Name: rapid characterization of genetic parts with cell-free systems
Uploaded: 2021-08-30T14:00:00
Duration: 5 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Detta arbete möjliggjordes av försvarsministerns kontor för tillämpad forskning för främjande av vetenskap och teknikprioriteringar. Vi tackar Scott Walper (Naval Research Laboratory) för att tillhandahålla lagret av sfGFP som används, och Zachary Sun och Abel Chiao (Tierra Biosciences) för fruktbara diskussioner relaterade till prototyper med cellfria system och relaterad felsökning av akustisk vätskehantering.

1. Beredning av cellextrakt
<ol><li>Beredning av media<ol><li>För 2xYT-media: Tillsätt 16 g trypton, 10 g jästextrakt och 5 g NaCl till 900 ml avjoniserat vatten och justera pH till 7,0 med 5 M NaOH. Höj lösningsvolymen till 1 liter med avjoniserat vatten och autoklav eller filtersterilisera. Alternativt kan du köpa 2xYT-media.</li>
		<li>För S30B-buffert: Bered en lösning av 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat och 5 mM Tris i 2 liter avjoniserat vatten. Använd 2 M Tris för att justera pH-värdet till 8,2, autoklav och förvara vid 4 °C. Fyll i lösningen genom att tillsätta ditiotreitol (DTT) till en slutlig koncentration på 1 mM strax före användning.</li>
	</ol></li>
	<li>Beredning av celler<ol><li>Stryk Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta2-celler eller annan cellinje som du väljer (se Cole et al.44 för en nyligen omfattande granskning) på en LB (Lysogeny Broth) agarplatta och inkubera vid 37 ° C i 10-14 timmar.</li>
		<li>Använd en enda E. coli-koloni för att inokulera 3 ml 2xYT-medium i ett 10 ml odlingsrör. Inkubera röret vid 37 °C med skakning vid 250 varv/min i 8 timmar.</li>
		<li>Använd 50 μL från 3 ml kultur för att inokulera 50 ml 2xYT-medium i en 500 ml kolv. Inkubera kolven vid 37 °C med skakning vid 250 rpm i 8 timmar.</li>
		<li>Använd 7,5 ml från 50 ml kultur för att inokulera var och en av fyra 4 L förbryllade kolvar innehållande 0,75 L 2xYT-medium. Inkubera dessa kolvar vid 37 °C med skakning vid 220 rpm tills de efter ca 3–4 timmar har uppnått en optisk densitet på 600 nm av 2–4.</li>
		<li>Skörda cellerna från varje kolv genom att överföra dem till 1 l behållare och centrifugera vid 5 000 x g i 12 min vid 4 °C. Kassera supernatanten genom att dekantera i en avfallsbehållare.</li>
		<li>Tvätta varje cellpellet med 150 ml iskall S30B-buffert genom att helt suspendera dem med en pipett för att störa cellmassan och samla sedan cellerna igen genom centrifugering vid 5 000 x g i 12 minuter. Kassera supernatanten.</li>
		<li>Tvätta varje cellpellet igen i 40 ml iskall S30B-buffert genom att helt suspendera dem och störa cellmassan med en pipett. Överför cellerna till vägda 50 ml koniska rör och samla upp cellerna igen genom centrifugering vid 2 000 x g i 8 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten genom att dekantera.</li>
		<li>Väg våtcellspellets. Snabbfrys cellpelletsen genom att placera rören direkt i flytande kväve och förvara dem vid -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Celllys<ol><li>Tina cellpelletsen på is.</li>
		<li>Resuspendera varje cellpellet i 1,4 ml S30B-buffert per 1 g av cellpelleten genom virvelning.</li>
		<li>Lysera cellerna med fransk tryckcell vid 640 psi vid 4 °C. Samla upp lysatet i mikrocentrifugrör på is och tillsätt 3 μl 1 M DTT per 1 ml lysat omedelbart efter lysering. OBS: Det är bäst att knacka på den franska pressventilen med en liten metallstav för att bibehålla jämnt tryck och undvika plötsliga tryckfall.</li>
		<li>Rensa lysatet genom centrifugering vid 30 000 x g i 30 minuter vid 4 °C och kassera pelleten efter pipettering av supernatanten till ett nytt iskallt mikrocentrifugrör, var försiktig så att pelleten inte störs.</li>
		<li>Centrifugera supernatanten en andra gång vid 30 000 x g i 30 minuter vid 4 °C. Pipettera den resulterande supernatanten till ett iskallt mikrocentrifugrör. Kassera pelleten.</li>
		<li>Inkubera supernatanten i ett vattenbad på 37 °C i 1 timme.</li>
		<li>Rengör supernatanten genom centrifugering vid 15 000 x g i 15 minuter vid 4 °C och överför den resulterande supernatanten till ett iskallt mikrocentrifugrör och var försiktig så att pelleten inte störs.</li>
		<li>Centrifugera supernatanten en andra gång vid 15 000 x g i 15 minuter vid 4 °C och överför den resulterande supernatanten till ett iskallt mikrocentrifugrör och se till att kvarvarande pelleter inte störs.</li>
		<li>Fördela supernatanten i 100 μl alikvoter i 1,5 ml mikrocentrifugrör och frys dem genom att placera dem direkt i flytande kväve. Förvara supernatanten vid -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Förberedelse av linjär mall
<ol><li>Primer design<ol><li>Välj en kärnsekvens som PCR-mall. Inkludera minst en reportersekvens, till exempel sfGFP (superfolder Green Fluorescent Protein), LacZ eller Spenat aptamer. Inkludera andra delar som kommer att fixas över skärmade varianter, såsom terminatorer, promotorer eller RBS, beroende på vad som är lämpligt för designen. OBS: Inkludering av en terminator krävs inte alltid för uttryck från linjärt DNA i cellfria system.</li>
		<li>För de framåtriktade primrarna väljer du minst 20 bp som matchar 5ʹ-änden av kärnsekvensen som 3ʹ-änden av primern. Om du lägger till delar i 5'-änden av konstruktionen, designa resten av 5ʹ-änden av primern för att lägga till de genetiska delarna av intresse för kärnsekvensen via PCR-amplifiering (figur 1A och figur 2). OBS: Eftersom primers över ~ 60 bp ofta ökar dramatiskt i kostnad, kan flera överlappande primers utformas för att lägga till längre sekvenser eller flera delar. Medan flera primers kan användas i en enda PCR-reaktion rekommenderas att utföra flera omgångar PCR.</li>
