Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

המחברים מודים לעמיתיהם ג'פרי טום ואימין סונג על סינתזת פפטידים, ל-Nianfeng Ge על בניית TMA, לשרי לאו על צביעת IHC, למליסה אדיק על סריקה מיקרוסקופית דיגיטלית, ול-Hai Ngu על כימות תמונה דיגיטלית.

1. הכנת תמיסת מלאי וכלים
<ol><li>הכן 20 מ"ל של תמיסת BSA של 25% w/v על ידי ערבוב אבקת BSA 5 גרם ב-14 מ"ל של PBS, pH 7.2 בצינור חרוטי של 50 מ"ל עד לפיזור שווה. מערבולת לפי הצורך כדי לפזר את אבקת ה-BSA.<ol><li>שמור את הפתרון למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר פירוק מלא. התאם את עוצמת הקול הסופית ל- 20 מ"ל עם PBS כ?...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור דגימות אחידות של הרכב ידוע וריכוז אנטיגן כסטנדרטים בתגובות IHC, תוך שימוש בחומרים ובטכניקות המוכרות לרוב מעבדות ההיסטולוגיה. הצעד המכריע ביותר הוא לזהות את האפיטופ שאליו נקשר הנוגדן בעל העניין. פרוטוקול זה מתאר שימוש באנטיגן פפטידי ליניארי מ-ERBB2/HER2 ICD. ניתן להשתמ...

