Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
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लेखक कृतज्ञतापूर्वक पेप्टाइड संश्लेषण के लिए अपने सहयोगियों जेफरी टॉम और एमिन सॉन्ग, टीएमए निर्माण के लिए नियांफेंग जीई, आईएचसी धुंधला के लिए शारी लाउ, डिजिटल माइक्रोस्कोपिक स्कैनिंग के लिए मेलिसा एडिक और डिजिटल छवि परिमाणीकरण के लिए हाई एनगु को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।

1. स्टॉक समाधान और उपकरणों की तैयारी
<ol><li>वी बीएसए समाधान के 20 एमएल को पीबीएस के 14 एमएल में 5 ग्राम बीएसए पाउडर, 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पीएच 7.2 मिलाकर समान रूप से फैलाए जाने तक तैयार करें। बीएसए पाउडर को फ?...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

यह विधि उपयोगकर्ता को अधिकांश ऊतक विज्ञान प्रयोगशालाओं से परिचित सामग्रियों और तकनीकों का उपयोग करके, आईएचसी प्रतिक्रियाओं में मानकों के रूप में ज्ञात संरचना और एंटीजन एकाग्रता के समान नमूने बनाने ?...

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक वर्गों में लक्ष्य एंटीजन के संवेदनशील और विशिष्ट, स्थानिक रूप से सटीक पता लगाने की अनुमति देता है। हालांकि, आईएचसी धुंधला परिणाम कई चर से प्रभावित हो सकते हैं, जिसमें गर्म और ठंडे इस्किमिया समय, ऊतक निर्धारण, ऊतक प्रीट्रीटमेंट, एंटीबॉडी प्रतिक्रियाशीलता और एकाग्रता, परख का पता लगाने रसायन विज्ञान और प्रतिक्रिया समय1 शामिल हैं। तदनुसार, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रदर्शन और आईएचसी प्रतिक्रियाओं की व्याख्या के लिए इन चरों के कठोर नियंत्रण और अच्छी तरह से विशेषता वाले सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नमूनों के उपयोग की आवश्यकता होती है। अक्सर उपयोग किए जाने वाले नियंत्रणों में पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक या सुसंस्कृत सेल लाइनें शामिल होती हैं जिन्हें ब्याज के एंटीजन को व्यक्त करने के लिए स्वतंत्र विश्लेषण से जाना जाता है, लेकिन ऐसे नमूने हमेशा उपलब्ध नहीं होते हैं1. इसके अलावा, ऊतकों और सेल लाइन नियंत्रणों में लक्ष्य एंटीजन की अभिव्यक्ति का स्तर आमतौर पर केवल गुणात्मक रूप से समझा जाता है और परिवर्तनशील हो सकता है। लक्ष्य प्रतिजन के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, ठीक ज्ञात सांद्रता वाले नियंत्रण आईएचसी प्रतिक्रिया स्थितियों के अनुकूलन में सहायता कर सकते हैं। सिंथेटिक आईएचसी नियंत्रण नमूने बनाने के लिए सांद्रता की शारीरिक रूप से प्रासंगिक सीमा में विभिन्न प्रकार के एंटीजन प्रकारों के अनुकूल एक सामान्य विधि, लेखकों द्वारा वर्णित की गई है2. इस प्रकार के मानक के निर्माण और उपयोग के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है।
आईएचसी परख 1,3,4 की वैध व्याख्या के लिए उपयुक्त नियंत्रण आवश्यक हैं। ऊतकों, सुसंस्कृत कोशिकाओं और पेप्टाइड-लेपित सब्सट्रेट को जांचकर्ताओं की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार आईएचसी नियंत्रण के रूप में नियोजित किया गया है। आईएचसी नियंत्रण के रूप में ऊतकों का उपयोग करने में निहित फायदे और सीमाओं पर बड़े पैमाने पर चर्चा की गई है 1,4. कई एंटीबॉडी के लिए, एक विस्तृत गतिशील रेंज पर लक्ष्य एंटीजन व्यक्त सेल आबादी युक्त चयनित सामान्य ऊतकों से उचित नियंत्रण चुना जा सकता है। ऊतक नियंत्रण कम उपयुक्त होते हैं जब लक्ष्य एंटीजन अभिव्यक्ति साइट या बहुतायत के विषय में अच्छी तरह से विशेषता नहीं होती है, या जब संभावित क्रॉस-रिएक्टिंग एंटीजन एक ही कोशिकाओं या ऊतक साइटों में सह-व्यक्त किए