скважин 384-луночной пластины с использованием одной команды программирования. Серые полосы указывают на дозирование 1 мкл из одного источника скважины в каждую из восьми последовательных целевых скважин с помощью одной команды программирования, а затем повторение этого шага четыре раза в общей сложности 5 мкл, дозируемых в каждой скважине назначения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Имя компонента</td>
			<td>Объем для 1 реакции (мкл)</td>
			<td>Объем для 110% от X числа реакций (мкл)</td>
		</tr><tr><td>Премикс Q5 PCR</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Вода</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Шаблон (1–3 нг/мкл)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(если исправлено1) Грунтовка форвардная (5 мкМ)</td>
			<td>0 или 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(если исправлено1) Обратная грунтовка (5 мкМ)</td>
			<td>0 или 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Мастер Микс Итого:</td>
			<td>30 или 40</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(если переменная1) Грунтовка форвардная (5 мкМ)</td>
			<td>0 или 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(если переменная1) Обратная грунтовка (5 мкМ)</td>
			<td>0 или 10</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Рабочий лист для приготовления реагентов для реакций ПЦР. Значения в крайнем правом столбце могут быть заполнены пользователями в зависимости от предполагаемого количества реакций. 1 См. Переменные праймеры содержат определенную часть, добавляемую в реакции ПЦР, и могут быть прямым праймером, обратным праймером или и тем, и другим. Фиксированные грунтовки не добавляют детали и могут быть прямой грунтовкой или обратной грунтовкой, но не обеими.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Имя компонента</td>
			<td>Объем для 1 реакции (мкл)</td>
			<td>Объем для 110% от X числа реакций (мкл)</td>
		</tr><tr><td>Экстракт клеток</td>
			<td>4.2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Смесь добавок</td>
			<td>3.3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Белок GamS (207 мкм)</td>
			<td>0.15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Шаблон ДНК (20 нМ)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>T7 полимераза (13 мг/мл)</td>
			<td>0.12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Вода</td>
			<td>0.73 (это число может отличаться)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Мастер Микс Итого:</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Протеин-репрессор:</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Таблица 2: Рабочий лист для приготовления реагентов для реакций CFPS. Значения в крайнем правом столбце могут быть заполнены пользователями в зависимости от предполагаемого количества реакций.
Дополнительная таблица. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/Table%20S1%20-%20cost%20estimates_REV%20EDITS.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Хорошо охарактеризованные генетические части необходимы для разработки новых генетических схем. Здесь мы описываем экономически эффективный, высокопроизводительный метод быстрой характеристики генетических частей. Наш метод сокращает затраты и время за счет объединения бесклеточных лизатов, линейной ДНК, чтобы избежать клонирования, и обработки акустической жидкости для увеличения пропускной способности и уменьшения объемов реакции.