אימונוהיסטוכימיה (IHC) מאפשרת זיהוי רגיש וספציפי ומדויק מרחבית של אנטיגנים מטרה בקטעי רקמות קבועים פורמלין, משובצי פרפין (FFPE). עם זאת, תוצאות צביעת IHC עשויות להיות מושפעות ממשתנים מרובים, כולל זמן איסכמיה חם וקר, קיבוע רקמות, טיפול מקדים ברקמות, תגובתיות וריכוז נוגדנים, כימיה של זיהוי בדיקה וזמני תגובה1. לפיכך, ביצועים ופרשנות הניתנים לשחזור של תגובות IHC דורשים שליטה קפדנית במשתנים אלה ושימוש בדגימות בקרה חיוביות ושליליות מאופיינות היטב. בקרות נפוצות כוללות רקמות משובצות פרפין או קווי תאים בתרבית הידועים מניתוחים עצמאיים כדי להביע את האנטיגן המעניין, אך דגימות כאלה לא תמיד זמינות1. יתר על כן, רמות הביטוי של אנטיגני המטרה ברקמות ובקרות קו התא מובנות בדרך כלל רק באופן איכותי ועשויות להיות משתנות. בקרות המכילות ריכוזים ידועים וידועים במדויק של אנטיגן מטרה יכולות לסייע באופטימיזציה של תנאי תגובת IHC. שיטה כללית, הניתנת להתאמה למגוון סוגי אנטיגנים בטווח ריכוזים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ליצירת דגימות בקרת IHC סינתטיות, תוארה על ידי המחברים2. פרוטוקול מפורט מסופק כאן ליצירה ושימוש בסוג זה של תקן.
בקרות מתאימות חיוניות לפרשנות תקפה של מבחני IHC 1,3,4. רקמות, תאים בתרבית ומצעים מצופים פפטידים שימשו כבקרות IHC בהתאם לצרכים הספציפיים של החוקרים. היתרונות והמגבלות הטמונים בשימוש ברקמות כבקרות IHC נדונו בהרחבה 1,4. עבור נוגדנים רבים, ניתן לבחור בקרות מתאימות מתוך רקמות נורמליות נבחרות המכילות אוכלוסיות תאים המבטאות את אנטיגן המטרה על פני טווח דינמי רחב. בקרות רקמות מתאימות פחות כאשר אנטיגן המטרה אינו מאופיין היטב לגבי אתר ביטוי או שפע, או כאשר אנטיגנים בעלי פוטנציאל לתגובה צולבת מתבטאים יחד באותם תאים או אתרי רקמה. בהקשרים אלה, בלוקים של קווי תאים בתרבית המבטאים את האנטיגן המעניין יכולים להיות מועילים. כדי לספק ראיות נוספות לספציפיות המטרה, ניתן להנדס את קווי התאים כך שאנטיגנים בעלי ביטוי יתר או תת-ביטוי. לדוגמה, גישה כזו שימשה לאחרונה להערכת מגוון של בדיקות נגד PD-L1 באמצעות מיקרו-מערך רקמה של קווי תאים איזוגניים המבטאים טווח של אנטיגן PD-L15. המגבלות המעשיות לשימוש השגרתי בבלוקים של קווי תאים כוללות את העלות והזמן הדרושים כדי לייצר מספרי תאים מספיקים ואת העובדה שהביטוי של אנטיגנים מסוימים עשוי שלא להיות עקבי באופן אמין, אפילו בתוך שורות תאי קלונל6. פפטידים סינתטיים הם אפשרות שלישית לבקרת IHC עבור נוגדנים המזהים אפיטופים ליניאריים קצרים. סטיבן בוגן ועמיתיו פרסמו בהרחבה על השימוש בפפטידים המוצמדים לפני השטח של שקופיות זכוכית 7,8 וחרוזי זכוכית9. מחקר אחד של קבוצה זו הראה כי ניתוח כמותי של בקרות IHC מבוססות פפטידים יכול לזהות שונות בתהליך הכתם שהוחמצה על ידי הערכה איכותית של בקרות רקמות שנותחו במקביל10. בעוד שתקנים המשתמשים באנטיגנים מבוססי חרוזים יכולים להיות ישימים באופן נרחב, פרטים רבים הם קנייניים עבור המחברים, ומגבילים אימוץ נרחב.
גישה נוספת לתקני IHC משלבת אנטיגנים ממוקדים בג'לים חלבוניים שנוצרו באופן מלאכותי. תפיסה זו הודגמה לראשונה על ידי פר ברנדצאג בשנת 1972 במחקר שבו סרום ארנבים רגיל עבר פולימריזציה באמצעות גלוטרלדהיד11. בלוקים קטנים של הג'ל שנוצר הושרו לאחר מכן במשך 1-4 שבועות בתמיסות המכילות את האנטיגנים האימונוגלובולינים המעניינים בריכוזים שונים. לאחר קיבוע אלכוהול והטבעת פרפין, חלקים מהפקדים שהתקבלו הוכתמו בעוצמות המתאימות ללוגריתם של תמיסות האנטיגן שבהן הושרו. מאוחר יותר, החוקרים הכינו צמדי גלוטארלדהיד של חומצות אמינו ספציפיות ב-BSA מדולל או בתמיסות הומוגנטיות במוח כבקרות חיוביות במחקרי מיקרוסקופיה חיסונית-אלקטרונית 12,13. עבודה עדכנית יותר בחנה את השימוש בג'לים העשויים מתמיסות חלבון קבועות פורמלדהיד כפונדקאיות עבור רקמת FFPE בניתוח ספקטרומטריית מסה14. עבודה נוספת שנערכה לאחרונה בחנה את המבנה והתכונות של ג'לים הנוצרים על ידי חימום תמיסות אלבומין בסרום אנושי או בקר בריכוזים שונים וב-pH15. מחברים אלה מצאו כי אלבומין בסרום יוצר שלושה סוגים של ג'לים הנבדלים זה מזה באלסטיות מכנית, בשימור מבנה משני וביכולת קשירת חומצות שומן בהתאם לתנאי הניסוי. יחד, מאמרים אלה מדגימים את ההיתכנות הכללית של הגישה הנהוגה כאן. תמיסות חלבונים בעלות הרכב מוגדר יוצרות ג'לים דמויי רקמה הניתנים לעיבוד, חתך והכתמה נוספים בשיטות היסטולוגיות שגרתיות.
פרוטוקול זה מתאר את היווצרותה של בקרת IHC סינתטית העשויה מאלבומין בסרום בקר (BSA) שעבר פולימריזציה בחום ובפורמלדהיד. הג'לים יכולים לשלב מגוון רחב של אנטיגנים, כולל חלבונים באורך מלא, תחומי חלבונים ופפטידים ליניאריים, כמו גם אנטיגנים שאינם חלבונים כולל אוליגונוקלאוטידים2. הדגמה זו משתמשת באנטיגן לדוגמה, פפטיד ליניארי המקודד את חומצות האמינו C-terminal 16 של חלבון ERBB2 (HER2/neu) האנושי TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (ראו טבלת חומרים). רצף זה כולל את האפיטופים המוכרים על ידי שלושה נוגדנים זמינים מסחרית ורלוונטיים מבחינה אבחנתית, כולל המגיב הפוליקלונלי הרצפטי ביותר (ENPEYLGLDVP) והנוגדנים החד-שבטיים CB11 (AENPEYL) ו-4B5 (TAENPEYLGL) (ראו טבלת חומרים)16.
השיטה המודגמת כאן משתמשת בריאים בריאים בריאים ריאגנטים באמצעות תהליכים וטכניקות המוכרות לכל מעבדה היסטולוגית מתאמנת. המגבלה המשמעותית ביותר היא הצורך לזהות ולרכוש את האנטיגנים של היעד, דבר שניתן להשיג במקרים רבים בעלות צנועה יחסית. מכיוון שבקרות סינתטיות אלה הן בעלות הרכב מוגדר לחלוטין ועשויות בשיטות פשוטות, ניתן ליישם אותן במעבדות רבות עם תוצאות הניתנות לשחזור. השימוש בהם עשוי להקל על הערכה אובייקטיבית וניתנת לכימות של תוצאות צביעת IHC ולאפשר יכולת שכפול תוך-מעבדתית ובין-מעבדתית גדולה יותר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

