Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

يعترف المؤلفون بامتنان بزملائهم جيفري توم وأيمن سونغ لتوليف الببتيد ، و Nianfeng Ge لبناء TMA ، و Shari Lau لتلطيخ IHC ، وميليسا إيديك للمسح المجهري الرقمي ، و Hai Ngu لقياس كمية الصور الرقمية.

1. إعداد حلول وأدوات المخزون
<ol><li>تحضير 20 مل من محلول BSA 25٪ w / v عن طريق خلط 5 غرام من مسحوق BSA في 14 مل من PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.2 في أنبوب مخروطي 50 مل حتى يتم تشتيته بالتساوي. دوامة حسب الضرورة لتفريق مسحوق BSA.<ol><li>حافظ على المحلول بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية للسماح بالذوبان الكامل. اضبط ال?...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

تسمح هذه الطريقة للمستخدم بإنشاء عينات موحدة من التركيب المعروف وتركيز المستضد كمعايير في تفاعلات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية ، باستخدام مواد وتقنيات مألوفة لمعظم مختبرات الأنسجة. الخطوة الأكثر أهمية هي تحديد الظهارة التي يرتبط بها الجسم المضاد للاهتمام. يصف هذا البروتوكول استخ...

تسمح الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) بالكشف الحساس والمحدد والدقيق مكانيا عن المستضدات المستهدفة في أقسام الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين (FFPE). ومع ذلك ، قد تتأثر نتائج تلطيخ IHC بمتغيرات متعددة ، بما في ذلك وقت نقص التروية الدافئ والبارد ، وتثبيت الأنسجة ، والمعالجة المسبقة للأنسجة ، وتفاعل الأجسام المضادة وتركيزها ، وكيمياء الكشف عن المقايسة ، وأوقات التفاعل1. وبناء على ذلك، يتطلب الأداء والتفسير القابلان للتكرار لتفاعلات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية رقابة صارمة على هذه المتغيرات واستخدام عينات تحكم إيجابية وسلبية مميزة بشكل جيد. تشمل عناصر التحكم المستخدمة بشكل متكرر الأنسجة المضمنة في البارافين أو خطوط الخلايا المستزرعة المعروفة من التحليلات المستقلة للتعبير عن المستضد المثير للاهتمام ، ولكن هذه العينات ليست متاحة دائما1. علاوة على ذلك ، فإن مستويات التعبير عن المستضدات المستهدفة في الأنسجة وضوابط خط الخلية مفهومة بشكل عام نوعيا فقط وقد تكون متغيرة. يمكن أن تساعد الضوابط التي تحتوي على تركيزات قابلة للتكرار ومعروفة بدقة من المستضد المستهدف في تحسين ظروف تفاعل المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. وقد وصف المؤلفون2 طريقة عامة قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من أنواع المستضدات في مجموعة من التركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لإنشاء عينات تحكم اصطناعية من المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. يتم توفير بروتوكول مفصل هنا لإنشاء واستخدام هذا النوع من المعايير.
الضوابط المناسبة ضرورية للتفسير الصحيح لمقايسات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية1،3،4. تم استخدام الأنسجة والخلايا المستزرعة والركائز المغلفة بالببتيد كضوابط تابعة للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية وفقا للاحتياجات المحددة للمحققين. وقد نوقشت على نطاق واسع المزايا والقيود الكامنة في استخدام الأنسجة كضوابط المدينة العالمية للخدمات الإنسانية 1,4. بالنسبة للعديد من الأجسام المضادة، يمكن اختيار الضوابط المناسبة من أنسجة طبيعية مختارة تحتوي على مجموعات خلايا تعبر عن المستضد المستهدف على نطاق ديناميكي واسع. تكون ضوابط الأنسجة أقل ملاءمة عندما لا يكون المستضد المستهدف مميزا بشكل جيد فيما يتعلق بموقع التعبير أو وفرته ، أو عندما يتم التعبير عن المستضدات التي يحتمل أن تكون متقاطعة التفاعل في نفس الخلايا أو مواقع الأنسجة. في هذه السياقات ، يمكن أن تكون كتل خطوط الخلايا المستزرعة التي تعبر عن مستضد الاهتمام مفيدة. لتوفير مزيد من الأدلة على خصوصية الهدف ، يمكن تصميم خطوط الخلايا على مستضدات الهدف الزائدة أو الناقصة. على سبيل المثال ، تم استخدام هذا النهج مؤخرا لتقييم مجموعة متنوعة من الفحوصات المضادة ل PD-L1 باستخدام مصفوفة دقيقة من الأنسجة من خطوط الخلايا متساوية المنشأ التي تعبر عن مجموعة من مستضد PD-L15. تشمل