Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

De auteurs erkennen dankbaar hun collega's Jeffrey Tom en Aimin Song voor peptidesynthese, Nianfeng Ge voor TMA-constructie, Shari Lau voor IHC-kleuring, Melissa Edick voor digitaal microscopisch scannen en Hai Ngu voor digitale beeldkwantificering.

1. Bereiding van voorraadoplossing en gereedschappen
<ol><li>Bereid 20 ml van een 25% w/v BSA-oplossing door 5 g BSA-poeder in 14 ml PBS, pH 7,2 in een conische buis van 50 ml te mengen totdat het gelijkmatig is gedispergeerd. Vortex indien nodig om het BSA-poeder te dispergeren.<ol><li>Houd de oplossing een nacht op 4 °C om volledige oplossing mogelijk te maken. Pas het uiteindelijke volume aan op 20 ml met PBS om een voorraadoplossing van 25% w/v te maken.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid 20 ml van een 31,3% w/v BSA-opl...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

Met deze methode kan de gebruiker uniforme monsters maken van bekende samenstelling en antigeenconcentratie als normen in IHC-reacties, met behulp van materialen en technieken die bekend zijn bij de meeste histologische laboratoria. De meest cruciale stap is het identificeren van het epitoop waaraan het antilichaam van belang bindt. Dit protocol beschrijft het gebruik van een lineair peptide-antigeen van de ERBB2/HER2 ICD. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om BSA-gels te vormen die oligonucleotiden, fluorescerende l...

