Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
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Les auteurs remercient leurs collègues Jeffrey Tom et Aimin Song pour la synthèse peptidique, Nianfeng Ge pour la construction de TMA, Shari Lau pour la coloration IHC, Melissa Edick pour le balayage microscopique numérique et Hai Ngu pour la quantification d’images numériques.

1. Préparation de la solution de stock et des outils
<ol><li>Préparer 20 mL d’une solution de BSA à 25 % p/v en mélangeant 5 g de poudre de BSA dans 14 mL de PBS, pH 7,2 dans un tube conique de 50 mL jusqu’à dispersion uniforme. Vortex si nécessaire pour disperser la poudre de BSA.<ol><li>Conserver la solution toute la nuit à 4 °C pour permettre une dissolution complète. Réglez le volume final à 20 mL avec PBS pour obtenir une solution mère de 25 % p/v.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer 20 mL d’une solu...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

Cette méthode permet à l’utilisateur de créer des échantillons uniformes de composition connue et de concentration d’antigènes comme normes dans les réactions IHC, en utilisant des matériaux et des techniques familiers à la plupart des laboratoires d’histologie. L’étape la plus cruciale consiste à identifier l’épitope auquel l’anticorps d’intérêt se lie. Ce protocole décrit l’utilisation d’un antigène peptidique linéaire de l’ICD ERBB2/HER2. Le même protocole peut être utilisé pour ...