מבחני אימונוהיסטוכימיה (IHC) מספקים תובנות חשובות על דפוסי ביטוי חלבונים, שהפרשנות המהימנה שלהם דורשת דגימות בקרה חיוביות ושליליות מאופיינות היטב. מאחר שפקדי רקמות או קו תאים מתאימים אינם תמיד זמינים, שיטה פשוטה ליצירת בקרות IHC סינתטיות עשויה להועיל. שיטה כזו מתוארת כאן. הוא ניתן להתאמה לסוגי אנטיגנים שונים, כולל חלבונים, פפטידים או אוליגונוקלאוטידים, במגוון רחב של ריכוזים. פרוטוקול זה מסביר את השלבים הדרושים ליצירת בקרות אנטיגן סינתטיות, תוך שימוש כדוגמה בפפטיד מהתחום התוך-תאי של אונקוגן אריתרובלסטי אנושי B2 (ERBB2/HER2) (ICD) המוכר על ידי מגוון נוגדנים רלוונטיים מבחינה אבחנתית. דילולים סדרתיים של פפטיד HER2 ICD בתמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) מעורבבים עם פורמלדהיד ומחוממים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס כדי להתמצק ולקשר את תערובת הפפטיד/BSA. ניתן לעבד, לחתוך ולהכתים את הג'ל שנוצר כמו רקמה, ולהניב סדרה של דגימות של ריכוזי אנטיגן ידועים המשתרעים על פני מגוון רחב של עוצמות צביעה.
פרוטוקול פשוט זה עולה בקנה אחד עם נהלי מעבדה היסטולוגיים שגרתיים. השיטה דורשת רק שלמשתמש תהיה כמות מספקת של האנטיגן הרצוי. חלבונים רקומביננטיים, תחומי חלבונים או פפטידים ליניאריים המקודדים אפיטופים רלוונטיים עשויים להיות מסונתזים באופן מקומי או מסחרי. מעבדות המייצרות נוגדנים פנימיים יכולות לשריין אליקוטים של האנטיגן המחסן כמטרה להדברה סינתטית. ההזדמנות ליצור בקרות חיוביות מוגדרות היטב במגוון רחב של ריכוזים מאפשרת למשתמשים להעריך את ביצועי הבדיקה התוך-מעבדתית והבין-מעבדתית, לקבל תובנה לגבי הטווח הדינמי והלינאריות של הבדיקות שלהם, ולמטב את תנאי הבדיקה למטרות הניסוי הספציפיות שלהם.