		<li>För de omvända primrarna, välj minst 20 bp för att matcha 3 ′ slutet av kärnsekvensen som 3ʹ änden av primern. Om du lägger till delar till 3'-änden av konstruktionen, designa resten av 5ʹ-änden av primern för att lägga till de genetiska delarna av intresse för kärnsekvensen via PCR-amplifiering (figur 1A och figur 2). Se till att den omvända primerns glödgningstemperatur ligger inom 5 °C från glödgningstemperaturen för hela den främre primern.</li>
	</ol></li>
	<li>Linjär mallförstärkning<ol><li>Bestäm antalet PCR-reaktioner som ska utföras baserat på antalet kärnsekvenser och beräkna mängden av varje komponent som krävs med hjälp av tabell 1.</li>
		<li>Förbered masterblandningen enligt tabell 1 och förvara den på is. Alikvot 30 eller 40 μL (se tabell 1) av masterblandningen i det fastställda antalet PCR-rör och tillsätt 10 μL av varje variabel primer (dvs. primrar som kodar för en deländring, se tabell 1) vid 5 μM till lämpligt märkta PCR-rör.</li>
		<li>Placera PCR-rören i termocyklern och kör följande PCR-program: 98 °C i 3 minuter; 30 cykler vid 98 °C vid 15 s, XX °C vid 20 s, 72 °C vid minst YY. slutlig förlängning vid 72 °C i 10 min. Håll sedan reaktionen vid 4 °C. Där XX representerar glödgningstemperaturen för primern med den lägre glödgningstemperaturen och YY representerar förlängningstiden beräknad för ampliconens längd baserat på tillverkarens rekommendationer för det polymeras med hög återgivning som används. Optimera dessa förhållanden efter behov för olika primers och / eller mallar.</li>
		<li>(Valfritt) Tillsätt 1 μL DpnI-restriktionsenzym för att smälta den ursprungliga mallen. Inkubera reaktionen vid 37 °C i 1 timme. Utför bara det här steget om den ursprungliga mallen är plasmid-DNA.</li>
		<li>Analysera 5 μL av varje PCR-produkt med gelelektrofores. Separera produkten med en 1% agarosgel vid 180 V i 20 min. Kontrollera om det finns rätt bandstorlek, som varierar med den valda kärnsekvensen och längden på de tillagda delarna.</li>
	</ol></li>
	<li>Rengör den linjära mallen med hjälp av ett kommersiellt PCR-reningskit eller med den föredragna PCR-rengöringsmetoden. Om flera band var närvarande genom gelelektroforesanalys, optimera antingen PCR-förhållandena eller rena de korrekta molekylviktbanden med hjälp av ett kommersiellt gelextraktionssats enligt tillverkarens rekommendation.</li>
	<li>Kvantifiera varje DNA-mall med hjälp av en spektrofotometer. Bedöm DNA-mallens kvalitet genom att kontrollera att förhållandet 260 nm/280 nm är ungefär 1,8.</li>
	<li>(Valfritt) Separera igen en del av DNA-mallen med en 1% agarosgel vid 180 V i 20 minuter och se till att eventuella oönskade band togs bort under mallreningen.</li>
	<li>Använd renade DNA-mallar omedelbart eller förvara vid -20 °C.</li>
</ol>3. Renad proteinberedning
<ol><li>Proteinuttryck<ol><li>För varje protein som ska uttryckas, montera en lämplig uttryckskonstruktion. Kodon-optimera genen för uttryck i E. coli. För in genen i en pET-22b-uttrycksvektor eller annan lämplig expressionsvektor via den föredragna plasmidmonteringsmetoden. Omvandla expressionsplasmiden till BL21(DE3), Rosetta2-uttrycksceller eller annan lämplig cellinje.</li>
		<li>För varje protein, använd en enda koloni för att inokulera 3 ml LB-medium i ett 10 ml odlingsrör. Inkubera dessa rör vid 37 °C med skakning vid 250 rpm över natten.</li>
		<li>Inokulera en 2 l kolv innehållande 750 ml LB-medium med 1 ml av dagskulturen. Inkubera dessa kolvar vid 37 °C med skakning vid 250 rpm tills de uppnår OD600 på 0,6–1,0.</li>
		<li>Framkalla proteinuttryck genom att tillsätta 0,75 ml 1 M isopropyl β-D-1-tiogalaktospyranosid (IPTG) i vatten till varje kolv och fortsätt att inkubera dessa kolvar vid 37 °C med skakning vid 250 rpm i 4 timmar.</li>
		<li>Skörda cellerna från varje kolv med en 1 L centrifugflaska genom centrifugering vid 5 000 x g i 12 minuter. Kassera supernatanten.</li>
		<li>Överför pelletsen till ett 50 ml koniskt rör och väg varje pellet. Frys cellerna i flytande kväve och förvara dem vid -80 °C eller fortsätt till steg 3.2. OBS: 2-5 g celler per 0,75 ml förväntas bli resultatet av detta steg.</li>
	</ol></li>
	<li>Proteinrening genom kolonnkromatografi med nickelaffinitet<ol><li>Förbered lysbufferten genom att kombinera 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl och 5 mM imidazol. Justera till pH 8,0.</li>
		<li>Förbered tvättbufferten genom att kombinera 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl och 25 mM imidazol. Justera till pH 8,0.</li>
		<li>Bered elueringsbufferten genom att kombinera 50 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl och 250 mM imidazol. Justera till pH 8,0.</li>
		<li>Förbered dialysbufferten genom att kombinera 50 mM NaHPO4, 100 mM NaCl och 2% DMSO. Justera till pH 7,5.</li>
		<li>Tina cellpelletsen genom att placera rören i rumstemperaturvatten. Tillsätt 5 ml lysbuffert per 1 g av cellpelleten och suspendera igen genom virvelning.</li>
		<li>Lyse cellerna genom ultraljudsbehandling. Separera cellhomogenatet så att det inte finns mer än 30 ml per 50 ml koniskt rör och håll varje rör på is. Lyse cellerna med hjälp av en sonicator med en 0,16 cm diameter sond i 15 s rundor med 30 s raster, 10 gånger. OBS: Undvik skumning, eftersom detta denaturerar proteinet. Bildandet av skum kan undvikas genom att hålla ultraljudsspetsen minst 2/3 nedsänkt i lysatet medan det är i drift. Andra metoder för celllys förutom ultraljudsbehandling är också möjliga44.</li>