القيود العملية على الاستخدام الروتيني لكتل خطوط الخلايا التكلفة والوقت اللازمين لإنتاج أعداد كافية من الخلايا وحقيقة أن التعبير عن بعض المستضدات قد لا يكون متسقا بشكل موثوق ، حتى داخل خطوط الخلايا النسيلة6. الببتيدات الاصطناعية هي خيار ثالث لضوابط IHC للأجسام المضادة التي تتعرف على الظواهر الخطية القصيرة. نشر ستيفن بوجين وزملاؤه على نطاق واسع حول استخدام الببتيدات إلى جانب سطح الشرائح الزجاجية 7,8 والخرز الزجاجي9. أظهرت إحدى الدراسات التي أجرتها هذه المجموعة أن التحليل الكمي لضوابط المدينة العالمية للخدمات الإنسانية القائمة على الببتيد يمكن أن يكشف عن تباين عملية التلطيخ الذي غاب عنه التقييم النوعي لضوابط الأنسجة التي تم تحليلها بالتوازيمع 10. في حين أن المعايير التي تستخدم المستضدات القائمة على الخرز يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع ، فإن العديد من التفاصيل مملوكة للمؤلفين ، مما يحد من التبني على نطاق واسع.
وهناك نهج آخر لمعايير المدينة العالمية للخدمات الإنسانية يدمج المستضدات المستهدفة في المواد الهلامية البروتينية المصطنعة. تم إثبات هذا المفهوم لأول مرة من قبل بير براندتزايج في عام 1972 في دراسة تم فيها بلمرة مصل الأرانب الطبيعي باستخدام الجلوتارالدهيد11. ثم تم نقع كتل صغيرة من الجل الناتج لمدة 1-4 أسابيع في محاليل تحتوي على مستضدات الغلوبولين المناعي ذات الأهمية بتركيزات مختلفة. بعد تثبيت الكحول وتضمين البارافين ، تبين أن أجزاء من عناصر التحكم الناتجة تلطخ بكثافة تتوافق مع لوغاريتم محاليل المستضدات التي تم نقعها فيها. في وقت لاحق ، أعد الباحثون اقترانات glutaraldehyde من الأحماض الأمينية المحددة في المحاليل المخففة BSA أو متجانسة الدماغ كضوابط إيجابية في دراسات المجهر الإلكتروني المناعي12,13. بحث عمل أحدث في استخدام المواد الهلامية المصنوعة من محاليل البروتين الثابتة الفورمالديهايد كبدائل لأنسجة FFPE في تحليل الطيف الكتلي14. بحث عمل حديث آخر في بنية وخصائص المواد الهلامية التي تشكلت عن طريق تسخين محاليل ألبومين مصل الإنسان أو البقر بتركيزات مختلفة ودرجة الحموضة15. وجد هؤلاء المؤلفون أن ألبومين المصل يشكل ثلاثة أنواع من المواد الهلامية تختلف في المرونة الميكانيكية ، والحفاظ على البنية الثانوية ، والقدرة على ربط الأحماض الدهنية اعتمادا على الظروف التجريبية. وتبين هذه الورقات مجتمعة الجدوى العامة للنهج المستخدم هنا. تخلق محاليل البروتين ذات التركيب المحدد مواد هلامية تشبه الأنسجة يمكن معالجتها وتقسيمها وتلوينها باستخدام الطرق النسيجية الروتينية.
يصف هذا البروتوكول تشكيل عنصر تحكم اصطناعي في المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مصنوع من ألبومين مصل البقر (BSA) المبلمر بالحرارة والفورمالديهايد. يمكن أن تتضمن المواد الهلامية مجموعة واسعة من المستضدات ، بما في ذلك البروتينات كاملة الطول ، ومجالات البروتين ، والببتيدات الخطية ، بالإضافة إلى المستضدات غير البروتينية بما في ذلك oligonucleotides2. يستخدم هذا العرض التوضيحي مثالا على مستضد الببتيد الخطي الذي يشفر الأحماض الأمينية C-terminal 16 لبروتين ERBB2 البشري (HER2 / neu) TPTAENPEYLGLDVPVV-COOH (انظر جدول المواد). يتضمن هذا التسلسل الظواهر التي تم التعرف عليها من قبل ثلاثة أجسام مضادة متاحة تجاريا وذات صلة تشخيصية بما في ذلك كاشف Herceptest متعدد النسيلة (ENPEYLGLDVP) والأجسام المضادة وحيدة النسيلة CB11 (AENPEYL) و 4B5 (TAENPEYLGL) (انظر جدول المواد)16.
تستخدم الطريقة الموضحة هنا كواشف متاحة بسهولة باستخدام عمليات وتقنيات مألوفة لأي مختبر ممارس لعلم الأنسجة. ويتمثل أهم قيد في الحاجة إلى تحديد المستضدات المستهدفة وشرائها، وهو ما يمكن تحقيقه في كثير من الحالات بتكلفة متواضعة نسبيا. نظرا لأن هذه الضوابط الاصطناعية ذات تركيبة محددة بالكامل ومصنوعة بطرق بسيطة ، يمكن تنفيذها في العديد من المختبرات بنتائج قابلة للتكرار. وقد يسهل استخدامها التقييم الموضوعي القابل للقياس الكمي لنتائج تلطيخ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية ويسمح بمزيد من التكرار داخل المختبرات وفيما بينها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