פפטידים צריכים להתמוסס לחלוטין בממס מתאים בטמפרטורת החדר כדי ליצור פתרון ברור אופטית. אם חומר חלקיקי נראה לעין עדיין קיים לאחר 30-60 דקות, ייתכן שיהיה זה מועיל להוסיף נפחים נוספים של הממס המקורי או ממס חלופי שאינו עולה על הנפח המיועד של תמיסת מלאי הפפטידים 5x המחושבת בטבלה 1. באופן דו...

Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

עבודה זו מתעדת שיטה פשוטה ליצירת בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה. הטכניקה ניתנת להתאמה למגוון אנטיגנים במגוון רחב של ריכוזים. הדוגמאות מספקות אסמכתא שבאמצעותה ניתן להעריך את הביצועים ויכולת השכפול של בדיקות תוך ובין בדיקות.

בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

ג'ל אנטיגן BSA מאופיין היטב בתקני IHC הניתנים לשחזור שיכולים להשלים את הבקרות הקיימות. פרוטוקול זה משתמש בהיסטולוגיה סטנדרטית ובריאגנטים של IHC ובשיטות כדי ליצור סטנדרטים הניתנים לשחזור של הרכב ידוע. בקרות אלה מספקות הזדמנות למעבדות שונות לכייל ולתקנן מבחני IHC עבור מבחנים רלוונטיים רבים מבחינה אבחנתית.חשוב למצוא ממס מתאים להמסת הפפטיד או החלבון. זה יכול להיות מסובך לערבב תמיסות אנטיגן ופורמלדהיד במהירות מבלי להציג בועות. כדי להתחיל, להכין 20 מיליליטר של 25% משקל לפי נפח BSA פתרון על ידי ערבוב חמישה גרם של אבקת BSA ב 14 מיליליטר של PBS, בצינור חרוטי 50 מיליליטר עד לפיזור שווה.מערבבים את התמיסה להמסת אבקת BSA. שמור את התמיסה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לפירוק מלא. למחרת, התאם את הנפח הסופי ל -20 מיליליטר עם PBS.באופן דומה, הכינו 20 מיליליטר של תמיסת BSA במשקל 31.3% לפי נפח על ידי ערבוב 6.26 גרם אבקת BSA ב-13 מיליליטר של PBS. לאחר דגירה של לילה לפירוק מלא, התאם את הנפח הסופי ל -20 מיליליטר עם PBS. כדי לבדוק כי תערובת פורמלדהיד BSA יוצרת ג'ל, לחמם בלוק חום ל 85 מעלות צלזיוס.לאחר מכן ערבבו 700 מיקרוליטרים של תמיסה של 25% BSA עם 700 מיקרוליטרים של 37% פורמלדהיד. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים תוך חמש עד עשר שניות מבלי ליצור בועות אוויר. מיד לאחר הערבוב, מניחים את צינור המיקרו-צנטריפוגה הסגור בבלוק החום שחומם מראש ל-85 מעלות צלזיוס.לאחר 10 דקות, הסר את הצינור מגוש החום. תן לו להתקרר ולאשר כי הג'ל נוצר כצפוי. הכן ותייג בבירור שמונה צינורות מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.לאחר מכן להכין תמיסת מלאי פפטיד 5x, להוסיף ריכוז 12.5 מילימולר על ידי החייאת כל המסה של פפטיד ליברליזציה ב 60 microliters של הממס המתאים. שים לב לפתרון כדי להבטיח כי הפפטיד מומס לחלוטין. לאחר מכן הוסיפו נפח נוסף של ממס לפי הצורך כדי ליצור תמיסה של 12.5 מילימולאר בהתאם למשקל המולקולרי של הפפטידים, למסה ולטוהר.בדוגמה זו, למלאי הפפטידים 5x יש נפח סופי של 626.9 מיקרוליטרים. דגימות פפטידים אחרות ידרשו נפח סופי שונה. לאחר מכן, הכינו 150 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי פפטידים 1x הוסיפו ריכוז של 2.5 מילימולאר על ידי דילול 30 מיקרוליטרים של מלאי הפפטידים 5x ל-120 מיקרוליטרים של הממס.מערבבים את התמיסה במשך חמש שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו 700 מיקרוליטרים של תמיסת BSA פפטידית 0.5 מילימולרית על ידי דילול 140 מיקרוליטרים של מלאי הפפטידים 1x ל-560 מיקרוליטרים של תמיסת BSA של 31.3%. לאחר מערבולת, צנטריפוגה של התמיסה בטמפרטורת החדר.