		<li>Kristallisera lysatet genom centrifugering vid 15 000 x g i 30 minuter vid 4 °C och placera supernatanten i ett nytt 50 ml koniskt rör.</li>
		<li>Tillsätt 1 ml nickelnitrilotriättiksyra (Ni-NTA) harts för varje 5 ml supernatant. Dela celllysat/Ni-NTA-uppslamningen så att det inte finns mer än 36 ml per 50 ml koniskt rör. Inkubera vid 4 °C på en rörrotator vid 10 rpm i 1 h.</li>
		<li>Fyll hartset genom att dekantera celllysat/Ni-NTA-uppslamningen i en 2 ml kolonn med bäddvolymkromatografi och samla elueringsmedlet om det behövs för vidare analys, annars kasseras det. Tvätta hartset med 10 hartsbäddvolymer tvättbuffert.</li>
		<li>Samla upp proteinet genom att tillsätta tre elueringsbuffertar i hartsbädden till kolonnen och koncentrera volymen till 1,5 ml med hjälp av en centrifugalkoncentrator med lämpligt molekylviktsavgränsningsmembran för varje protein.</li>
		<li>Dialysera proteinet mot 2 l dialysbuffert vid 4 °C i 1 timme. Dialysera proteinet igen mot 2 l dialysbuffert över natten vid 4 °C.</li>
		<li>Kvantifiera proteinet med hjälp av dess molära extinktionskoefficient och absorbans vid 280 nm. Analysera proteinet för renhet genom att separera det med natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). Förvara proteinet vid -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Cellfri proteinsyntes
<ol><li>Beredning av CFPS-reaktionsblandning<ol><li>Förbered tilläggsblandningen genom att följa stegen Aminosyralösning, Energilösningsberedning och Buffertberedning i Sun et al.42. Förvaras separat eller i kombination vid -80 °C i alikvoter. Se till att de slutliga koncentrationerna matchar de som beskrivs i Sun et al.42 i avsnittet Experimentellt utförande av en TX-TL-reaktion.</li>
		<li>Förbered en tillsats för att skydda linjärt DNA från nedbrytning. Om du använder GamS33,45, förbered dig via steg i avsnitt 3 ovan, eller skaffa från en kommersiell leverantör; För andra tillvägagångssätt, se motsvarande litteratur46,47,48. Alternativt kan du använda ett CFPS-system som inte kräver tillsatser49.</li>
		<li>Bered T7-polymeras, repressorproteiner och andra tillsatser med hjälp av stegen i avsnitt 3 ovan eller erhåll från en kommersiell leverantör.</li>
		<li>Bestäm antalet CFPS-reaktioner som ska utföras och beräkna mängden av varje komponent som krävs med hjälp av tabell 2. Ändra koncentrationerna av komponenterna, inklusive tillsats eller borttagning av komponenter efter behov, och justera mängden vatten så att den slutliga volymen av varje reaktionsblandning alltid är 10 μl. Ändra på samma sätt masterblandningen för att underlätta dosering av andra komponenter genom akustisk vätskehantering efter önskemål (se avsnittet Diskussion ).</li>
		<li>Tina alla komponenter på is och förbered en masterblandning genom att blanda varje komponent enligt beräkningen ovan. Blanda alla komponenter noggrant med pipett. Var uppmärksam för att undvika nederbörd, särskilt för aminosyrablandningen. Håll masterblandningen på is.</li>
		<li>Kyl en platta med 384 brunnar på is och fördela masterblandningen i 9 μl alikvoter i varje brunn. OBS: Det är möjligt att distribuera dessa komponenter genom akustisk vätskehantering, men försiktighet bör iakttas för att säkerställa korrekt dosering (se avsnittet Diskussion för felsökning).</li>
	</ol></li>
	<li>Distribution av ytterligare komponenter genom akustisk vätskehantering<ol><li>Beräkna mängden repressorprotein (och andra valfria komponenter) som krävs för alla CFPS-reaktioner.</li>
		<li>Tina repressorproteinet på is och fördela det i en akustisk vätskehanteringsplatta eller annan lämplig platta. Se till att lämplig mängd dödvolym som krävs för den typ av källplatta som används ingår.</li>
		<li>Fördela repressorproteinet i volymer på 1 μl i lämpliga brunnar via vätskehanteraren. Mer information om felsökning av distribution finns i avsnittet Diskussion .</li>
	</ol></li>
	<li>Standardkurvor<ol><li>Inkludera en serieutspädning av den renade rapportören (se avsnitt 3 för proteinrening)41 eller lämplig kemisk standard50 på plattan för att möjliggöra jämförelse av resultaten med andra studier och andra laboratorier. Välj ett koncentrationsintervall som är lämpligt för den rapportör som används och experimentens förväntade uttrycksintervall.</li>
	</ol></li>
	<li>Köra CFPS-reaktioner<ol><li>Förvärm plattläsaren till 30 °C. Ställ in plattläsaren så att den läser med inställningar som är lämpliga för reportern som används i kärnsekvensen utan att skaka steg. OBS: Medan 30 ° C används här, används 29 ° C och 37 ° C också ofta och fungerar bra med detta protokoll. Andra temperaturer kan föredras för alternativa cellfria reaktionspreparat. För läsintervall är 10 min tillräckligt för att uppnå en bra upplösning för de representativa data som presenteras här. Andra upplösningar kan dock vara bättre beroende på reporterproteinet och det specifika CFPS-receptet.</li>
		<li>(Valfritt) Kör en testreaktion först för att ställa in lämplig förstärkning eller känslighetsinställning för att fånga förändringen i fluorescens utan signalspill.</li>
		<li>Försegla plattan med 384 brunnar med ett ogenomträngligt plastförslutningsbart lock för att förhindra avdunstning. Ställ om möjligt in en vertikal temperaturgradient på 1 °C på instrumentet för att begränsa kondens på tätningen. Placera plattan med 384 brunnar på tallrikshållaren och börja läsa.</li>
	</ol></li>
</ol>