Immunohistochemie (IHC) maakt de gevoelige en specifieke, ruimtelijk nauwkeurige detectie van doelantigenen in formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) weefselsecties mogelijk. IHC-kleuringsresultaten kunnen echter worden beïnvloed door meerdere variabelen, waaronder warme en koude ischemietijd, weefselfixatie, weefselvoorbehandeling, antilichaamreactiviteit en -concentratie, testdetectiechemie en reactietijden1. Dienovereenkomstig vereisen reproduceerbare prestaties en interpretatie van IHC-reacties een rigoureuze controle van deze variabelen en het gebruik van goed gekarakteriseerde positieve en negatieve controlemonsters. Vaak gebruikte controles omvatten paraffine-ingebedde weefsels of gekweekte cellijnen die bekend zijn van onafhankelijke analyses om het antigeen van belang uit te drukken, maar dergelijke monsters zijn niet altijd beschikbaar1. Bovendien worden de expressieniveaus van de doelantigenen in weefsels en cellijncontroles over het algemeen alleen kwalitatief begrepen en kunnen ze variabel zijn. Controles die reproduceerbare, nauwkeurig bekende concentraties van doelantigeen bevatten, kunnen helpen bij de optimalisatie van IHC-reactieomstandigheden. Een algemene methode, aanpasbaar aan een verscheidenheid aan antigeentypen in een fysiologisch relevant bereik van concentraties om synthetische IHC-controlemonsters te creëren, is beschreven door de auteurs2. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor het maken en gebruiken van dit type standaard.
Passende controles zijn essentieel voor de geldige interpretatie van IHC-assays 1,3,4. Weefsels, gekweekte cellen en peptide-gecoate substraten zijn gebruikt als IHC-controles volgens de specifieke behoeften van de onderzoekers. De voordelen en beperkingen die inherent zijn aan het gebruik van weefsels als IHC-controles zijn uitgebreid besproken 1,4. Voor veel antilichamen kunnen geschikte controles worden gekozen uit geselecteerde normale weefsels die celpopulaties bevatten die het doelantigeen over een breed dynamisch bereik tot expressie brengen. Weefselcontroles zijn minder geschikt wanneer het doelantigeen niet goed wordt gekarakteriseerd met betrekking tot expressieplaats of abundantie, of wanneer potentieel kruisreagerende antigenen co-expressie zijn in dezelfde cellen of weefselplaatsen. In deze contexten kunnen blokken gekweekte cellijnen die het antigeen van belang uitdrukken nuttig zijn. Om verder bewijs van doelspecificiteit te leveren, kunnen cellijnen worden ontworpen om doelantigenen te over- of onderexpressie te geven. Een dergelijke benadering werd bijvoorbeeld onlangs gebruikt om een verscheidenheid aan anti-PD-L1-testen te evalueren met behulp van een weefselmicroarray van isogene cellijnen die een bereik van PD-L1-antigeen5 tot expressie brengen. Praktische beperkingen aan het routinematige gebruik van cellijnblokken zijn onder meer de kosten en tijd die nodig zijn om voldoende celaantallen te produceren en het feit dat de expressie van sommige antigenen mogelijk niet betrouwbaar consistent is, zelfs niet binnen klonale cellijnen6. Synthetische peptiden zijn een derde optie voor IHC-controles voor antilichamen die korte lineaire epitopen herkennen. Steven Bogen en collega's hebben uitgebreid gepubliceerd over het gebruik van peptiden gekoppeld aan het oppervlak van glazen dia's 7,8 en glaskralen9. Een studie door deze groep toonde aan dat kwantitatieve analyse van op peptiden gebaseerde IHC-controles kleuringsprocesvariatie kon detecteren die werd gemist door kwalitatieve evaluatie van weefselcontroles die parallel10 werden geanalyseerd. Hoewel normen met behulp van op kralen gebaseerde antigenen op grote schaal toepasbaar kunnen zijn, zijn veel details eigendom van de auteurs, waardoor wijdverspreide acceptatie wordt beperkt.
Een andere benadering van IHC-normen omvat doelantigenen in kunstmatig gemaakte eiwitgels. Dit concept werd voor het eerst gedemonstreerd door Per Brandtzaeg in 1972 in een studie waarin normaal konijnenserum werd gepolymeriseerd met behulp van glutaaraldehyde11. Kleine blokken van de resulterende gel werden vervolgens gedurende 1-4 weken gedrenkt in oplossingen die de immunoglobuline-antigenen van belang in verschillende concentraties bevatten. Na alcoholfixatie en inbedding van paraffine bleken delen van de resulterende controles te vlekken met intensiteiten die overeenkomen met de logaritme van de antigeenoplossingen waarin ze waren gedrenkt. Later bereidden onderzoekers glutaaraldehydeconjugaten van specifieke aminozuren in verdunde BSA- of hersenhomogenaatoplossingen als positieve controles in immuun-elektronenmicroscopiestudies 12,13. Meer recent werk onderzocht het gebruik van gels gemaakt van formaldehyde-vaste eiwitoplossingen als surrogaten voor FFPE-weefsel in massaspectrometrie-analyse14. Een ander recent werk onderzocht de structuur en eigenschappen van gels gevormd door het verwarmen van menselijke of runderserumalbumine-oplossingen in verschillende concentraties en pH15. Deze auteurs ontdekten dat serumalbumine drie soorten gels vormt die verschillen in mechanische elasticiteit, behoud van secundaire structuren en vetzuurbindend vermogen, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Samen tonen deze papers de algemene haalbaarheid aan van de hier gehanteerde aanpak. Eiwitoplossingen met een gedefinieerde samenstelling creëren weefselachtige gels die verder kunnen worden verwerkt, gesneden en gekleurd met behulp van routinematige histologische methoden.
Dit protocol beschrijft de vorming van een synthetische IHC-controle gemaakt van runderserumalbumine (BSA) gepolymeriseerd met warmte en formaldehyde. De gels kunnen een breed scala aan antigenen bevatten, waaronder eiwitten over de volledige lengte, eiwitdomeinen en lineaire peptiden, evenals niet-eiwitantigenen, waaronder oligonucleotiden2. Deze demonstratie gebruikt een voorbeeld van antigeen een lineair peptide dat codeert voor de C-terminale 16 aminozuren van het menselijke ERBB2 (HER2/neu) eiwit TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (zie Materiaaltabel). Deze sequentie omvat de epitopen die worden herkend door drie in de handel verkrijgbare, diagnostisch relevante antilichamen, waaronder het Herceptest polyklonale reagens (ENPEYLGLDVP) en de monoklonale antilichamen CB11 (AENPEYL) en 4B5 (TAENPEYLGL) (zie Materiaaltabel)16.
De hier gedemonstreerde methode maakt gebruik van direct beschikbare reagentia met behulp van processen en technieken die bekend zijn bij elk praktiserend histologisch laboratorium. De belangrijkste beperking is de noodzaak om de doelantigenen te identificeren en te kopen, wat in veel gevallen tegen relatief bescheiden kosten kan worden bereikt. Omdat deze synthetische regelaars van volledig gedefinieerde samenstelling zijn en met eenvoudige methoden zijn gemaakt, kunnen ze in veel laboratoria worden geïmplementeerd met reproduceerbare resultaten. Het gebruik ervan kan de objectieve, kwantificeerbare evaluatie van IHC-kleuringsresultaten vergemakkelijken en een grotere intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid mogelijk maken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