जाते हैं। इन संदर्भों में, ब्याज के एंटीजन को व्यक्त करने वाली सुसंस्कृत सेल लाइनों के ब्लॉक सहायक हो सकते हैं। लक्ष्य विशिष्टता के और सबूत प्रदान करने के लिए, सेल लाइनों को ओवर-या अंडर-एक्सप्रेस लक्ष्य एंटीजन के लिए इंजीनियर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग हाल ही में पीडी-एल 1 एंटीजन5 की एक श्रृंखला को व्यक्त करने वाली आइसोजेनिक सेल लाइनों के ऊतक माइक्रोएरे का उपयोग करके विभिन्न प्रकार के एंटी-पीडी-एल 1 परखों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। सेल लाइन ब्लॉक के नियमित उपयोग के लिए व्यावहारिक सीमाओं में पर्याप्त सेल नंबर का उत्पादन करने के लिए आवश्यक लागत और समय शामिल है और तथ्य यह है कि कुछ एंटीजन की अभिव्यक्ति मज़बूती से सुसंगत नहीं हो सकती है, यहां तक कि क्लोनल सेल लाइनों के भीतर भी6. सिंथेटिक पेप्टाइड्स एंटीबॉडी के लिए आईएचसी नियंत्रण के लिए एक तीसरा विकल्प है जो छोटे रैखिक एपिटोप को पहचानते हैं। स्टीवन बोगेन और उनके सहयोगियों ने ग्लास स्लाइड 7,8 और ग्लास मोती9 की सतह पर युग्मित पेप्टाइड्स के उपयोग पर बड़े पैमाने पर प्रकाशित किया है। इस समूह के एक अध्ययन से पता चला है कि पेप्टाइड-आधारित आईएचसी नियंत्रणों का मात्रात्मक विश्लेषण समानांतर10 में विश्लेषण किए गए ऊतक नियंत्रणों के गुणात्मक मूल्यांकन से चूक गई धुंधला प्रक्रिया भिन्नता का पता लगा सकता है। जबकि मनका-आधारित एंटीजन का उपयोग करने वाले मानक व्यापक रूप से लागू हो सकते हैं, कई विवरण लेखकों के लिए मालिकाना हैं, जो व्यापक गोद लेने को सीमित करते हैं।
आईएचसी मानकों के लिए एक अन्य दृष्टिकोण कृत्रिम रूप से बनाए गए प्रोटीन जैल में लक्ष्य एंटीजन को शामिल करता है। इस अवधारणा को पहली बार 1972 में प्रति ब्रांटज़ेग द्वारा एक अध्ययन में प्रदर्शित किया गया था जिसमें सामान्य खरगोश सीरम को ग्लूटाराल्डिहाइड11 का उपयोग करके बहुलकीकृत किया गया था। परिणामी जेल के छोटे ब्लॉकों को तब विभिन्न सांद्रता में ब्याज के इम्युनोग्लोबुलिन एंटीजन वाले समाधानों में 1-4 सप्ताह के लिए भिगोया गया था। अल्कोहल निर्धारण और पैराफिन एम्बेडिंग के बाद, परिणामी नियंत्रणों के वर्गों को एंटीजन समाधानों के लघुगणक के अनुरूप तीव्रता के साथ दागने के लिए दिखाया गया था जिसमें उन्हें भिगोया गया था। बाद में, जांचकर्ताओं ने प्रतिरक्षा-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन12,13 में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पतला बीएसए या मस्तिष्क होमोजेनेट समाधानों में विशिष्ट अमीनो एसिड के ग्लूटाराल्डिहाइड संयुग्म तैयार किए। हाल के काम ने मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण14 में एफएफपीई ऊतक के लिए सरोगेट्स के रूप में फॉर्मलाडेहाइड-फिक्स्ड प्रोटीन समाधानों से बने जैल के उपयोग की जांच की। एक अन्य हालिया काम ने विभिन्न सांद्रता और पीएच15 पर मानव या गोजातीय सीरम एल्बुमिन समाधानों को गर्म करके गठित जैल की संरचना और गुणों की जांच की। इन लेखकों ने पाया कि सीरम एल्बुमिन प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर यांत्रिक लोच, माध्यमिक संरचना संरक्षण और फैटी एसिड-बाध्यकारी क्षमता में भिन्न तीन प्रकार के जैल बनाता है। साथ में, ये पत्र यहां नियोजित दृष्टिकोण की सामान्य व्यवहार्यता को प्रदर्शित करते हैं। परिभाषित रचना के प्रोटीन समाधान ऊतक जैसे जैल बनाते हैं जिन्हें नियमित हिस्टोलॉजिकल विधियों का उपयोग करके आगे संसाधित, खंडित और दाग दिया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) से बने सिंथेटिक आईएचसी नियंत्रण के गठन का वर्णन करता है जो गर्मी और फॉर्मलाडेहाइड