RMM har en finansiell andel i Tierra Biosciences, ett privat företag som använder cellfria tekniker som de som beskrivs i denna artikel för proteinuttryck och screening.
De andra författarna har inget att avslöja.

De protokoll som beskrivs här ger ett kostnadseffektivt och snabbt sätt att screena genetiska delar via uttrycket av ett rapportprotein av CFPS. Välkarakteriserade genetiska delar är avgörande för utformningen av förutsägbara genetiska kretsar med användbar funktion. Denna metod ökar genomströmningen och minskar den tid som behövs för att screena nya genetiska delar genom att ta bort kravet på att arbeta i levande celler, samtidigt som funktionaliteten som speglar den cellulära miljön bibehålls genom att behålla den metaboliska processen för proteinuttryck i celllysatet. Vårt protokoll kan utföras inom 1 dag efter mottagandet av primers (~ 2,5-6 timmar för reaktionsberedning, 2-16 timmar för CFPS-reaktion; Figur 1), jämfört med minst 3 dagar för traditionell kloning (1 dag vardera för konstruktion, sammansättning och omvandling, sekvensverifiering av kloner och odling av celler för bedömning). Vi uppskattar vidare att kostnaden per konstruktion med linjärt DNA är ungefär en tredjedel av den traditionella kloningen ($ 78 vs. $ 237; Kompletterande tabell 1) metoder. Kommersiella syntestjänster citerar för närvarande minst 4 arbetsdagar beroende på storlek, även om de skulle ha liknande kostnader som vår metod om linjära fragment screenas direkt i CFPS ($ 78 vs. $ 91); Vi har inte verifierat detta tillvägagångssätt. Kostnaden för att utvärdera en del med CFPS är liten jämfört med genereringen av mall-DNA ($ 0.05 / reaktion22 vs. $ 78 per mall), men det bör noteras att startkostnaderna för bulkreagens och lysutrustning är minst flera tusen dollar. Användningen av en akustisk vätskehanterare förbättrar endast marginellt kostnaderna genom att möjliggöra mindre volymer ner till 0,5 μL40; Den mer betydande fördelen är minskningen av tiden för att förbereda reaktioner (~ 10 min vs. upp till 1 h, beroende på antalet reaktioner), särskilt när man förbereder ett stort antal reaktioner väcker oro för förberedd reaktion sittande under längre tider före inkubation.
Även om det är snabbt och kostnadseffektivt återstår det att se begränsningarna för när CFPS-prototyper på ett adekvat sätt förutsäger in vivo-funktionen . Till exempel kommer ingen korsreaktivitet med genomiskt DNA att detekteras på grund av avlägsnande av värdgenomet under produktionen av CFPS-systemet. Dessutom kan komponentkoncentrationerna vara 1-2 storleksordningar lägre i CFPS än i celler51, vilket sannolikt kommer att påverka beteendet hos vissa delar som ett resultat av olika makromolekylära trängselförhållanden. Vidare kan förmågan hos linjärt DNA att förutsäga in vivo-funktion vara begränsad, till exempel när DNA: s sekundära struktur spelar en viktig roll. En sista begränsning är att konstruktioner inte sekvensverifieras innan de testas för funktioner. Det kan finnas fall där den karakteriserade delen faktiskt inte är anpassad till den avsedda teoretiska sekvensen. Alla dessa begränsningar kan mildras genom att validera en delmängd av de delar som screenas med denna metod i den avsedda in vivo-applikationen .
Vi utvecklade ursprungligen denna metod för att undersöka effekterna av att ändra operatörspositionen på hybrid T7-tetO-promotorer 32. Vi har presenterat protokollen här i ett mer generiskt format, så att de kan tillämpas på promotorer, operatörer, ribosombindningssekvenser, isolatorer och terminatorer. Dessa genetiska delar kan läggas till 5ʹ eller 3ʹ änden av reportergenen genom PCR med hjälp av primers för varje design, vilket eliminerar behovet av syntes eller kloning av varje variant för att testa. De resulterande PCR-produkterna fungerar som mall-DNA för utvärdering via uttryck av ett rapportprotein. I vårt arbete användes affinitetsreningsprotokollet som tillhandahålls här för TetR och GamS. Samma procedur kan användas för uttryck och rening av andra repressorer, aktivatorer, polymeraser, sigmafaktorer och andra proteiner som är besläktade med en genetisk del av intresse, även om modifieringar kan behövas för det önskade proteinet som uttrycks. Rening och titrering av dessa proteiner till CFPS-reaktioner möjliggör en mer detaljerad karakterisering av en viss genetisk del. Slutligen finns det många alternativa CFPS-protokoll och vart och ett av dem bör kunna omfattas av metoddelen av analysen. Som ett exempel inkluderar vi inte ett dialyssteg i detta protokoll, vilket andra har funnit vara viktigt för uttryck från inhemska bakteriella promotorer22. Det är också möjligt att variera koncentrationerna av underliggande beståndsdelar i den gemensamma fiskeripolitiken. Användningen av vätskehantering förbättrar förmågan att testa de otaliga förhållandena genom att öka genomströmningen och minska de material som krävs34,35.
Ett område som kan kräva betydande felsökning är optimering av den akustiska vätskehanteraren. Dosering av akustisk vätskehanterare bör optimeras för varje komponent som överförs och det rekommenderas starkt att köra kontroller för att verifiera korrekt distribution och reproducerbarhet innan data samlas in. Den ideala källplattans typ och vätskeklassinställningen beror på den specifika vätskan som ska dispenseras och dess komponenter. Det rekommenderas inte att använda aminbelagda plattor för att dosera DNA, eftersom aminbeläggningen kan interagera med DNA. Det bör också noteras att förmågan att dispensera högre koncentrationer av vissa komponenter kan bero på den akustiska vätskehanterarmodellen. En provvätskeöverföring kan utföras genom dispensering på en folieplatttätning för att visualisera framgångsrik droppbildning. Detta test ger dock begränsad information och droppar från olika inställningar kan se identiska ut. Användningen av ett vattenlösligt färgämne, såsom tartrazin, kan användas för att mer exakt verifiera att rätt volym utelämnas med en given inställning eller arbetsflöde (se Representativa resultat). Optimal programmering av vätskeöverföringar kan också påverka noggrannheten och konsekvensen hos genererade data; För överföringar >1 μL från en källbrunn till en destinationsbrunn har vi funnit att sekventiella överföringar av ≤1 μL bör programmeras för att minska systematisk väl-till-brunn-variabilitet (figur 4). Slutligen kan teoretiska och faktiska källbrunnsdödvolymer variera dramatiskt beroende på källplattans typ, vätskeklassinställning och komponenter i den specifika vätskan; Att använda undersökningsfunktionen för akustisk vätskehanterare för att bedöma brunnsvolymerna innan du kör ett program kan hjälpa till att mäta hur exakt instrumentet kan mäta en viss vätska.
CFPS-reaktionsprestanda kan variera när man jämför resultat mellan olika användare, materialsatser, plattläsare och laboratorier41. För fall där sådana jämförelser krävs vid prototyper av genetiska kretsar rekommenderar vi att du inkluderar interna kontrollreaktioner med standardkonstitutiva promotorer i varje reaktionsplatta för att normalisera resultaten över experimentella inställningar. Metoden för DNA-framställning kan också i hög grad bidra till CFPS-aktiviteten. Införandet av ett utfällningssteg för etanol rekommenderas. Dessutom kan den optimala reaktionskompositionen variera med satsen extrakt34. I synnerhet optimala magnesiumglutamat- och kaliumglutamatkoncentrationer har visat sig variera beroende på sats42 eller med promotor- eller rapportproteinet som används24. Koncentrationerna av dessa komponenter bör optimeras genom screening över flera koncentrationer av varje komponent per genetisk konstruktion och per cellextraktberedning för att bestämma de optimala förhållandena för proteinuttryck. Slutligen omfattar bästa praxis för konsekvent CFPS-reaktionsprestanda noggrann blandning, noggrann pipettering och konsistens vid beredningen av varje reagenskomponent.
Utöver karakterisering av enskilda delar kan samma metod användas för att screena kombinationer av delar som bildar komplexa kretsar, såsom logiska kretsar16 eller oscillatorer52,53. Denna metod kan också tillämpas på screening och optimering av biosensorer för tillämpningar inom epidemiologisk diagnostik 54,55,56,57 eller farodetektering och kvantifiering 3,58,59. Tillämpningen av AI-drivna tekniker som aktivt lärande34 kan också kombineras med metodens höga genomströmningskaraktär för att driva snabb utforskning av komplexa biologiska designutrymmen. I slutändan föreställer vi oss detta tillvägagångssätt som stöder snabbare utvecklingstider för nya genetiska mönster inom syntetisk biologi.

