Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
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Die Autoren danken ihren Kollegen Jeffrey Tom und Aimin Song für die Peptidsynthese, Nianfeng Ge für die TMA-Konstruktion, Shari Lau für die IHC-Färbung, Melissa Edick für das digitale mikroskopische Scannen und Hai Ngu für die digitale Bildquantifizierung.

1. Vorbereitung der Lagerlösung und der Werkzeuge
<ol><li>Bereiten Sie 20 ml einer 25% w/v BSA-Lösung vor, indem Sie 5 g BSA-Pulver in 14 ml PBS, pH 7,2 in einem 50 ml konischen Röhrchen mischen, bis es gleichmäßig dispergiert ist. Vortex nach Bedarf, um das BSA-Pulver zu dispergieren.<ol><li>Halten Sie die Lösung über Nacht bei 4 °C, um eine vollständige Auflösung zu ermöglichen. Stellen Sie das Endvolumen mit PBS auf 20 ml ein, um eine 25% w/v Lagerlösung zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie 20...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, einheitliche Proben der bekannten Zusammensetzung und Antigenkonzentration als Standards für IHC-Reaktionen zu erstellen, wobei Materialien und Techniken verwendet werden, die den meisten Histologielabors vertraut sind. Der wichtigste Schritt besteht darin, das Epitop zu identifizieren, an das der Antikörper von Interesse bindet. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines linearen Peptidantigens aus dem ERBB2/HER2-ICD. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um BSA-...