Immunohistochemie (IHC) assays bieden waardevolle inzichten in eiwitexpressiepatronen, waarvan de betrouwbare interpretatie goed gekarakteriseerde positieve en negatieve controlemonsters vereist. Omdat geschikte weefsel- of cellijncontroles niet altijd beschikbaar zijn, kan een eenvoudige methode om synthetische IHC-controles te maken nuttig zijn. Een dergelijke methode wordt hier beschreven. Het is aanpasbaar aan verschillende antigeentypen, waaronder eiwitten, peptiden of oligonucleotiden, in een breed scala van concentraties. Dit protocol legt de stappen uit die nodig zijn om synthetische antigeencontroles te creëren, met als voorbeeld een peptide uit het menselijke erytroblastische oncogen B2 (ERBB2 / HER2) intracellulaire domein (ICD) herkend door een verscheidenheid aan diagnostisch relevante antilichamen. Seriële verdunningen van het HER2 ICD-peptide in boviene serumalbumine (BSA) oplossing worden gemengd met formaldehyde en gedurende 10 minuten verwarmd bij 85 °C om het peptide/BSA-mengsel te stollen en te kruisen. De resulterende gel kan worden verwerkt, gesneden en gekleurd als een weefsel, wat een reeks monsters van bekende antigeenconcentraties oplevert die een breed scala aan kleuringsintensiteiten omvatten.
Dit eenvoudige protocol is consistent met routinematige histologische laboratoriumprocedures. De methode vereist alleen dat de gebruiker een voldoende hoeveelheid van het gewenste antigeen heeft. Recombinante eiwitten, eiwitdomeinen of lineaire peptiden die coderen voor relevante epitopen kunnen lokaal of commercieel worden gesynthetiseerd. Laboratoria die interne antilichamen genereren, kunnen aliquots van het immuniserende antigeen reserveren als het synthetische controledoel. De mogelijkheid om goed gedefinieerde positieve controles te creëren over een breed scala aan concentraties stelt gebruikers in staat om de prestaties van intra- en interlaboratoriumtests te beoordelen, inzicht te krijgen in het dynamische bereik en de lineariteit van hun assays en de testomstandigheden te optimaliseren voor hun specifieke experimentele doelen.

Peptiden moeten volledig oplossen in een geschikt oplosmiddel bij kamertemperatuur om een optisch heldere oplossing te vormen. Als er na 30-60 minuten nog steeds zichtbaar deeltjesmateriaal aanwezig is, kan het nuttig zijn om extra volumes van het oorspronkelijke oplosmiddel of een alternatief oplosmiddel toe te voegen dat het beoogde volume van de in tabel 1 berekende 5x-peptidevoorraadoplossing niet overschrijdt. Evenzo moet de gecombineerde peptide/BSA-oplossing doorschijnend blijven (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

Dit werk documenteert een eenvoudige methode om synthetische antigeencontroles voor immunohistochemie te creëren. De techniek is aanpasbaar aan een verscheidenheid aan antigenen in een breed scala aan concentraties. De monsters bieden een referentie waarmee de intra- en intertestprestaties en reproduceerbaarheid kunnen worden beoordeeld.