توفر اختبارات الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) رؤى قيمة حول أنماط التعبير عن البروتين ، والتي يتطلب تفسيرها الموثوق به عينات تحكم إيجابية وسلبية مميزة بشكل جيد. نظرا لأن عناصر التحكم المناسبة في الأنسجة أو خطوط الخلايا ليست متوفرة دائما، فقد تكون هناك طريقة بسيطة لإنشاء عناصر تحكم اصطناعية في المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مفيدة. يتم وصف هذه الطريقة هنا. وهو قابل للتكيف مع أنواع المستضدات المختلفة ، بما في ذلك البروتينات أو الببتيدات أو oligonucleotides ، في مجموعة واسعة من التركيزات. يشرح هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لإنشاء ضوابط مستضدات اصطناعية ، باستخدام كمثال على ذلك الببتيد من المجال الورمي البشري B2 (ERBB2 / HER2) داخل الخلايا (ICD) المعترف به من قبل مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة ذات الصلة تشخيصيا. يتم خلط التخفيفات التسلسلية لببتيد HER2 ICD في محلول ألبومين مصل البقر (BSA) مع الفورمالديهايد وتسخينه لمدة 10 دقائق عند 85 درجة مئوية لتصلب وربط خليط الببتيد / BSA. يمكن معالجة الجل الناتج وتقسيمه وتلوينه مثل الأنسجة ، مما ينتج عنه سلسلة من العينات من تركيزات المستضدات المعروفة التي تغطي مجموعة واسعة من شدة التلطيخ.
يتوافق هذا البروتوكول البسيط مع إجراءات مختبر الأنسجة الروتينية. تتطلب الطريقة فقط أن يكون لدى المستخدم كمية كافية من المستضد المطلوب. يمكن تصنيع البروتينات المؤتلفة أو مجالات البروتين أو الببتيدات الخطية التي تشفر الظواهر ذات الصلة محليا أو تجاريا. يمكن للمختبرات التي تولد أجساما مضادة داخلية أن تحتفظ بحصص من مستضد التحصين كهدف للتحكم الاصطناعي. تتيح فرصة إنشاء ضوابط إيجابية محددة جيدا عبر مجموعة واسعة من التركيزات للمستخدمين تقييم أداء الفحص داخل المختبر وفيما بينه ، واكتساب نظرة ثاقبة على النطاق الديناميكي والخطية لمقايساتهم ، وتحسين ظروف الفحص لأهدافهم التجريبية الخاصة.