באופן דומה, הכן ארבעה דילול סדרתי רציף של פי 10 של מלאי BSA הפפטידי על ידי הוספת 70 מיקרוליטרים של תמיסת BSA הפפטידית ל-630 מיקרוליטר של תמיסת BSA של 25%. כדי להכין את ג'ל הפפטיד BSA, הוסיפו 37% פורמלדהיד לדילולי BSA הפפטידיים ביחס של אחד לאחד העובדים בדגימה אחת בכל פעם. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים תוך חמש עד עשר שניות מבלי ליצור בועות אוויר.לאחר הערבוב, מניחים את צינור המיקרו-צנטריפוגה הסגור בבלוק חום בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר שכל תמיסות הפפטיד BSA והפורמלדהיד הוכנו וחוממו, אפשרו לג'לים להתקרר על הספסל במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות מרית מעבדה חד פעמית נקייה וגמישה, הסר את דגימת הג'ל מצינור המיקרו-צנטריפוגה בחתיכה אחת.ומניחים אותו במיכל אטום המכיל לפחות 15 מיליליטר של פורמלין חוצץ נייטרלי, באמצעות מיכל נפרד עבור כל דגימה. לחלופין, באמצעות סכין גילוח חדש בעל קצה יחיד, חתכו את החלק התחתון של שפופרת המיקרו-צנטריפוגה ודחפו את הג'ל החוצה מלמטה באמצעות אוויר או בדיקה מתאימה. בעזרת סכין גילוח נקי בעל קצה אחד חותכים את חרוט הג'ל לדיסקים גליליים בעובי של כחמישה מילימטרים.לאחר עטיפת הדיסקים בעטיפת ביופסיה, מניחים דיסק ג'ל אחד גדול יותר לתוך קלטת אחת ואת דיסקיות הג'ל הנותרות יחד לתוך קלטת שנייה לשימוש בבניית מיקרו-מערך רקמות. לפני העיבוד, מניחים את ג'ל הקלטת בלפחות 15 מיליליטר של 10% פורמלין חוצץ ניטרלי לכל ג'ל, באמצעות מיכל נפרד עבור כל דגימה. לאחר מכן, לעבד את הג'לים במעבד רקמות היסטולוגיה אוטומטי לאחר לוח זמנים של רקמות גדולות עם לחץ ואקום.לאחר השלמת עיבוד הדגימה, הסר את הקלטות ממעבד הרקמות והעבר אותן למרכז ההטבעה של הפרפין. לאחר הסרת הג'לים ממעטפת הביופסיה, הטמיעו את הג'לים בפרפין או כל דגימה הטמיעו דיסק אחד של ג'ל בתבנית קטנה של 15 על 15 מילימטר. ואת דיסקיות ג'ל הנותרים יחד בתבנית שנייה גדולה יותר.עבור כל סדרת דילול פפטידים, צור שתי שקופיות זכוכית המכילות בסך הכל שישה חלקים נפרדים. מקטע אחד מכל אחת מחמש דגימות סדרת הדילול ומקטע אחד מדגימת הבקרה השלילית של BSA בלבד. לאחר החלוקה וייבוש השקופיות, צבעו את שתי השקופיות שהוכנו לכל פפטיד בנוגדן הראשוני הרצוי.על פי פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים מצפים לראות אות אחיד יחסית בתוך כל מקטע ג'ל. עם דגימות הג'ל השונות המציגות טווח של עוצמת אות המתאימה לדילולים הפפטידיים. עבור בניית מיקרו-מערך רקמת ג'ל BSA, חותכים חתכים חתכים בעובי ארבעה מיקרומטר של מיקרו-מערך הרקמה ומכתימים בנוגדן חד שבטי ארנב על פי פרוטוקולים סטנדרטיים של המעבדה.הערך את עוצמת הכתם המתקבלת באופן איכותי על ידי בדיקה או קנה כמותית סריקה וניתוח של תמונות דיגיטליות. לאחר תגובה עם הנוגדנים המתאימים, שליטה שלילית BSA רק דגימות ג'ל הראו אות מינימלי. עוצמת האות בדגימת ג'ל בודדת היא אחידה יחסית ועולה עם העלייה בריכוזי האנטיגן.יותר מ-10% מתאי MDA-MB-175 מראים כתמים קלושים ובהיקף מלא. לעומת זאת, יותר מ -10% מתאי SKBR-3, מראים צביעה ממברנית אינטנסיבית היקפית לחלוטין עבודה מהירה לאחר הוספת הפורמלדהיד מכיוון שהתמיסות יתחילו לג'ל גם בטמפרטורת החדר. אנו משתמשים בשיטה זו כדי ליצור בקרות IHC בעת בדיקת נוגדנים חדשים כדי לתת לנו ביטחון שהבדיקה תבוצע כצפוי, גם כאשר נוגדני הבדיקה אינם מראים אות.בקרות רקמות או קווי תאים משתנות מטבען. בקרות אנטיגן סינתטיות מאפשרות לנו למדוד את ההשפעה של שינוי תנאי תגובת ISD ספציפיים בצורה מדויקת יותר.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Visual and Narrative Methods to Achieve Fair Process in Clinical Care