Synthetische antigeencontroles voor immunohistochemie

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

BSA-antigeengels zijn goed gekarakteriseerde reproduceerbare IHC-normen die bestaande controles kunnen aanvullen. Dit protocol maakt gebruik van standaard histologie en IHC-reagentia en -methoden om reproduceerbare normen van bekende samenstelling te maken. Deze controles bieden de mogelijkheid voor verschillende laboratoria om IHC-assays te kalibreren en te standaardiseren voor veel diagnostisch relevante assays.Het is belangrijk om een geschikt oplosmiddel te vinden om het peptide of eiwit op te lossen. Het kan lastig zijn om antigeen en formaldehyde-oplossingen snel te mengen zonder bubbels te introduceren. Bereid om te beginnen 20 milliliter van een BSA-oplossing van 25% volume door vijf gram BSA-poeder te mengen in 14 milliliter PBS, in een conische buis van 50 milliliter totdat deze gelijkmatig wordt verdeeld.Vortex de oplossing om het BSA-poeder op te lossen. Houd de oplossing 's nachts op vier graden Celsius voor volledige oplossing. Pas de volgende dag het uiteindelijke volume aan op 20 milliliter met PBS.Bereid op dezelfde manier 20 milliliter van een BSA-oplossing van 31,3 volumeprocent door 6,26 gram BSA-poeder in 13 milliliter PBS te mengen. Na een nacht incubatie voor volledige oplossing, past u het uiteindelijke volume aan op 20 milliliter met PBS. Om te testen of het BSA-formaldehydemengsel een gel vormt, verwarmt u een warmteblok voor op 85 graden Celsius.Meng vervolgens 700 microliter van de 25% BSA-oplossing met 700 microliter 37% formaldehyde. Meng goed door binnen vijf tot 10 seconden vijf keer op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te creëren. Plaats direct na het mengen de gesloten microcentrifugebuis in het warmteblok, voorverwarmd tot 85 graden Celsius.Verwijder na 10 minuten de buis uit het warmteblok. Laat het afkoelen en bevestig dat de gel zich heeft gevormd zoals verwacht. Bereid acht microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter voor en label deze duidelijk.Bereid vervolgens een 5x peptide stock oplossing, voeg een 12,5 millimolar concentratie toe door de volledige massa van het geliberaliseerde peptide te resuspenderen in 60 microliter van het juiste oplosmiddel. Observeer de oplossing om ervoor te zorgen dat het peptide volledig is opgelost. Voeg vervolgens een extra volume oplosmiddel toe als dat nodig is om een 12,5 millimolaire oplossing te maken volgens het molecuulgewicht, de massa en de zuiverheid van de peptiden.In dit voorbeeld heeft de 5x peptidevoorraad een eindvolume van 626,9 microliter. Andere peptidemonsters hebben een ander eindvolume nodig. Bereid vervolgens 150 microliter van een 1x peptide stock-oplossing voeg een 2,5 millimolar-concentratie toe door 30 microliter van de 5x peptidevoorraad te verdunnen in 120 microliter van het oplosmiddel.Vortex de oplossing gedurende vijf seconden en centrifugeer bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens 700 microliter van een 0,5 millimolaire peptide BSA-oplossing door 140 microliter van de 1x peptidevoorraad te verdunnen tot 560 microliter van de 31,3% BSA-oplossing. Na vortexing, centrifugeer de oplossing bij kamertemperatuur.Bereid op dezelfde manier vier opeenvolgende 10x seriële verdunning van de peptide BSA-voorraad door 70 microliter van de peptide BSA-oplossing toe te voegen aan 630 microliter van de 25% BSA-oplossing. Om de BSA-peptidegels te bereiden, voegt u 37% formaldehyde toe aan de peptide BSA-verdunningen in een één-op-één-verhouding die één monster tegelijk werkt. Meng goed door binnen vijf tot 10 seconden vijf keer op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te creëren.Plaats na het mengen de gesloten microcentrifugebuis gedurende 10 minuten in een hitteblok op 85 graden Celsius. Nadat alle peptide BSA- en formaldehyde-oplossingen zijn bereid en verwarmd, laat u de gels vijf tot 10 minuten afkoelen op de benchtop. Verwijder vervolgens met behulp van een schone, flexibele wegwerplaboratoriumspatel het gelmonster uit de microcentrifugebuis in één stuk.En plaats het in een verzegelde container met ten minste 15 milliliter neutraal gebufferd formaline, met behulp van een afzonderlijke container voor elk monster. Als alternatief, met behulp van een nieuw scheermesje met één rand, snijdt u de onderkant van de microcentrifugebuis af en duwt u de gel uit de bodem met lucht of een geschikte sonde. Trim met behulp van een schoon enkelzijdig scheermes de gelkegel in cilindrische schijven van ongeveer vijf millimeter dik.Nadat u de schijven in een biopsiewikkel hebt gewikkeld, plaatst u een grotere gelschijf in één cassette en de resterende gelschijven samen in een tweede cassette voor gebruik in weefselmicroarrayconstructie. Plaats de cassettegels voor het verwerken in ten minste 15 milliliter 10% neutraal gebufferd formaline per gel, met behulp van een afzonderlijke container voor elk monster. Verwerk vervolgens de gels in een geautomatiseerde histologie weefselprocessor volgens een groot weefselschema met druk en vacuüm.Wanneer de monsterverwerking is voltooid, verwijdert u de cassettes uit de weefselprocessor en verplaatst u ze naar het insluitcentrum van paraffine. Nadat u de gels uit de biopsiewikkel hebt uitgepakt, sluit u de gels in paraffine in of insluit elk monster één schijf gel in een kleine mal van 15 bij 15 millimeter. En de resterende gelschijven samen in een tweede grotere mal.Maak voor elke peptideverdunningsreeks twee glazen dia's met in totaal zes afzonderlijke secties. Eén sectie van elk van de vijf verdunningsreeksmonsters en één sectie van het BSA-monster met alleen negatieve controle. Na het snijden en drogen van de dia's, kleur de twee dia's die voor elk peptide zijn voorbereid met het gewenste primaire antilichaam.Volgens standaard Immunohistochemie protocollen verwachten een relatief uniform signaal binnen elke gel sectie. Waarbij de verschillende gelmonsters een bereik van signaalintensiteit vertonen dat overeenkomt met de peptideverdunningen. Snijd voor de BSA-gelweefselmicroarrayconstructie vier micrometer dikke delen van de weefselmicroarray en kleur met een konijnmononaal antilichaam volgens laboratoriumstandaardprotocollen.Beoordeel de resulterende vlekintensiteit kwalitatief door inspectie of koop kwantitatief digitale beeldscanning en -analyse. Na te hebben gereageerd met de juiste antilichamen, vertoonden negatieve controle BSA alleen gelmonsters een minimaal signaal. De signaalintensiteit in een individueel gelmonster is relatief uniform en neemt toe met toenemende antigeenconcentraties.Meer dan 10% van de MDA-MB-175 cellen vertonen zwakke en volledig omtrekkende vliezige kleuring. Daarentegen vertoont meer dan 10% van de SKBR-3-cellen intense volledig omtrekkende vliezige kleuring Werk snel zodra de formaldehyde is toegevoegd, omdat de oplossingen zelfs bij kamertemperatuur beginnen te gelen. We gebruiken deze methode om IHC-controles uit te voeren bij het testen van nieuwe antilichamen om ons het vertrouwen te geven dat de test presteerde zoals verwacht, zelfs wanneer de testantistoffen geen signaal vertonen.Weefsel- of cellijncontroles zijn inherent variabel. Synthetische antigeencontroles stellen ons in staat om het effect van het veranderen van specifieke ISD-reactieomstandigheden nauwkeuriger te meten.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Visual and Narrative Methods to Achieve Fair Process in Clinical Care