يجب أن تذوب الببتيدات بالكامل في مذيب مناسب في درجة حرارة الغرفة لتشكيل محلول واضح بصريا. إذا كانت مادة الجسيمات المرئية لا تزال موجودة بعد 30-60 دقيقة ، فقد يكون من المفيد إضافة كميات إضافية من المذيب الأصلي أو مذيب بديل لا يتجاوز الحجم المقصود لمحلول مخزون الببتيد 5x المحسوب في الجدول 1<...

Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

يوثق هذا العمل طريقة بسيطة لإنشاء ضوابط مستضدات اصطناعية للكيمياء النسيجية المناعية. هذه التقنية قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من المستضدات في مجموعة واسعة من التركيزات. وتوفر العينات مرجعا لتقييم الأداء وقابلية التكرار داخل وبين المقايسة.

ضوابط المستضدات الاصطناعية للكيمياء النسيجية المناعية

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

تعتبر المواد الهلامية المستضدية BSA من معايير IHC القابلة للتكرار والتي يمكن أن تكمل الضوابط الحالية. يستخدم هذا البروتوكول علم الأنسجة القياسي وكواشف المدينة العالمية للخدمات الإنسانية وطرق لوضع معايير قابلة للتكرار للتكوين المعروف. توفر هذه الضوابط الفرصة للمختبرات المختلفة لمعايرة وتوحيد مقايسات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية للعديد من الفحوصات ذات الصلة بالتشخيص.من المهم العثور على مذيب مناسب لإذابة الببتيد أو البروتين. قد يكون من الصعب خلط حلول المستضد والفورمالديهايد بسرعة دون إدخال فقاعات. للبدء ، قم بإعداد 20 ملليلتر من محلول BSA بوزن 25٪ عن طريق خلط خمسة جرامات من مسحوق BSA في 14 ملليلتر من PBS ، في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر حتى يتم توزيعه بالتساوي.دوامة الحل لإذابة مسحوق BSA. حافظ على المحلول بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية للذوبان الكامل. في اليوم التالي ، اضبط مستوى الصوت النهائي على 20 ملليلتر باستخدام PBS.وبالمثل ، قم بإعداد 20 ملليلتر من وزن 31.3٪ حسب الحجم محلول BSA عن طريق خلط 6.26 جرام من مسحوق BSA في 13 ملليلتر من PBS. بعد الحضانة بين عشية وضحاها للذوبان الكامل ، اضبط الحجم النهائي على 20 ملليلتر باستخدام PBS. لاختبار أن خليط الفورمالديهايد BSA يشكل هلام ، قم بتسخين كتلة حرارة إلى 85 درجة مئوية.ثم امزج 700 ميكرولتر من محلول BSA 25٪ مع 700 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪. اخلطي جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل خمس مرات في غضون خمس إلى 10 ثوان دون إنشاء فقاعات هواء. مباشرة بعد الخلط ، ضع أنبوب الطرد المركزي الصغير المغلق في كتلة الحرارة المسخنة مسبقا إلى 85 درجة مئوية.بعد 10 دقائق ، قم بإزالة الأنبوب من كتلة الحرارة. اتركه ليبرد وتأكد من أن الجل قد تشكل كما هو متوقع. قم بإعداد وتسمية ثمانية أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 ملليلتر بوضوح.ثم قم بإعداد محلول مخزون الببتيد 5x ، أضف تركيزا 12.5 ملليمولار عن طريق تعليق الكتلة الكاملة للببتيد المحرر في 60 ميكرولتر من المذيب المناسب. راقب الحل للتأكد من أن الببتيد يذوب تماما. ثم أضف كمية إضافية من المذيبات حسب الضرورة لصنع محلول 12.5 ملليمولار وفقا للببتيدات الوزن الجزيئي والكتلة والنقاء.في هذا المثال ، يحتوي مخزون الببتيد 5x على حجم نهائي يبلغ 626.9 ميكرولتر. ستتطلب عينات الببتيد الأخرى حجما نهائيا مختلفا. بعد ذلك ، قم بإعداد 150 ميكرولتر من محلول مخزون الببتيد 1x أضف تركيز 2.5 ملليمولار عن طريق تخفيف 30 ميكرولتر من مخزون الببتيد 5x إلى 120 ميكرولتر من المذيب.دوامة الحل لمدة خمس ثوان وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد 700 ميكرولتر من محلول BSA الببتيد 0.5 مللي مولم عن طريق تخفيف 140 ميكرولتر من مخزون الببتيد 1x إلى 560 ميكرولتر من محلول BSA بنسبة 31.3٪. بعد الدوامة ، الطرد المركزي الحل في درجة حرارة الغرفة.