באמצעות שיטות חזותית הנרטיב להשגת הליך הוגן בטיפול קליני

The Institute of Medicine has targeted patient-centeredness as an important area of quality improvement. A major dimension of patient-centeredness is ...

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

דוגמנות שבץ בעכברים - העורקים התיכון ספיגה מוחין עם דגם נימה

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen

שיפור האינדוקציה אפופטוטיים, Autophagic ידי אנלוגי רומן סינתטי C-1 של deoxypancratistatin-7 ב אדנוקרצינומה השד האדם תאים neuroblastoma עם טמוקסיפן

Breast cancer is one of the most common cancers amongst women in North America. Many current anti-cancer treatments, including ionizing radiation, induce ...

Identification of Disease-related Spatial Covariance Patterns using Neuroimaging Data

זיהוי של דפוסי שונות משותפת מרחביים הקשורות למחלה באמצעות נתונים הדמייה

The scaled subprofile model (SSM)1-4 is a multivariate PCA-based algorithm that identifies major sources of variation in patient and control group brain ...

Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

עולה אבי העורקים תעוקה בחולדות ליצירת עומס יתר לחץ לב היפרטרופיה הדגם

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Modeling and Simulations of Olfactory Drug Delivery with Passive and Active Controls of Nasally Inhaled Pharmaceutical Aerosols

מודלים וסימולציות של החדרת תרופות חוש ריח באמצעות בקרה פסיבית ואקטיבית של אירוסולים תרופות בשאיפת nasally

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the ...

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

אימונוהיסטוכימיה כמותית של Microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

השתלת משדרי אק"ג ולחץ דם טלמטריים משולבים לקביעת רגישות ספונטנית לברפלקס בעכברים מודעים

Blood pressure (BP) and heart rate (HR) are both controlled by the autonomic nervous system (ANS) and are closely intertwined due to reflex mechanisms. ...