के साथ बहुलकीकृत होता है। जैल में विभिन्न प्रकार के एंटीजन शामिल हो सकते हैं, जिनमें पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन, प्रोटीन डोमेन और रैखिक पेप्टाइड्स, साथ ही ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स2 सहित गैर-प्रोटीन एंटीजन शामिल हैं। यह प्रदर्शन मानव ईआरबीबी 2 (एचईआर 2 / एनईयू) प्रोटीन टीपीटीएईएनजीवाईएलजीएलडीवीपीवी-सीओओएच के सी-टर्मिनल 16 अमीनो एसिड को एन्कोडिंग करने वाले रैखिक पेप्टाइड के एक उदाहरण एंटीजन का उपयोग करता है (सामग्री की तालिका देखें)। इस अनुक्रम में तीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, नैदानिक रूप से प्रासंगिक एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त एपिटोप शामिल हैं, जिनमें हर्सेप्टेस्ट पॉलीक्लोनल अभिकर्मक (ईएनपीईवाईएलडीवीपी) और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सीबी 11 (एईएनपीईवाईएल) और 4 बी 5 (टीईएनपीईवाईएलजीएल) ( सामग्री की तालिका देखें) 16 शामिल हैं।
यहां प्रदर्शित विधि किसी भी अभ्यास ऊतक विज्ञान प्रयोगशाला से परिचित प्रक्रियाओं और तकनीकों का उपयोग करके आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों को नियोजित करती है। सबसे महत्वपूर्ण सीमा लक्ष्य एंटीजन की पहचान करने और खरीदने की आवश्यकता है, जिसे कई मामलों में अपेक्षाकृत मामूली लागत पर पूरा किया जा सकता है। क्योंकि ये सिंथेटिक नियंत्रण पूरी तरह से परिभाषित संरचना के हैं और सरल तरीकों से बने हैं, उन्हें प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के साथ कई प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है। उनका उपयोग आईएचसी धुंधला परिणामों के उद्देश्य, मात्रात्मक मूल्यांकन की सुविधा प्रदान कर सकता है और अधिक इंट्रा- और अंतर-प्रयोगशाला प्रजनन क्षमता की अनुमति दे सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) परख प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जिसकी विश्वसनीय व्याख्या के लिए अच्छी तरह से विशेषता सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नमूनों की आवश्यकता होती है। क्योंकि उपयुक्त ऊतक या सेल लाइन नियंत्रण हमेशा उपलब्ध नहीं होते हैं, सिंथेटिक आईएचसी नियंत्रण बनाने का एक सरल तरीका फायदेमंद हो सकता है। इस तरह की विधि का वर्णन यहां किया गया है। यह सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रोटीन, पेप्टाइड्स या ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स सहित विभिन्न एंटीजन प्रकारों के अनुकूल है। यह प्रोटोकॉल सिंथेटिक एंटीजन नियंत्रण बनाने के लिए आवश्यक चरणों की व्याख्या करता है, उदाहरण के लिए मानव एरिथ्रोब्लास्टिक ऑन्कोजीन बी 2 (ईआरबीबी 2 / एचईआर 2) इंट्रासेल्युलर डोमेन (आईसीडी) से एक पेप्टाइड का उपयोग करके नैदानिक रूप से प्रासंगिक एंटीबॉडी की एक किस्म द्वारा मान्यता प्राप्त है। गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) समाधान में एचईआर 2 आईसीडी पेप्टाइड के धारावाहिक कमजोर पड़ने को फॉर्मलाडेहाइड के साथ मिलाया जाता है और पेप्टाइड / बीएसए मिश्रण को जमने और क्रॉस-लिंक करने के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्म किया जाता है। परिणामी जेल को एक ऊतक की तरह संसाधित, खंडित और दाग दिया जा सकता है, जिससे ज्ञात एंटीजन सांद्रता के नमूनों की एक श्रृंखला होती है जो धुंधला तीव्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में फैली होती है।