وبالمثل ، قم بإعداد أربعة تخفيفات تسلسلية متتالية 10x لمخزون BSA الببتيد عن طريق إضافة 70 ميكرولتر من محلول BSA الببتيد إلى 630 ميكرولتر من محلول BSA بنسبة 25٪. لتحضير المواد الهلامية الببتيد BSA ، أضف 37٪ من الفورمالديهايد إلى تخفيفات الببتيد BSA بنسبة واحدة إلى واحدة تعمل عينة واحدة في كل مرة. اخلطي جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل خمس مرات في غضون خمس إلى 10 ثوان دون إنشاء فقاعات هواء.بعد الخلط ، ضع أنبوب الطرد المركزي الصغير المغلق في كتلة حرارية عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تحضير جميع محاليل الببتيد BSA والفورمالديهايد وتسخينها ، اسمح للمواد الهلامية بالبرودة على سطح الطاولة لمدة خمس إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، باستخدام ملعقة مختبرية نظيفة ومرنة يمكن التخلص منها ، قم بإزالة عينة الجل من أنبوب الطرد المركزي الصغير في قطعة واحدة.وضعه في حاوية مغلقة تحتوي على ما لا يقل عن 15 ملليلتر من الفورمالين المحايد المخزن مؤقتا ، باستخدام حاوية منفصلة لكل عينة. بدلا من ذلك ، باستخدام شفرة حلاقة جديدة أحادية الحافة ، قم بقطع الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الصغير ودفع الجل من الأسفل بالهواء أو مسبار مناسب. باستخدام ماكينة حلاقة نظيفة ذات حافة واحدة ، قم بتقليم مخروط الجل إلى أقراص أسطوانية يبلغ سمكها حوالي خمسة ملليمترات.بعد لف الأقراص في غلاف خزعة، ضع قرص هلام أكبر حجما في كاسيت واحد وأقراص الجل المتبقية معا في كاسيت ثان للاستخدام في بناء المصفوفات الدقيقة للأنسجة. قبل المعالجة ، ضع جل الكاسيت في 15 ملليلتر على الأقل من الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ لكل جل ، باستخدام حاوية منفصلة لكل عينة. بعد ذلك ، قم بمعالجة المواد الهلامية في معالج أنسجة الأنسجة الآلي باتباع جدول زمني كبير للأنسجة مع الضغط والفراغ.عند اكتمال معالجة العينات، قم بإزالة الكاسيت من معالج الأنسجة وانقلها إلى مركز تضمين البارافين. بعد فك المواد الهلامية من غلاف الخزعة ، قم بتضمين المواد الهلامية في البارافين أو كل عينة قم بتضمين قرص واحد من الجل في قالب صغير 15 × 15 ملم. والأقراص الهلامية المتبقية معا في قالب ثان أكبر.لكل سلسلة تخفيف الببتيد، قم بإنشاء شريحتين زجاجيتين تحتويان على ما مجموعه ستة أقسام منفصلة. قسم واحد من كل عينة من عينات سلسلة التخفيف الخمسة وقسم واحد من عينة التحكم السلبية BSA فقط. بعد تقسيم الشرائح وتجفيفها ، قم بتلطيخ الشريحتين المحضرتين لكل ببتيد بالجسم المضاد الأساسي المطلوب.وفقا لبروتوكولات الكيمياء الهيستولوجية المناعية القياسية ، نتوقع رؤية إشارة موحدة نسبيا داخل كل قسم هلامي. مع عينات هلام مختلفة تظهر مجموعة من شدة الإشارة المقابلة لتخفيف الببتيد. بالنسبة لبناء مصفوفة الأنسجة الهلامية BSA ، قم بقطع أربعة أقسام سميكة من المصفوفة الدقيقة للأنسجة ووصمة عار بجسم مضاد وحيد النسيلة للأرانب وفقا للبروتوكولات القياسية المختبرية.قم بتقييم كثافة البقع الناتجة نوعيا عن طريق الفحص أو شراء مسح الصور الرقمية وتحليلها كميا. بعد التفاعل مع الأجسام المضادة المناسبة ، أظهرت عينات هلام BSA السلبية فقط الحد الأدنى من الإشارة. كثافة الإشارة في عينة هلام فردية موحدة نسبيا وتزداد مع زيادة تركيزات المستضدات.أكثر من 10٪ من خلايا MDA-MB-175 تظهر باهتة وفي تلطيخ غشائي محيطي تماما. في المقابل ، أكثر من 10 ٪ من خلايا SKBR-3 ، تظهر تلطيخا غشائيا محيطيا مكثفا تماما اعمل بسرعة بمجرد إضافة الفورمالديهايد لأن المحاليل ستبدأ في الهلام حتى في درجة حرارة الغرفة. نحن نستخدم هذه الطريقة لجعل الضوابط IHC عند اختبار الأجسام المضادة الجديدة لمنحنا الثقة بأن الفحص يعمل كما هو متوقع ، حتى عندما لا تظهر الأجسام المضادة للاختبار أي إشارة.عناصر التحكم في الأنسجة أو خطوط الخلايا متغيرة بطبيعتها. تسمح لنا ضوابط المستضدات الاصطناعية بقياس تأثير تغيير ظروف تفاعل ISD المحددة بشكل أكثر دقة.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Visual and Narrative Methods to Achieve Fair Process in Clinical Care