L’immunohistochimie (IHC) permet la détection sensible et spécifique, spatialement précise, des antigènes cibles dans les coupes de tissus fixées au formol et incorporées à la paraffine (FFPE). Cependant, les résultats de la coloration IHC peuvent être affectés par de multiples variables, y compris le temps d’ischémie chaude et froide, la fixation des tissus, le prétraitement des tissus, la réactivité et la concentration d’anticorps, la chimie de détection des tests et les temps de réaction1. Par conséquent, la performance reproductible et l’interprétation des réactions IHC nécessitent un contrôle rigoureux de ces variables et l’utilisation d’échantillons témoins positifs et négatifs bien caractérisés. Les témoins fréquemment utilisés comprennent des tissus incorporés dans la paraffine ou des lignées cellulaires cultivées connues à partir d’analyses indépendantes pour exprimer l’antigène d’intérêt, mais de tels échantillons ne sont pas toujours disponibles1. De plus, les niveaux d’expression des antigènes cibles dans les tissus et les contrôles de lignées cellulaires ne sont généralement compris que qualitativement et peuvent être variables. Les témoins contenant des concentrations reproductibles et connues avec précision de l’antigène cible peuvent aider à optimiser les conditions de réaction de l’IHC. Une méthode générale, adaptable à une variété de types d’antigènes dans une gamme de concentrations physiologiquement pertinentes pour créer des échantillons synthétiques de contrôle IHC, a été décrite par les auteurs2. Un protocole détaillé est fourni ici pour la création et l’utilisation de ce type de norme.
Des contrôles appropriés sont essentiels pour l’interprétation valide des tests IHC 1,3,4. Des tissus, des cellules cultivées et des substrats enrobés de peptides ont été utilisés comme témoins IHC en fonction des besoins spécifiques des chercheurs. Les avantages et les limites inhérents à l’utilisation de tissus comme témoins IHC ont été largement discutés 1,4. Pour de nombreux anticorps, des témoins appropriés peuvent être choisis parmi des tissus normaux sélectionnés contenant des populations cellulaires exprimant l’antigène cible sur une large plage dynamique. Les témoins tissulaires sont moins appropriés lorsque l’antigène cible n’est pas bien caractérisé en ce qui concerne le site d’expression ou l’abondance, ou lorsque des antigènes à réaction croisée potentielle sont co-exprimés dans les mêmes cellules ou sites tissulaires. Dans ces contextes, des blocs de lignées cellulaires cultivées exprimant l’antigène d’intérêt peuvent être utiles. Pour fournir des preuves supplémentaires de la spécificité de la cible, les lignées cellulaires peuvent être conçues pour surexprimer ou sous-exprimer les antigènes cibles. Par exemple, une telle approche a récemment été utilisée pour évaluer une variété de tests anti--L1 à l’aide d’un microréseau tissulaire de lignées cellulaires isogéniques exprimant une gamme d’antigène-L15. Les limites pratiques à l’utilisation systématique des blocs de lignées cellulaires comprennent le coût et le temps nécessaires pour produire un nombre suffisant de cellules et le fait que l’expression de certains antigènes peut ne pas être cohérente de manière fiable, même au sein des lignées cellulaires clonales6. Les peptides synthétiques sont une troisième option pour les contrôles IHC pour les anticorps qui reconnaissent les épitopes linéaires courts. Steven Bogen et ses collègues ont publié de nombreux articles sur l’utilisation de peptides couplés à la surface des lames de verre 7,8 et des perles de verre9. Une étude de ce groupe a démontré que l’analyse quantitative des contrôles IHC à base de peptides pouvait détecter la variation du processus de coloration manquée par l’évaluation qualitative des contrôles tissulaires analysés en parallèle10. Bien que les normes utilisant des antigènes à base de billes puissent être largement applicables, de nombreux détails sont la propriété des auteurs, ce qui limite l’adoption généralisée.
Une autre approche des normes IHC incorpore des antigènes cibles dans des gels protéiques créés artificiellement. Ce concept a été démontré pour la première fois par Per Brandtzaeg en 1972 dans une étude dans laquelle le sérum de lapin normal a été polymérisé à l’aide de glutaraldéhyde11. De petits blocs du gel résultant ont ensuite été trempés pendant 1 à 4 semaines dans des solutions contenant les antigènes d’immunoglobulines d’intérêt à différentes concentrations. Après fixation de l’alcool et incorporation de paraffine, il a été démontré que des sections des témoins résultants se coloraient avec des intensités correspondant au logarithme des solutions antigéniques dans lesquelles elles avaient été trempées. Plus tard, les chercheurs ont préparé des conjugués de glutaraldéhyde d’acides aminés spécifiques dans des solutions diluées de BSA ou d’homogénat du cerveau comme témoins positifs dans des études de microscopie immuno-électronique12,13. Des travaux plus récents ont étudié l’utilisation de gels fabriqués à partir de solutions protéiques fixées au formaldéhyde comme substituts pour les tissus FFPE dans l’analyse par spectrométrie de masse14. Un autre travail récent a étudié la structure et les propriétés des gels formés en chauffant des solutions d’albumine sérique humaine ou bovine à diverses concentrations et pH15. Ces auteurs ont constaté que l’albumine sérique forme trois types de gels différant par leur élasticité mécanique, leur préservation de la structure secondaire et leur capacité de liaison aux acides gras en fonction des conditions expérimentales. Ensemble, ces documents démontrent la faisabilité générale de l’approche employée ici. Les solutions protéiques de composition définie créent des gels tissulaires qui peuvent être traités, sectionnés et colorés à l’aide de méthodes histologiques de routine.
Ce protocole décrit la formation d’un contrôle IHC synthétique fabriqué à partir d’albumine sérique bovine (BSA) polymérisée avec de la chaleur et du formaldéhyde. Les gels peuvent incorporer une grande variété d’antigènes, y compris des protéines pleine longueur, des domaines protéiques et des peptides linéaires, ainsi que des antigènes non protéiques, y compris des oligonucléotides2. Cette démonstration utilise un exemple d’antigène, un peptide linéaire codant pour les acides aminés C-terminal 16 de la protéine humaine ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (voir Tableau des matériaux). Cette séquence comprend les épitopes reconnus par trois anticorps disponibles dans le commerce et pertinents sur le plan diagnostique, y compris le réactif polyclonal Herceptest (ENPEYLGLDVP) et les anticorps monoclonaux CB11 (AENPEYL) et 4B5 (TAENPEYLGL) (voir tableau des matériaux)16.
La méthode démontrée ici utilise des réactifs facilement disponibles en utilisant des processus et des techniques familiers à tout laboratoire d’histologie en exercice. La limitation la plus importante est la nécessité d’identifier et d’acheter les antigènes cibles, ce qui peut être accompli dans de nombreux cas à un coût relativement modeste. Parce que ces contrôles synthétiques sont de composition entièrement définie et fabriqués avec des méthodes simples, ils peuvent être mis en œuvre dans de nombreux laboratoires avec des résultats reproductibles. Leur utilisation peut faciliter l’évaluation objective et quantifiable des résultats de coloration IHC et permettre une plus grande reproductibilité intra- et inter-laboratoires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