यह सरल प्रोटोकॉल नियमित ऊतक विज्ञान प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के अनुरूप है। विधि के लिए केवल यह आवश्यक है कि उपयोगकर्ता के पास वांछित एंटीजन की पर्याप्त मात्रा हो। पुनः संयोजक प्रोटीन, प्रोटीन डोमेन, या रैखिक पेप्टाइड्स जो प्रासंगिक एपिटोपको एन्कोड करते हैं, उन्हें स्थानीय या व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया जा सकता है। इन-हाउस एंटीबॉडी उत्पन्न करने वाली प्रयोगशालाएं सिंथेटिक नियंत्रण लक्ष्य के रूप में प्रतिरक्षण एंटीजन के विभाज्य को आरक्षित कर सकती हैं। सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में अच्छी तरह से परिभाषित सकारात्मक नियंत्रण बनाने का अवसर उपयोगकर्ताओं को इंट्रा- और अंतर-प्रयोगशाला परख प्रदर्शन का आकलन करने, गतिशील रेंज और उनके परख की रैखिकता में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और अपने विशेष प्रयोगात्मक लक्ष्यों के लिए परख स्थितियों का अनुकूलन करने की अनुमति देता है।

पेप्टाइड्स को ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट समाधान बनाने के लिए कमरे के तापमान पर एक उपयुक्त विलायक में पूरी तरह से भंग करना चाहिए। यदि दृश्यमान कण सामग्री अभी भी 30-60 मिनट के बाद मौजूद है, तो मूल विलायक की अतिरिक...

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Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

यह काम इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए सिंथेटिक एंटीजन नियंत्रण बनाने के लिए एक सरल विधि का दस्तावेजीकरण करता है। तकनीक सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में विभिन्न प्रकार के एंटीजन के अनुकूल है। नमूने एक संदर्भ प्रदान करते हैं जिसके साथ इंट्रा- और इंटर-परख प्रदर्शन और प्रजनन क्षमता का आकलन करना है।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए सिंथेटिक एंटीजन नियंत्रण

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

बीएसए एंटीजन जैल अच्छी तरह से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आईएचसी मानक हैं जो मौजूदा नियंत्रणों को पूरक कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल ज्ञात रचना के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानकों को बनाने के लिए मानक ऊतक विज्ञान और आईएचसी अभिकर्मकों और विधियों का उपयोग करता है। ये नियंत्रण विभिन्न प्रयोगशालाओं को कई नैदानिक रूप से प्रासंगिक परखों के लिए आईएचसी परखों को कैलिब्रेट और मानकीकृत करने का अवसर प्रदान करते हैं।पेप्टाइड या प्रोटीन को भंग करने के लिए एक उपयुक्त विलायक खोजना महत्वपूर्ण है। बुलबुले पेश किए बिना एंटीजन और फॉर्मलाडेहाइड समाधानों को जल्दी से मिलाना मुश्किल हो सकता है। शुरू करने के लिए, समान रूप से वितरित होने तक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, पीबीएस के 14 मिलीलीटर में पांच ग्राम बीएसए पाउडर मिलाकर वॉल्यूम बीएसए समाधान द्वारा 25% वजन के 20 मिलीलीटर तैयार करें।भंवर बीएसए पाउडर को भंग करने के लिए समाधान। पूर्ण विघटन के लिए घोल को रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर रखें। अगले दिन, पीबीएस के साथ अंतिम मात्रा को 20 मिलीलीटर में समायोजित करें।इसी तरह, 13 मिलीलीटर पीबीएस में 6.26 ग्राम बीएसए पाउडर मिलाकर वॉल्यूम बीएसए समाधान द्वारा 31.3% वजन के 20 मिलीलीटर तैयार करें। पूर्ण विघटन के लिए रात भर इनक्यूबेशन के बाद, अंतिम मात्रा को पीबीएस के साथ 20 मिलीलीटर में समायोजित करें। यह परीक्षण करने के लिए कि बीएसए फॉर्मलाडेहाइड मिश्रण एक जेल बनाता है, गर्मी ब्लॉक को 85 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।