Die Immunhistochemie (IHC) ermöglicht den sensitiven und spezifischen, räumlich präzisen Nachweis von Zielantigenen in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten. Die Ergebnisse der IHC-Färbung können jedoch durch mehrere Variablen beeinflusst werden, einschließlich der warmen und kalten Ischämiezeit, der Gewebefixierung, der Gewebevorbehandlung, der Antikörperreaktivität und -konzentration, der Assay-Erkennungschemie und der Reaktionszeiten1. Dementsprechend erfordern die reproduzierbare Leistung und Interpretation von IHC-Reaktionen eine strenge Kontrolle dieser Variablen und die Verwendung gut charakterisierter positiver und negativer Kontrollproben. Zu den häufig verwendeten Kontrollen gehören in Paraffin eingebettete Gewebe oder kultivierte Zelllinien, von denen aus unabhängigen Analysen bekannt ist, dass sie das Antigen von Interesse ausdrücken, aber solche Proben sind nicht immer verfügbar1. Darüber hinaus werden die Expressionsniveaus der Zielantigene in Geweben und Zelllinienkontrollen im Allgemeinen nur qualitativ verstanden und können variabel sein. Kontrollen, die reproduzierbare, genau bekannte Konzentrationen von Zielantigen enthalten, können bei der Optimierung der IHC-Reaktionsbedingungen helfen. Eine allgemeine Methode, die an eine Vielzahl von Antigentypen in einem physiologisch relevanten Konzentrationsbereich angepasst werden kann, um synthetische IHC-Kontrollproben zu erzeugen, wurde von den Autorenbeschrieben 2. Für die Erstellung und Verwendung dieser Art von Standard wird hier ein detailliertes Protokoll bereitgestellt.
Geeignete Kontrollen sind für die gültige Interpretation der IHC-Assays 1,3,4 unerlässlich. Gewebe, kultivierte Zellen und peptidbeschichtete Substrate wurden als IHC-Kontrollen entsprechend den spezifischen Bedürfnissen der Forscher eingesetzt. Die Vorteile und Einschränkungen, die der Verwendung von Geweben als IHC-Kontrollen innewohnen, wurden ausführlich diskutiert 1,4. Für viele Antikörper können geeignete Kontrollen aus ausgewählten normalen Geweben ausgewählt werden, die Zellpopulationen enthalten, die das Zielantigen über einen weiten Dynamikbereich exprimieren. Gewebekontrollen sind weniger geeignet, wenn das Zielantigen hinsichtlich der Expressionsstelle oder -häufigkeit nicht gut charakterisiert ist oder wenn potenziell kreuzreagierende Antigene in denselben Zellen oder Gewebestellen koexprimiert werden. In diesen Kontexten können Blöcke von kultivierten Zelllinien, die das Antigen von Interesse ausdrücken, hilfreich sein. Um weitere Beweise für die Zielspezifität zu liefern, können Zelllinien so konstruiert werden, dass sie Zielantigene über- oder unterexprimieren. Zum Beispiel wurde ein solcher Ansatz kürzlich verwendet, um eine Vielzahl von Anti-PD-L1-Assays unter Verwendung eines Gewebe-Microarrays von isogenen Zelllinien zu bewerten, die eine Reihe von PD-L1-Antigen5 exprimieren. Zu den praktischen Einschränkungen bei der routinemäßigen Verwendung von Zelllinienblöcken gehören die Kosten und der Zeitaufwand für die Erzeugung ausreichender Zellzahlen und die Tatsache, dass die Expression einiger Antigene möglicherweise nicht zuverlässig konsistent ist, selbst innerhalb klonaler Zelllinien6. Synthetische Peptide sind eine dritte Option für IHC-Kontrollen für Antikörper, die kurze lineare Epitope erkennen. Steven Bogen und Kollegen haben ausführlich über die Verwendung von Peptiden publiziert, die an die Oberfläche von Objektträgern 7,8 und Glasperlen9 gekoppelt sind. Eine Studie dieser Gruppe zeigte, dass die quantitative Analyse von peptidbasierten IHC-Kontrollen die Variation des Färbeprozesses erkennen konnte, die bei der qualitativen Bewertung der parallel analysierten Gewebekontrollen übersehenwurde 10. Während Standards, die perlenbasierte Antigene verwenden, weit verbreitet sein könnten, sind viele Details Eigentum der Autoren, was die weit verbreitete Akzeptanz einschränkt.
Ein weiterer Ansatz für IHC-Standards integriert Zielantigene in künstlich hergestellte Proteingele. Dieses Konzept wurde erstmals1972 von Per Brandtzaeg in einer Studie demonstriert, in der normales Kaninchenserum mit Glutaraldehyd 11 polymerisiert wurde. Kleine Blöcke des resultierenden Gels wurden dann für 1-4 Wochen in Lösungen eingeweicht, die die Immunglobulin-Antigene von Interesse in verschiedenen Konzentrationen enthielten. Nach Alkoholfixierung und Paraffineinbettung wurde gezeigt, dass Abschnitte der resultierenden Kontrollen mit Intensitäten färbten, die dem Logarithmus der Antigenlösungen entsprachen, in denen sie eingeweicht worden waren. Später stellten die Forscher Glutaraldehyd-Konjugate spezifischer Aminosäuren in verdünnten BSA- oder Gehirnhomogenatlösungen als Positivkontrollen in Immunelektronenmikroskopie-Studienvor 12,13. Neuere Arbeiten untersuchten die Verwendung von Gelen aus formaldehydfixierten Proteinlösungen als Surrogate für FFPE-Gewebe in der Massenspektrometrie-Analyse14. Eine weitere neuere Arbeit untersuchte die Struktur und Eigenschaften von Gelen, die durch Erhitzen von menschlichen oder bovinen Serumalbuminlösungen bei verschiedenen Konzentrationen undpH-15 gebildet wurden. Diese Autoren fanden heraus, dass Serumalbumin drei Arten von Gelen bildet, die sich in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen in mechanischer Elastizität, Sekundärstrukturerhaltung und Fettsäurebindungsfähigkeit unterscheiden. Zusammen demonstrieren diese Papiere die allgemeine Machbarkeit des hier verwendeten Ansatzes. Proteinlösungen definierter Zusammensetzung erzeugen gewebeähnliche Gele, die mit histologischen Routinemethoden weiterverarbeitet, geschnitten und gefärbt werden können.
Dieses Protokoll beschreibt die Bildung einer synthetischen IHC-Kontrolle aus Rinderserumalbumin (BSA), das mit Hitze und Formaldehyd polymerisiert ist. Die Gele können eine Vielzahl von Antigenen enthalten, darunter Proteine in voller Länge, Proteindomänen und lineare Peptide sowie Nicht-Protein-Antigene einschließlich Oligonukleotide2. Diese Demonstration verwendet ein Beispielantigen, ein lineares Peptid, das für die C-terminalen 16 Aminosäuren des humanen ERBB2 (HER2/neu) Proteins TPTAENPEYLGLDVPV-COOH kodiert (siehe Materialtabelle). Diese Sequenz umfasst die Epitope, die von drei kommerziell erhältlichen, diagnostisch relevanten Antikörpern erkannt wurden, darunter das polyklonale Reagenz Herceptest (ENPEYLGLDVP) und die monoklonalen Antikörper CB11 (AENPEYL) und 4B5 (TAENPEYLGL) (siehe Materialtabelle)16.
Die hier demonstrierte Methode verwendet leicht verfügbare Reagenzien unter Verwendung von Prozessen und Techniken, die jedem praktizierenden Histologielabor vertraut sind. Die wichtigste Einschränkung ist die Notwendigkeit, die Zielantigene zu identifizieren und zu kaufen, was in vielen Fällen zu relativ geringen Kosten erreicht werden kann. Da diese synthetischen Kontrollen von vollständig definierter Zusammensetzung sind und mit einfachen Methoden hergestellt werden, können sie in vielen Labors mit reproduzierbaren Ergebnissen implementiert werden. Ihre Verwendung kann die objektive, quantifizierbare Bewertung der Ergebnisse der IHC-Färbung erleichtern und eine größere Reproduzierbarkeit innerhalb und zwischen den Labors ermöglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