Les tests d’immunohistochimie (IHC) fournissent des informations précieuses sur les modèles d’expression des protéines, dont l’interprétation fiable nécessite des échantillons témoins positifs et négatifs bien caractérisés. Étant donné que les contrôles appropriés des tissus ou des lignées cellulaires ne sont pas toujours disponibles, une méthode simple pour créer des contrôles IHC synthétiques peut être bénéfique. Une telle méthode est décrite ici. Il est adaptable à divers types d’antigènes, y compris les protéines, les peptides ou les oligonucléotides, dans une large gamme de concentrations. Ce protocole explique les étapes nécessaires à la création de contrôles d’antigènes synthétiques, en utilisant comme exemple un peptide de l’oncogène érythroblastique humain B2 (ERBB2/HER2) domaine intracellulaire (DCI) reconnu par une variété d’anticorps pertinents sur le plan diagnostique. Les dilutions en série du peptide HER2 ICD dans une solution d’albumine sérique bovine (BSA) sont mélangées avec du formaldéhyde et chauffées pendant 10 min à 85 °C pour solidifier et réticuler le mélange peptide/BSA. Le gel résultant peut être traité, sectionné et coloré comme un tissu, produisant une série d’échantillons de concentrations d’antigènes connues couvrant un large éventail d’intensités de coloration.
Ce protocole simple est conforme aux procédures de laboratoire d’histologie de routine. La méthode exige seulement que l’utilisateur ait une quantité suffisante de l’antigène souhaité. Les protéines recombinantes, les domaines protéiques ou les peptides linéaires qui codent des épitopes pertinents peuvent être synthétisés localement ou commercialement. Les laboratoires générant des anticorps internes peuvent réserver des aliquotes de l’antigène immunisant comme cible de contrôle synthétique. La possibilité de créer des témoins positifs bien définis sur un large éventail de concentrations permet aux utilisateurs d’évaluer les performances des essais intra et interlaboratoires, de mieux comprendre la plage dynamique et la linéarité de leurs essais et d’optimiser les conditions d’essai pour leurs objectifs expérimentaux particuliers.

Les peptides doivent se dissoudre entièrement dans un solvant approprié à température ambiante pour former une solution optiquement claire. Si des particules visibles sont toujours présentes après 30 à 60 minutes, il peut être utile d’ajouter des volumes supplémentaires du solvant d’origine ou d’un solvant alternatif ne dépassant pas le volume prévu de la solution mère peptidique 5x calculée dans le tableau 1. De même, la solution combinée peptide/BSA doit rester translucide (<strong...

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Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

Ce travail documente une méthode simple pour créer des contrôles d’antigènes synthétiques pour l’immunohistochimie. La technique est adaptable à une variété d’antigènes dans une large gamme de concentrations. Les échantillons fournissent une référence pour évaluer la performance et la reproductibilité intra et inter-essais.