En kärninsats inom syntetisk biologi är att utveckla genetiska verktygssatser som innehåller välkarakteriserade delar, som kan användas för att konstruera genetiska kretsar1 som utför användbara funktioner när de används i mikrober eller cellfria lysater. Områden där sådana genetiska kretsar har fått dragkraft är avkänning 2,3,4, mänsklig prestanda5,6, biobränslen7,8, materialproduktion 9,10 och cellulär databehandling 11. Register över standardiserade genetiska delar har upprättats12 för att katalogisera nya och befintliga delar i kategorier som promotorer, operatörer, kodande sekvenser och terminatorer, för att bara nämna några. Insatser som iGEM (international Genetically Engineered Machines) tävling13 har varit avgörande för att karakterisera och katalogisera dessa genetiska delar. Många metoder har utvecklats för att underlätta snabb montering av dessa delar i användbara genetiska kretsar14,15. Programvara har till och med utvecklats för att automatisera sammansättningen av välkarakteriserade delar i kretsar som uppnår en önskad funktion16. Sammansättningen av användbara genetiska kretsar med förutsägbara funktioner vilar dock på antagandet att de genetiska verktygssatserna innehåller välkarakteriserade genetiska delar. På grund av nödvändigheten av dessa verktygssatser mot utvecklingen av syntetisk biologi har många ansträngningar för att bättre katalogisera kretsar och delar med lämpliga karakteriseringsdata beskrivits 17,18,19,20,21.
Ett tillvägagångssätt för att karakterisera genetiska komponenter är att använda cellfria proteinsyntessystem (CFPS), som rekonstruerar cellulära funktioner såsom transkription och translation ex vivo22. Flera studier har visat CFPS: s potential för prototyper av genetiska komponenter 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 antingen för direkta tillämpningar i cellfria system eller för att förutsäga funktionen hos genetiska konstruktioner i celler, såsom den relativa aktiviteten hos delar inom ett bibliotek 29 , metabolisk vägoptimering27 och cellulär börda30. Fördelar med prototyper i CFPS jämfört med celler som lyfts fram i dessa studier inkluderar att undvika tidskrävande kloning, exakt kontroll över koncentrationen av DNA och andra reaktionskomponenter och förmågan att enkelt blanda och matcha flera DNA-konstruktioner. Fördelen med att undvika kloning är särskilt tydlig när man använder linjära DNA-mallar, vilket gör att nya konstruktioner kan monteras med in vitro-metoder som tar timmar istället för dag33. Möjligheten att manipulera koncentrationen av DNA-konstruktioner och andra komponenter helt enkelt genom pipettering gör tillvägagångssättet ännu mer attraktivt genom att möjliggöra experiment med hög genomströmning som drivs av vätskehanteringsrobotar34,35. Även om framgångar med CFPS för prototyper har rapporterats är det viktigt att notera att det återstår att se i vilka sammanhang CFPS-resultat på ett tillförlitligt sätt kan förutsäga funktionalitet i celler.
Här presenterar vi en metod för CFPS-prototyper som betonar fördelarna i hastighet, genomströmning och kostnad jämfört med traditionella cellbaserade metoder. Tillvägagångssättet härrör från vårt tidigare arbete där vi använde CFPS för att snabbt karakterisera ett bibliotek av T7-promotorvarianter som regleras av transkriptionsfaktorn TetR32, vilket avsevärt expanderar på den lilla handfull reglerade T7-promotorvarianter som fanns tillgängliga i litteraturen vid den tiden36,37. Andra har sedan dess ytterligare utökat utbudet av sådana initiativtagare38. I vår metod accelereras genetisk konstruktmontering genom att använda PCR för att förstärka mall-DNA via primers som lägger till olika genetiska delar till en reportergen. Akustisk vätskehantering i plattor med 384 brunnar används för att öka genomströmningen och minska volymen material som krävs. Tidigare arbete har visat framgångsrik användning av akustisk vätskehantering vid betydligt lägre volymer39,40 med variabilitet jämförbar med manuell pipettering av större volymer41. Utöver metoden tillhandahåller vi felsökningsinformation och en bedömning av potentiella kostnads- och tidsbesparingar. Observera att medan vi inkluderar ett protokoll för att producera cellfria lysat baserat på Sun et al.42 här, bör många andra kommersiella kit och protokoll43,44 också fungera. På samma sätt, medan vi demonstrerar metoden för karakterisering av promotorvarianter32, kan andra delar bytas ut genom PCR-amplifiering, såsom riboregulatorer, ribosombindningsställen (RBS), isolatorer, proteintaggar och terminatorer. Vi hoppas att denna metodik kan hjälpa den syntetiska biologin att fortsätta öka antalet karaktäriserade delar för montering av förutsägbara genetiska kretsar med användbar funktion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x YT medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2377-250G</td>
			<td>Alternative to making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td>For plating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (5 cm diameter)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>731-1550</td>
			<td>Used for protein purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destination plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc plate</td>
			<td>142761</td>
			<td>For CFPS reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L</td>
			<td>For digestion of plasmid templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>20871723</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) Rosetta2</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70954</td>
			<td>Cell line used for production of lysate and purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo acoustic liquid handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>525</td>
			<td>Acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell</td>
			<td>Thermo Spectronic</td>
			<td>FA-078</td>
			<td>For lysing cells for CFPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impermeable plastic sealable lid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>232702</td>
			<td>Plate seal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>RPI</td>
			<td>I56000-25.0</td>
			<td>Used for protein induction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>g1501-500G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo source plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>PL-05525</td>
			<td>For use with Echo acoustic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-Glu</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>For dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td>For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>For production of purified proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR H2O</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>H10</td>
			<td>Plate reader used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494S</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28606</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>PCR of linear templates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSonica Ultrasonic Processor</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q700</td>
			<td>Cell disruption during protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td>Updated supplier from Sun et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td>S30 Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td>For buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T7293</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td>For making 2xYT media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid characterization of genetic parts with cell-free systems