Immunhistochemische (IHC) Assays liefern wertvolle Einblicke in Proteinexpressionsmuster, deren zuverlässige Interpretation gut charakterisierte positive und negative Kontrollproben erfordert. Da nicht immer geeignete Gewebe- oder Zelllinienkontrollen verfügbar sind, kann eine einfache Methode zur Erstellung synthetischer IHC-Kontrollen von Vorteil sein. Eine solche Methode wird hier beschrieben. Es ist anpassungsfähig an verschiedene Antigentypen, einschließlich Proteine, Peptide oder Oligonukleotide, in einem breiten Konzentrationsbereich. Dieses Protokoll erklärt die Schritte, die notwendig sind, um synthetische Antigenkontrollen zu erstellen, wobei als Beispiel ein Peptid aus der intrazellulären Domäne (ICD) des humanen erythroblastischen Onkogens B2 (ERBB2 / HER2) verwendet wird, das von einer Vielzahl von diagnostisch relevanten Antikörpern erkannt wird. Serielle Verdünnungen des HER2 ICD-Peptids in Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung werden mit Formaldehyd gemischt und 10 min bei 85 °C erhitzt, um das Peptid/BSA-Gemisch zu verfestigen und zu vernetzen. Das resultierende Gel kann wie ein Gewebe verarbeitet, geschnitten und gefärbt werden, was zu einer Reihe von Proben bekannter Antigenkonzentrationen führt, die einen weiten Bereich von Färbeintensitäten abdecken.
Dieses einfache Protokoll steht im Einklang mit routinemäßigen histologischen Laborverfahren. Die Methode erfordert lediglich, dass der Benutzer über eine ausreichende Menge des gewünschten Antigens verfügt. Rekombinante Proteine, Proteindomänen oder lineare Peptide, die für relevante Epitope kodieren, können lokal oder kommerziell synthetisiert werden. Labore, die hauseigene Antikörper erzeugen, können Aliquots des immunisierenden Antigens als synthetisches Kontrollziel reservieren. Die Möglichkeit, gut definierte Positivkontrollen für einen breiten Konzentrationsbereich zu erstellen, ermöglicht es Benutzern, die Leistung von Intra- und Inter-Laboratory-Assays zu bewerten, Einblicke in den Dynamikbereich und die Linearität ihrer Assays zu erhalten und die Assay-Bedingungen für ihre jeweiligen experimentellen Ziele zu optimieren.

Peptide sollten sich bei Raumtemperatur vollständig in einem geeigneten Lösungsmittel auflösen, um eine optisch klare Lösung zu bilden. Wenn nach 30-60 min noch sichtbares partikuläres Material vorhanden ist, kann es hilfreich sein, zusätzliche Volumina des ursprünglichen Lösungsmittels oder eines alternativen Lösungsmittels hinzuzufügen, das das beabsichtigte Volumen der in Tabelle 1 berechneten 5-fachen Peptidlagerlösung nicht überschreitet. Ebenso sollte die kombinierte Peptid/BSA-Lösung ...

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Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

Diese Arbeit dokumentiert eine einfache Methode zur Erstellung synthetischer Antigenkontrollen für die Immunhistochemie. Die Technik ist an eine Vielzahl von Antigenen in einem breiten Konzentrationsbereich anpassbar. Die Proben bieten eine Referenz zur Beurteilung der Intra- und Inter-Assay-Leistung und Reproduzierbarkeit.