Быстрая характеристика генетических частей с помощью бесклеточных систем

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

Наш метод позволяет быстро охарактеризовать генетические части с использованием бесклеточных систем экспрессии и ПЦР вместо клонирования. Основным преимуществом этой техники является то, что обычно занимает от нескольких дней до недель в клетках, что может быть сделано за несколько часов до нескольких дней с использованием этого метода. Наш протокол включает в себя шаги по созданию собственных бесклеточных систем экспрессии, которые могут быть сложными в ряде мест и могут потребовать корректировки в зависимости от варианта использования.Когда вы только начинаете, мы рекомендуем начать с коммерческих наборов. Начните с приготовления мастер-микса ПЦР в соответствии с инструкцией в рукописи и храните его на льду. Aliquot 30 или 40 микролитров мастер-микса в определенное количество ПЦР-пробирок и добавляют 10 микролитров каждого из пяти микромолярных переменных праймеров к соответствующим образом маркированным ПЦР-трубкам.Поместите трубки ПЦР в термоциклер и запустите программу ПЦР, как указано в текстовой рукописи. Затем проведите реакции при четырех градусах Цельсия. Если исходный шаблон представляет собой плазменную ДНК, добавьте один микролитр фермента рестрикции DpnI, чтобы переварить исходный шаблон и инкубировать реакции при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.Проанализируйте пять микролитров каждого продукта ПЦР, разделив их с помощью 1% агарозного геля при 180 вольтах в течение 20 минут. Проверьте правильный размер полосы, который будет варьироваться в зависимости от выбранной последовательности ядра и длины добавленных частей. Очистите линейные шаблоны с помощью коммерческого комплекта для очистки ПЦР.Если с помощью гелевого электрофореза присутствовало несколько полос, удалите интересующие полосы из геля и очистите ДНК с помощью коммерческого набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя. Количественно оцените каждый шаблон ДНК с помощью спектрофотометра, оценив его качество, проверив, что соотношение 260 к 280 нанометрам составляет примерно 1,8. Разморозьте все компоненты на льду и приготовьте мастер-микс, тщательно перемешав все компоненты с пипеткой, как указано в рукописи.Обратите пристальное внимание, чтобы избежать осаждения, особенно для аминокислотной смеси. Держите мастер-микс на льду. Охладите 384-луночную пластину на льду и распределите мастер-микс девятью микролитровыми аликвотами в каждую лунку.Разморозьте белок репрессора на льду и распределите его в акустическую пластину источника обработки жидкости, гарантируя, что включено соответствующее количество мертвого объема, необходимого для типа используемой исходной пластины. Распределите белок-репрессор в объемах в один микролитр в соответствующие целевые колодцы через жидкостный обработчик. Включите последовательное разбавление очищенного репортера или соответствующего химического стандарта на пластине для сравнения результатов с другими исследованиями и другими лабораториями.Выберите диапазон концентраций, соответствующий репортеру, используемому в ожидаемом диапазоне экспрессии экспериментов. Предварительно разогрейте пластинчатый считыватель до 30 градусов Цельсия. Если возможно, на приборе установите вертикальный температурный градиент в один градус Цельсия, чтобы ограничить конденсацию на уплотнении.Установите считыватель пластин для чтения на настройках, соответствующих репортеру, используемому в основной последовательности, без шагов встряхивания. Запечатайте 384-луночную пластину непроницаемым пластиковым уплотнением для предотвращения испарения. Поместите 384-луночную пластину на держатель пластины и начните чтение.15 линейных шаблонов, изменяющихся только на расстоянии промотора Т7 относительно последовательности тетО, были подготовлены методом ПЦР, усиливая суперпапку зеленый флуоресцентный белковый репортер, праймерами, предназначенными для добавления каждого варианта промотора. Анализ данных в общей сложности 540 реакций для всего набора комбинаций T7 tetO показал, что РНК-полимераза T7 подавляет экспрессию, вызванную T7, в равной степени, через 13 пар оснований вниз по течению от начала транскрипта T7. Более последовательное дозирование в серии из восьми целевых скважин с использованием акустического обработчика жидкости наблюдалось, когда пятимикролитровая передача была разделена на отдельные одномикролитровые дозы.Наш протокол может быть использован для быстрого скрининга генетических компонентов, будь то скрининг новых биосенсоров или создание библиотек генетических частей.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Высокая эффективность, определенных сайтов Трансфекция прилипшие клетки с помощью миРНК Микроэлектродные массивы (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Характеристика сложных систем по постановке эксперимента подхода: Переходный Белок Expression табачными в качестве примера

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Пломбируемая Femtoliter палата массивы для сотового без биологии

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Субтрактивный структурирование живых слоев клеток с микрожидком Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Синтез инфекционных бактериофагов в E. coli-на основе свободных клеток выражение системы

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Многослойная микрофлюидная платформа для проведения длительного выражения генов без клеток

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

OnePot PURE Cell-Free System

Бесклеточная система OnePot PURE

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Быстрые ферментативные методы амплификации минимальных линейных шаблонов для прототипирования белка с использованием бесклеточных систем

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...