Contrôles d’antigènes synthétiques pour l’immunohistochimie

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

Les gels antigéniques BSA sont des normes IHC reproductibles bien caractérisées qui peuvent compléter les contrôles existants. Ce protocole utilise l’histologie standard et les réactifs IHC et des méthodes pour rendre reproductibles les étalons de composition connue. Ces contrôles permettent à différents laboratoires d’étalonner et de normaliser les tests IHC pour de nombreux tests pertinents sur le plan diagnostique.Il est important de trouver un solvant approprié pour dissoudre le peptide ou la protéine. Il peut être difficile de mélanger rapidement des solutions d’antigène et de formaldéhyde sans introduire de bulles. Pour commencer, préparez 20 millilitres d’une solution de BSA à 25% poids par volume en mélangeant cinq grammes de poudre BSA dans 14 millilitres de PBS, dans un tube conique de 50 millilitres jusqu’à ce qu’ils soient répartis uniformément.Vortex la solution pour dissoudre la poudre BSA. Gardez la solution toute la nuit à quatre degrés Celsius pour une dissolution complète. Le lendemain, réglez le volume final à 20 millilitres avec PBS.De même, préparer 20 millilitres d’une solution de BSA à 31,3% poids en volume en mélangeant 6,26 grammes de poudre BSA dans 13 millilitres de PBS. Après une incubation nocturne pour une dissolution complète, régler le volume final à 20 millilitres avec du PBS. Pour vérifier que le mélange de formaldéhyde BSA forme un gel, préchauffer un bloc de chaleur à 85 degrés Celsius.Mélangez ensuite 700 microlitres de la solution BSA à 25% avec 700 microlitres de formaldéhyde à 37%. Bien mélanger en pipetant de haut en bas cinq fois en cinq à 10 secondes sans créer de bulles d’air. Immédiatement après le mélange, placez le tube microcentrifuge fermé dans le bloc de chaleur préchauffé à 85 degrés Celsius.Après 10 minutes, retirez le tube du bloc de chaleur. Laissez-le refroidir et confirmez que le gel s’est formé comme prévu. Préparez et étiquetez clairement huit tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre.Préparez ensuite une solution mère de peptide 5x, ajoutez une concentration de 12,5 millimolaires en remettant en suspension toute la masse du peptide libéralisé dans 60 microlitres du solvant approprié. Observez la solution pour vous assurer que le peptide est complètement dissous. Ensuite, ajoutez un volume supplémentaire de solvant si nécessaire pour obtenir une solution de 12,5 millimolaires en fonction du poids moléculaire, de la masse et de la pureté des peptides.Dans cet exemple, le stock de peptides 5x a un volume final de 626,9 microlitres. D’autres échantillons de peptides nécessiteront un volume final différent. Ensuite, préparez 150 microlitres d’une solution mère de peptide 1x, ajoutez une concentration de 2,5 millimolaires en diluant 30 microlitres du stock de peptide 5x dans 120 microlitres du solvant.Vortex la solution pendant cinq secondes et centrifuger à température ambiante. Ensuite, préparez 700 microlitres d’une solution de BSA peptidique 0,5 millimolaire en diluant 140 microlitres du stock de peptide 1x dans 560 microlitres de la solution BSA à 31,3%. Après vortex, centrifuger la solution à température ambiante.De même, préparer quatre dilutions successives en série 10x du stock de peptide BSA en ajoutant 70 microlitres de la solution de peptide BSA à 630 microlitres de la solution BSA à 25%. Pour préparer les gels peptidiques BSA, ajouter 37% de formaldéhyde aux dilutions de peptide BSA dans un rapport un à un en travaillant un échantillon à la fois. Bien mélanger en pipetant de haut en bas cinq fois en cinq à 10 secondes sans créer de bulles d’air.Après mélange, placez le tube microcentrifuge fermé dans un bloc de chaleur à 85 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois que toutes les solutions peptidiques de BSA et de formaldéhyde ont été préparées et chauffées, laissez les gels refroidir sur la paillasse pendant cinq à 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une spatule de laboratoire jetable propre et flexible, retirez l’échantillon de gel du tube microcentrifuge en un seul morceau.Et placez-le dans un récipient scellé contenant au moins 15 millilitres de formol tamponné neutre, en utilisant un récipient séparé pour chaque échantillon. Alternativement, à l’aide d’une nouvelle lame de rasoir à simple tranchant, coupez le fond du tube microcentrifuge et poussez le gel hors du fond avec de l’air ou une sonde appropriée. À l’aide d’un rasoir à simple tranchant propre, coupez le cône de gel en disques cylindriques d’environ cinq millimètres d’épaisseur.Après avoir enveloppé les disques dans une enveloppe de biopsie, placez un disque de gel plus grand dans une cassette et les disques de gel restants ensemble dans une deuxième cassette pour une utilisation dans la construction de microréseaux tissulaires. Avant le traitement, placez les gels de cassette dans au moins 15 millilitres de formol tamponné neutre à 10% par gel, en utilisant un récipient séparé pour chaque échantillon. Ensuite, traitez les gels dans un processeur de tissus histologique automatisé en suivant un grand programme de tissus avec pression et vide.Lorsque le traitement de l’échantillon est terminé, retirez les cassettes du processeur de tissus et déplacez-les vers le centre d’enrobage de la paraffine. Après avoir déballé les gels de l’enveloppe de biopsie, incorporer les gels dans de la paraffine ou chaque échantillon incorporer un disque de gel dans un petit moule de 15 par 15 millimètres. Et les disques de gel restants ensemble dans un deuxième moule plus grand.Pour chaque série de dilution peptidique, créer deux lames de verre contenant un total de six sections distinctes. Une section de chacun des cinq échantillons de la série de dilutions et une section de l’échantillon témoin négatif BSA uniquement. Après avoir sectionné et séché les lames, colorer les deux lames préparées pour chaque peptide avec l’anticorps primaire souhaité.Selon les protocoles d’immunohistochimie standard, attendez-vous à voir un signal relativement uniforme dans chaque section de gel. Avec les différents échantillons de gel montrant une gamme d’intensité de signal correspondant aux dilutions peptidiques. Pour la construction du microréseau de tissus en gel BSA, couper des sections de quatre micromètres d’épaisseur du microréseau tissulaire et colorer avec un anticorps monoclonal de lapin conformément aux protocoles standard de laboratoire.Évaluez qualitativement l’intensité des taches résultantes par inspection ou achetez quantitativement la numérisation et l’analyse d’images numériques. Après avoir réagi avec les anticorps appropriés, les échantillons de gel BSA de contrôle négatif seulement ont montré un signal minimal. L’intensité du signal dans un échantillon de gel individuel est relativement uniforme et augmente avec l’augmentation des concentrations d’antigènes.Plus de 10% des cellules MDA-MB-175 présentent une coloration membraneuse faible et complètement circonférentielle. En revanche, plus de 10% des cellules SKBR-3 présentent une coloration membraneuse intense complètement circonférentielle Travailler rapidement une fois le formaldéhyde ajouté car les solutions commenceront à geler même à température ambiante. Nous utilisons cette méthode pour effectuer des contrôles IHC lors du test de nouveaux anticorps afin de nous donner confiance que le test a fonctionné comme prévu, même lorsque les anticorps testés ne montrent aucun signal.Les contrôles de tissus ou de lignées cellulaires sont intrinsèquement variables. Les contrôles d’antigènes synthétiques nous permettent de mesurer plus précisément l’effet de la modification de conditions de réaction ISD spécifiques.

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