Met behulp van visuele en narratieve methoden om een ​​eerlijk proces te bereiken in de klinische zorg

The Institute of Medicine has targeted patient-centeredness as an important area of quality improvement. A major dimension of patient-centeredness is ...

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Modellering Stroke in Muizen - midden cerebrale slagader occlusie met de gloeidraad Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen

Verbetering van de apoptotische en autofagocytische Inductie door een nieuwe synthetische C-1-analoog van 7-deoxypancratistatin in de moedermelk Darmkanker en Neuroblastoom Cellen met Tamoxifen

Breast cancer is one of the most common cancers amongst women in North America. Many current anti-cancer treatments, including ionizing radiation, induce ...

Identification of Disease-related Spatial Covariance Patterns using Neuroimaging Data

Identificatie van ziekte-gerelateerde Ruimtelijke Covariantie Patronen gemaakt Neuroimaging gegevens

The scaled subprofile model (SSM)1-4 is a multivariate PCA-based algorithm that identifies major sources of variation in patient and control group brain ...

Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

Oplopend Aorta Vernauwing in ratten voor de schepping van druk overbelasting cardiale hypertrofie Model

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequentiële<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van Osteogeen Stam / progenitorcellen Tijdens Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Modeling and Simulations of Olfactory Drug Delivery with Passive and Active Controls of Nasally Inhaled Pharmaceutical Aerosols

Modellering en simulaties van olfactorische Drug Delivery met passieve en actieve controles van nasaal inhalatie medische aërosolen

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the ...

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Immunofluorescentie-etikettering van humane en Muriene neutrofiele extracellulaire vallen in paraffine-ingesloten weefsel

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

Implantatie van gecombineerde telemetrische ECG- en bloeddruktransmitters om spontane baroreflexgevoeligheid bij bewuste muizen te bepalen

Blood pressure (BP) and heart rate (HR) are both controlled by the autonomic nervous system (ANS) and are closely intertwined due to reflex mechanisms. ...