Synthetische Antigenkontrollen für die Immunhistochemie

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

BSA-Antigengele sind gut charakterisierte reproduzierbare IHC-Standards, die bestehende Kontrollen ergänzen können. Dieses Protokoll verwendet Standardhistologie- und IHC-Reagenzien und -Methoden, um reproduzierbare Standards bekannter Zusammensetzung herzustellen. Diese Kontrollen bieten verschiedenen Laboren die Möglichkeit, IHC-Assays für viele diagnostisch relevante Assays zu kalibrieren und zu standardisieren.Es ist wichtig, ein geeignetes Lösungsmittel zu finden, um das Peptid oder Protein aufzulösen. Es kann schwierig sein, Antigen- und Formaldehydlösungen schnell zu mischen, ohne Blasen einzuführen. Um zu beginnen, bereiten Sie 20 Milliliter einer 25%igen BSA-Lösung vor, indem Sie fünf Gramm BSA-Pulver in 14 Milliliter PBS in einem 50-Milliliter-Konikuschen mischen, bis es gleichmäßig verteilt ist.Wirbeln Sie die Lösung zum Auflösen des BSA-Pulvers. Bewahren Sie die Lösung über Nacht bei vier Grad Celsius auf, um sie vollständig aufzulösen. Am nächsten Tag stellen Sie das Endvolumen mit PBS auf 20 Milliliter ein.In ähnlicher Weise werden 20 Milliliter einer BSA-Lösung mit 31,3 Volumenprozent hergestellt, indem 6,26 Gramm BSA-Pulver in 13 Milliliter PBS gemischt werden. Nach der Inkubation über Nacht zur vollständigen Auflösung das Endvolumen mit PBS auf 20 Milliliter einstellen. Um zu testen, ob die BSA-Formaldehydmischung ein Gel bildet, heizen Sie einen Heizblock auf 85 Grad Celsius vor.Mischen Sie dann 700 Mikroliter der 25%BSA-Lösung mit 700 Mikrolitern 37%Formaldehyd. Mischen Sie gut, indem Sie innerhalb von fünf bis 10 Sekunden fünfmal auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen zu erzeugen. Unmittelbar nach dem Mischen das geschlossene Mikrozentrifugenröhrchen in den auf 85 Grad Celsius vorgeheizten Heizblock legen.Nach 10 Minuten das Röhrchen aus dem Heizblock nehmen. Lassen Sie es abkühlen und bestätigen Sie, dass sich das Gel wie erwartet gebildet hat. Bereiten Sie acht 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor und kennzeichnen Sie sie deutlich.Dann bereiten Sie eine 5x Peptid-Stammlösung vor, fügen Sie eine Konzentration von 12,5 Millimolar hinzu, indem Sie die gesamte Masse des liberalisierten Peptids in 60 Mikroliter des entsprechenden Lösungsmittels resuspendieren. Beobachten Sie die Lösung, um sicherzustellen, dass das Peptid vollständig gelöst ist. Dann fügen Sie bei Bedarf ein zusätzliches Volumen Lösungsmittel hinzu, um eine 12,5-Millimolar-Lösung entsprechend dem Molekulargewicht, der Masse und der Reinheit der Peptide herzustellen.In diesem Beispiel hat der 5-fache Peptidbestand ein Endvolumen von 626,9 Mikrolitern. Andere Peptidproben benötigen ein anderes Endvolumen. Als nächstes bereiten Sie 150 Mikroliter einer 1x Peptidstammlösung vor, fügen Sie eine Konzentration von 2,5 Millimolar hinzu, indem Sie 30 Mikroliter des 5x-Peptidvorrats in 120 Mikroliter des Lösungsmittels verdünnen.Die Lösung fünf Sekunden lang durchwirbeln und bei Raumtemperatur zentrifugieren. Als nächstes bereiten Sie 700 Mikroliter einer 0,5 Millimolar Peptid-BSA-Lösung vor, indem Sie 140 Mikroliter des 1x-Peptidbestands in 560 Mikroliter der 31,3%igen BSA-Lösung verdünnen. Nach dem Vortexen die Lösung bei Raumtemperatur zentrifugieren.In ähnlicher Weise werden vier aufeinanderfolgende 10-fache serielle Verdünnungen des Peptid-BSA-Stocks hergestellt, indem 70 Mikroliter der Peptid-BSA-Lösung zu 630 Mikrolitern der 25%igen BSA-Lösung hinzugefügt werden. Um die BSA-Peptidgele herzustellen, fügen Sie den Peptid-BSA-Verdünnungen 37% Formaldehyd in einem Verhältnis von eins zu eins hinzu, wobei jeweils eine Probe bearbeitet wird. Mischen Sie gut, indem Sie innerhalb von fünf bis 10 Sekunden fünfmal auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen zu erzeugen.Nach dem Mischen das geschlossene