Att karakterisera och katalogisera genetiska delar är avgörande för utformningen av användbara genetiska kretsar. Att ha välkarakteriserade delar möjliggör finjustering av genetiska kretsar, så att deras funktion resulterar i förutsägbara resultat. Med tillväxten av syntetisk biologi som ett fält har det skett en explosion av genetiska kretsar som har implementerats i mikrober för att utföra funktioner som rör avkänning, metabolisk förändring och cellulär databehandling. Här visar vi en snabb och kostnadseffektiv metod för att karakterisera genetiska delar. Vår metod använder cellfritt lysat, framställt internt som medium för att utvärdera delar via uttrycket av ett reporterprotein. Mall-DNA framställs genom PCR-amplifiering med billiga primers för att lägga till variantdelar till rapportgenen, och mallen läggs till reaktionen som linjärt DNA utan kloning. Delar som kan läggas till på detta sätt inkluderar promotorer, operatörer, ribosombindningsställen, isolatorer och terminatorer. Detta tillvägagångssätt, i kombination med införlivandet av en akustisk vätskehanterare och 384-brunnsplattor, gör det möjligt för användaren att utföra utvärderingar med hög genomströmning av genetiska delar på en enda dag. Som jämförelse kräver cellbaserade screeningmetoder tidskrävande kloning och har längre testtider på grund av normaliseringssteg över natten för kultur och kulturtäthet. Vidare tillåter arbetet i cellfritt lysat användaren att exakt skärpa kontrollen över uttrycksförhållandena genom tillsats av exogena komponenter och DNA vid exakta koncentrationer. Resultat från cellfri screening kan användas direkt i tillämpningar av cellfria system eller i vissa fall som ett sätt att förutsäga funktion i hela celler.