باستخدام أساليب البصرية والسردية لتحقيق عملية عادلة في مجال الرعاية السريرية

The Institute of Medicine has targeted patient-centeredness as an important area of quality improvement. A major dimension of patient-centeredness is ...

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

السكتة الدماغية النمذجة في الفئران -- الشرق انسداد الشريان الدماغي مع نموذج الشعيرة

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen

تعزيز التعريفي أفكارك وAutophagic من رواية الاصطناعية التناظرية-1 C-7 من deoxypancratistatin في ادينوكارسينوما الثدي البشري وخلايا العصبية مع تاموكسيفين

Breast cancer is one of the most common cancers amongst women in North America. Many current anti-cancer treatments, including ionizing radiation, induce ...

Identification of Disease-related Spatial Covariance Patterns using Neuroimaging Data

تحديد الأمراض ذات الصلة أنماط التباين المشترك المكانية باستخدام بيانات تصوير الأعصاب

The scaled subprofile model (SSM)1-4 is a multivariate PCA-based algorithm that identifies major sources of variation in patient and control group brain ...

Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

تصاعدي الأورطي انقباض في الفئران لخلق الضغط الزائد تضخم القلب النموذجي

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

تسلسلي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من الخلايا الجذعية المكونة للعظم / السلف خلال اصلاح الكسر

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Modeling and Simulations of Olfactory Drug Delivery with Passive and Active Controls of Nasally Inhaled Pharmaceutical Aerosols

النمذجة والمحاكاة من الشم توصيل الدواء مع عناصر تحكم سلبية ونشطة من أنفيا استنشاق الأدوية الهباء

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the ...

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

الكيمياء المناعية الكمية للمكروية الخلوية في المرضى ارتجاجات الأرومة الدبقية

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

وضع العلامات المناعية للفخاخ خارج الخلية البشرية ومورين العدلات في الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

زرع جهاز إرسال تخطيط القلب عن بعد وضغط الدم لتحديد حساسية منعكس الضغط التلقائي في الفئران الواعية

Blood pressure (BP) and heart rate (HR) are both controlled by the autonomic nervous system (ANS) and are closely intertwined due to reflex mechanisms. ...