Mikrozentrifugenröhrchen für 10 Minuten in einen Kühlblock bei 85 Grad Celsius legen. Nachdem alle Peptid-BSA- und Formaldehydlösungen vorbereitet und erhitzt wurden, lassen Sie die Gele fünf bis 10 Minuten auf der Tischplatte abkühlen. Als nächstes entfernen Sie die Gelprobe mit einem sauberen, flexiblen Einweg-Laborspatel in einem Stück aus dem Mikrozentrifugenröhrchen.Und legen Sie es in einen verschlossenen Behälter, der mindestens 15 Milliliter neutrales gepuffertes Formalin enthält, wobei für jede Probe ein separater Behälter verwendet wird. Alternativ können Sie mit einer neuen einschneidigen Rasierklinge den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens abschneiden und das Gel mit Luft oder einer geeigneten Sonde von unten herausdrücken. Mit einem sauberen einschneidigen Rasiermesser schneiden Sie den Gelkegel in zylindrische Scheiben von etwa fünf Millimetern Dicke.Nachdem Sie die Scheiben in eine Biopsiefolie gewickelt haben, legen Sie eine größere Gelscheibe in eine Kassette und die restlichen Gelscheiben zusammen in eine zweite Kassette zur Verwendung in der Gewebe-Microarray-Konstruktion. Vor der Verarbeitung legen Sie die Kassettengele in mindestens 15 Milliliter 10% neutrales gepuffertes Formalin pro Gel, wobei für jede Probe ein separater Behälter verwendet wird. Als nächstes verarbeiten Sie die Gele in einem automatisierten histologischen Gewebeprozessor nach einem großen Gewebeplan mit Druck und Vakuum.Wenn die Probenverarbeitung abgeschlossen ist, entnehmen Sie die Kassetten aus dem Gewebeprozessor und bringen Sie sie in das Paraffin-Einbettzentrum. Nachdem Sie die Gele aus der Biopsieverpackung ausgepackt haben, betten Sie die Gele in Paraffin ein oder betten Sie für jede Probe eine Gelscheibe in eine kleine 15 x 15 Millimeter große Form ein. Und die restlichen Gelscheiben zusammen in einer zweiten größeren Form.Erstellen Sie für jede Peptidverdünnungsserie zwei Objektträger mit insgesamt sechs separaten Abschnitten. Ein Abschnitt aus jeder der fünf Verdünnungsserienproben und ein Abschnitt aus der BSA-Negativkontrollprobe. Nach dem Schneiden und Trocknen der Objektträger die beiden Objektträger, die für jedes Peptid vorbereitet wurden, mit dem gewünschten primären Antikörper färben.Nach Standardprotokollen der Immunhistochemie erwarten Sie ein relativ gleichmäßiges Signal innerhalb jedes Gelabschnitts. Die verschiedenen Gelproben zeigen einen Bereich der Signalintensität, der den Peptidverdünnungen entspricht. Für die BSA-Gel-Gewebe-Microarray-Konstruktion schneiden Sie vier Mikrometer dicke Abschnitte des Gewebe-Microarrays ab und färben Sie sie mit einem monoklonalen Kaninchen-Antikörper gemäß Laborstandardprotokollen.Beurteilen Sie die resultierende Fleckenintensität qualitativ durch Inspektion oder kaufen Sie quantitativ digitales Scannen und Analysieren. Nach Reaktion mit den entsprechenden Antikörpern zeigten die BSA-Negativkontroll-BSA-Gelproben nur ein minimales Signal. Die Signalintensität in einer einzelnen Gelprobe ist relativ gleichmäßig und nimmt mit steigenden Antigenkonzentrationen zu.Mehr als 10% der MDA-MB-175-Zellen zeigen schwache und vollständig umlaufende membranöse Färbungen. Im Gegensatz dazu zeigen mehr als 10% der SKBR-3-Zellen eine intensive, vollständig umlaufende membranöse Färbung Arbeiten Sie schnell, sobald das Formaldehyd hinzugefügt wurde, da die Lösungen bereits bei Raumtemperatur zu gelieren beginnen. Wir verwenden diese Methode, um IHC-Kontrollen beim Testen neuer Antikörper durchzuführen, um uns die Sicherheit zu geben, dass der Assay wie erwartet funktioniert, auch wenn die Testantikörper kein Signal zeigen.Gewebe- oder Zelllinienkontrollen sind von Natur aus variabel. Synthetische Antigenkontrollen ermöglichen es uns, den Effekt von sich ändernden spezifischen ISD-Reaktionsbedingungen genauer zu messen.

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