För att demonstrera nyttan av våra metoder presenterar vi resultat som beskriver effekterna av närheten av tetO-sekvensen till T7-promotorn på regleringen av T7 RNAP-drivet uttryck. De fullständiga resultaten och deras konsekvenser finns i McManus et al.32. Arbetsflödet beskrivs i bild 1. Femton linjära mallar, varierande endast i avståndet för T7-promotorn i förhållande till tetO-sekvensen, framställdes genom PCR-förstärkning av sfGFP-reportern med primers utformade för att lägga till varje promotorvariant (figur 2) som beskrivs i avsnitt 2 i protokollet. CFPS-reaktionskomponenter och reaktioner bereddes enligt protokollet. Uttrycket av sfGFP mättes från varje mall med en titrering av 12 olika koncentrationer av TetR-proteinet, i tre exemplar, med användning av en akustisk vätskehanterare. Vid 36 CFPS-reaktioner per mall och 15 mallar utfördes totalt 540 reaktioner för hela uppsättningen T7-tetO-kombinationer. Hela utvärderingen utfördes på två plattor i två plattläsare. Analys av dessa data visade att T7 RNAP nedreglerar T7-drivet uttryck lika upp till 13 bp nedströms från början av T7-transkriptet (figur 3). Detta resultat har implikationer för framtida design av regulerbara T7-drivna genkretsar genom att beskriva ett förmodat fönster för en effektiv repression av T7 av andra repressorer. Jämförelse av resultat från det protokoll som beskrivs här med DNA framställt genom traditionell kloning avslöjade en liten men statistiskt signifikant skillnad i graden av TetR-förtryck mellan format. Vi antog att icke-specifik bindning av TetR till vektor-DNA skulle kunna förklara den observerade skillnaden. Experimentella resultat visade att tillägg av linjärt vektor-DNA till reaktioner med linjärt mall-DNA minskade skillnaden till icke-statistisk signifikans, även om det inte uteslöt bidrag från andra faktorer, såsom skillnader i periodicitet för DNA-spiralen för linjära kontra cirkulära format, vilket i sin tur kan påverka TetR-bindningen. Beroende på applikationen kan användningen av linjär mall kräva ytterligare validering.
Vi inkluderar vidare representativa data om potentiella problem med korrekt dosering med akustisk vätskehantering (figur 4). En lösning av 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4 innehållande 0,25 mM tartrazinfärgämne användes för att utvärdera två metoder för programmering av en akustisk vätskehanterare för att dispensera volymer >1 μL. Efter vätskedosering förseglades destinationsplattan och centrifugerades vid 1 500 x g i 1 minut och absorbansen vid 425 nm mättes med en plattläsare. Representativa resultat från nio experiment visas och visar mer konsekvent dispensering över serien av åtta destinationsbrunnar när 5 μL-överföringen delas upp i separata 1 μL-dispenser. Baserat på dessa observationer rekommenderas att överföringar >1 μL delas upp i flera överföringar på ≤1 μL. Se avsnittet Diskussion för mer information om felsökning av denna viktiga aspekt av protokollet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig01.jpg"> Figur 1: Endagsarbetsflöde för utvärdering av promotordelar i cellfritt extrakt. (A) En rapportör PCR-amplifieras med hjälp av primers som innehåller genetiska delar som ska utvärderas (2-5 timmar). (B) Den cellfria reaktionsblandningen bereds enligt beskrivningen i protokollet och fördelas i en platta med 384 brunnar med de PCR-förstärkta mallarna (30 min). (C) Akustisk vätskehantering används för att distribuera ytterligare komponenter, som kan innefatta repressorproteiner, effektormolekyler och andra villkorade effektorer (10 min). (D) Reporterproteinuttryck från varje reaktion mäts i en plattläsare (2–16 timmar, beroende på CFPS-receptet och konstruktionen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig02.jpg"> Figur 2: Primerdesign för att lägga till genetiska delar till en reportergen genom PCR-amplifiering . (A) sfGFP-reportergenen (grön) kommer att förstärkas för att lägga till en RBS (röd) och en T7-promotor (blå) med PCR. (B) SFGP (grön) och en RBS (röd) kommer att förstärkas för att lägga till en tetO-sekvens (guld) och en T7-promotor (blå) med PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig03.jpg"> Figur 3: Effekten av tetO-position på regleringen av ett T7-drivet uttryck. Normaliserade maximala repressionsvärden för linjär och cirkulär mall som en funktion av tetO-positionen . Spår representerar medelvärdet och standardavvikelserna för tre replikat. Denna siffra har modifierats från McManus et al.32 under en Creative Commons CC-BY-licens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62816/62816fig04.jpg"> Figur 4: Användning av tartrazinfärgämne för att validera vätskedispensering med en akustisk vätskehanterare. Svarta staplar indikerar dosering av 5 μL tartrazinlösning från en enda källbrunn i var och en av de åtta på varandra följande destinationsbrunnarna på en 384-brunnsplatta med ett enda programmeringskommando. Grå staplar indikerar dispensering av 1 μL från en enda källa väl in i var och en av åtta på varandra följande destinationsbrunnar med ett enda programmeringskommando och sedan upprepa detta steg fyra gånger för totalt 5 μL dispenserat i varje destinationsbrunn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/62816fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Komponentens namn</td>
			<td>Volym för 1 reaktion (μL)</td>
			<td>Volym för 110% av X antal reaktioner (μL)</td>
		</tr><tr><td>Q5 PCR Premix</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vatten</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Mall (1–3 ng/μL)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(om fixat1) Främre primer (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(om fixat1) Omvänd primer (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Master Mix Totalt:</td>
			<td>30 eller 40</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(om variabel1) Främre primer (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>(om variabel1) Omvänd primer (5 μM)</td>
			<td>0 eller 10</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Arbetsblad för beredning av reagenser för PCR-reaktioner. Värden i kolumnen längst till höger kan fyllas i av användare beroende på det avsedda antalet reaktioner. 1 Variabla primrar innehåller en specifik del som ska tillsättas i PCR-reaktionen och kan vara framåtprimern, omvänd primer eller båda. Fasta primers lägger inte till en del och kan vara den främre primern eller omvänd primer men inte båda.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Komponentens namn</td>
			<td>Volym för 1 reaktion (μL)</td>
			<td>Volym för 110% av X antal reaktioner (μL)</td>
		</tr><tr><td>Cell extrakt</td>
			<td>4.2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Tillägg Mix</td>
			<td>3.3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GamS-protein (207 μM)</td>
			<td>0.15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Mall DNA (20 nM)</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>T7-polymeras (13 mg/ml)</td>
			<td>0.12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vatten</td>
			<td>0,73 (detta antal kan variera)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Master Mix Totalt:</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Repressorprotein:</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Arbetsblad för beredning av reagenser för CFPS-reaktioner. Värden i kolumnen längst till höger kan fyllas i av användare beroende på det avsedda antalet reaktioner.
Kompletterande tabell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62816/Table%20S1%20-%20cost%20estimates_REV%20EDITS.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems at JoVE.com

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Välkarakteriserade genetiska delar är nödvändiga för design av nya genetiska kretsar. Här beskrivs en kostnadseffektiv metod med hög genomströmning för att snabbt karakterisera genetiska delar. Vår metod minskar kostnad och tid genom att kombinera cellfria lysater, linjärt DNA för att undvika kloning och akustisk vätskehantering för att öka genomströmningen och minska reaktionsvolymerna.

Snabb karakterisering av genetiska delar med cellfria system

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

Vår metod möjliggör snabb karakterisering av genetiska delar med hjälp av cellfria expressionssystem och PCR istället för kloning. Den största fördelen med denna teknik är vad som vanligtvis tar dagar till veckor i celler kan göras i timmar till dagar med denna metod. Vårt protokoll innehåller steg för att skapa dina egna cellfria uttryckssystem, vilket kan vara svårt på ett antal ställen och kan kräva justeringar beroende på användningsfall.När du börjar rekommenderar vi att du börjar med kommersiella kit. Börja med att förbereda PCR-masterblandningen enligt instruktionerna i manuskriptet och förvara den på is. Alikvot 30 eller 40 mikroliter av mastern blandas i det bestämda antalet PCR-rör och tillsätt 10 mikroliter av vardera fem mikromolära variabla primrar till lämpligt märkta PCR-rör.Placera PCR-rören i termocykler och kör PCR-programmet som nämns i textmanuskriptet. Håll sedan reaktionerna vid fyra grader Celsius. Om den ursprungliga mallen är plasma-DNA, tillsätt en mikroliter DpnI-restriktionsenzym för att smälta den ursprungliga mallen och inkubera reaktionerna vid 37 grader Celsius i en timme.Analysera fem mikroliter av varje PCR-produkt genom att separera dem med en 1% agarosgel vid 180 volt i 20 minuter. Kontrollera om det finns rätt bandstorlek, som varierar med den valda kärnsekvensen och längden på de tillagda delarna. Rena de linjära mallarna med hjälp av ett kommersiellt PCR-reningssats.Om flera band var närvarande genom gelelektrofores, punktskatta banden av intresse från gelén och rena DNA med hjälp av ett kommersiellt gelextraktionssats, enligt tillverkarens instruktioner. Kvantifiera varje DNA-mall med hjälp av en spektrofotometer, bedöm dess kvalitet genom att kontrollera att förhållandet 260 till 280 nanometer är ungefär 1,8. Tina alla komponenter på is och förbered en masterblandning genom att blanda alla komponenter noggrant med en pipett, som nämns i manuskriptet.Var uppmärksam för att undvika nederbörd, särskilt för aminosyrablandningen. Håll masterblandningen på is. Kyl en platta med 384 brunnar på is och fördela masterblandningen i nio mikroliter alikvoter i varje brunn.Tina repressorproteinet på is och fördela det i en akustisk vätskehanteringsplatta, se till att lämplig mängd dödvolym som krävs för den typ av källplatta som används ingår. Fördela repressorproteinet i volymer på en mikroliter till lämpliga destinationsbrunnar via vätskehanteraren. Inkludera en serieutspädning av den renade rapportören eller en lämplig kemisk standard på plattan för att jämföra resultaten med andra studier och andra laboratorier.Välj ett koncentrationsintervall som är lämpligt för rapportören som används i experimentens förväntade uttrycksintervall. Förvärm plattläsaren till 30 grader Celsius. Om möjligt, ställ in en vertikal temperaturgradient på en grad Celsius för att begränsa kondens på tätningen.Ställ in plattläsaren så att den läser med inställningar som är lämpliga för reportern som används i kärnsekvensen, utan att skaka steg. Försegla plattan med 384 brunnar med en ogenomtränglig plasttätning för att förhindra avdunstning. Placera plattan med 384 brunnar på tallrikshållaren och börja läsa.15 linjära mallar, som endast varierade i avståndet för T7-promotorn i förhållande till tetO-sekvensen, framställdes av PCR, vilket förstärkte supermappen grön fluorescerande proteinrapportör, med primers utformade för att lägga till varje promotorvariant. Analys av data från totalt 540 reaktioner för hela uppsättningen T7 tetO-kombinationer visade att T7 RNA-polymeraset nedreglerar T7-drivet uttryck lika, upp till 13 baspar nedströms från början av T7-transkriptet. Mer konsekvent dispensering över serien av åtta destinationsbrunnar med hjälp av den akustiska vätskehanteraren observerades när en överföring på fem mikroliter delades upp i separata en-mikroliter-dispenser.Vårt protokoll kan användas för att snabbt screena genetiska komponenter, oavsett om det gäller screening av nya biosensorer eller byggande av genetiska delars bibliotek.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Hög effektivitet, Platsspecifik transfektion av vidhäftande celler med siRNA Använda mikroelektrod Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Undersöka Receptor-ligand System av Cellulosome med AFM-baserad Single-molekyl Force spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering av komplexa system Använda Försöks Tillvägagångssätt: Transient Protein Expression i tobak som en fallstudie

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Förslutningsbar Femtoliter Chamber arrayer för Cellfri biologi

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Snabb Subtraktiv Mönstring av levande cellskikt med en mikroflödessystem Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntesen av infektiös bakteriofager i en E. coli -baserade Cell-free uttryck systemet

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Multilayer Microfluidic plattform för ledning av långvarig cell-fri genuttryck

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

OnePot PURE Cell-Free System

OnePot PURE cellfritt system

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Snabba, enzymatiska metoder för förstärkning av minimala, linjära mallar för proteinprototyper med cellfria system

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...