फिर 25% बीएसए समाधान के 700 माइक्रोलीटर को 37% फॉर्मलाडेहाइड के 700 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं। हवा के बुलबुले बनाने के बिना पांच से 10 सेकंड के भीतर पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। मिश्रण के तुरंत बाद, बंद माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब को गर्मी ब्लॉक में 85 डिग्री सेल्सियस तक गरम करें।10 मिनट के बाद, गर्मी ब्लॉक से ट्यूब को हटा दें। इसे ठंडा होने दें और पुष्टि करें कि जेल अपेक्षित रूप से बन गया है। आठ 1.5 मिलीलीटर माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार करें और स्पष्ट रूप से लेबल करें।फिर एक 5x पेप्टाइड स्टॉक समाधान तैयार करें, उपयुक्त विलायक के 60 माइक्रोलीटर में उदारीकृत पेप्टाइड के पूरे द्रव्यमान को फिर से निलंबित करके 12.5 मिलीमोलर एकाग्रता जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए समाधान का निरीक्षण करें कि पेप्टाइड पूरी तरह से भंग हो गया है। फिर पेप्टाइड्स आणविक भार, द्रव्यमान और शुद्धता के अनुसार 12.5 मिलीमोलर समाधान बनाने के लिए आवश्यक विलायक की एक अतिरिक्त मात्रा जोड़ें।इस उदाहरण में, 5x पेप्टाइड स्टॉक में 626.9 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा है। अन्य पेप्टाइड नमूनों को एक अलग अंतिम मात्रा की आवश्यकता होगी। अगला, 1 एक्स पेप्टाइड स्टॉक समाधान के 150 माइक्रोलीटर तैयार करें विलायक के 120 माइक्रोलीटर में 5 एक्स पेप्टाइड स्टॉक के 30 माइक्रोलीटर को पतला करके 2.5 मिलीमोलर एकाग्रता जोड़ें।कमरे के तापमान पर पांच सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए समाधान भंवर। अगला, 31.3% बीएसए समाधान के 560 माइक्रोलीटर में 1 एक्स पेप्टाइड स्टॉक के 140 माइक्रोलीटर को पतला करके 0.5 मिलीमोलर पेप्टाइड बीएसए समाधान के 700 माइक्रोलीटर तैयार करें। भंवर के बाद, कमरे के तापमान पर समाधान अपकेंद्रित्र।इसी तरह, पेप्टाइड बीएसए समाधान के 70 माइक्रोलीटर को 25% बीएसए समाधान के 630 माइक्रोलीटर में जोड़कर पेप्टाइड बीएसए स्टॉक के चार क्रमिक 10x सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें। बीएसए पेप्टाइड जैल तैयार करने के लिए, पेप्टाइड बीएसए कमजोर पड़ने के लिए 37% फॉर्मलाडेहाइड को एक समय में एक से एक अनुपात में एक नमूना काम करने के लिए जोड़ें। हवा के बुलबुले बनाने के बिना पांच से 10 सेकंड के भीतर पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।मिश्रण के बाद, बंद माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब को 10 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर हीट ब्लॉक में रखें। सभी पेप्टाइड बीएसए और फॉर्मलाडेहाइड समाधान तैयार और गर्म होने के बाद, जैल को पांच से 10 मिनट के लिए बेंचटॉप पर ठंडा होने दें। अगला, एक साफ, लचीला डिस्पोजेबल प्रयोगशाला स्पैटुला का उपयोग करके, एक टुकड़े में माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब से जेल के नमूने को हटा दें।और प्रत्येक नमूने के लिए एक अलग कंटेनर का उपयोग करके इसे कम से कम 15 मिलीलीटर तटस्थ बफर किए गए फॉर्मलिन युक्त एक सीलबंद कंटेनर में रखें। वैकल्पिक रूप से, एक नए एकल किनारे रेजर ब्लेड का उपयोग करके, माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे से काट लें और जेल को हवा या उपयुक्त जांच के साथ नीचे से बाहर धकेल दें। एक साफ एकल धार वाले रेजर का उपयोग करके जेल शंकु को बेलनाकार डिस्क में लगभग पांच मिलीमीटर मोटी ट्रिम करें।बायोप्सी रैप में डिस्क लपेटने के बाद, एक बड़ी जेल डिस्क को एक कैसेट में रखें और शेष जेल डिस्क को ऊतक माइक्रोएरे निर्माण में उपयोग के लिए एक दूसरे कैसेट में एक साथ रखें। प्रसंस्करण से पहले, प्रत्येक नमूने के लिए एक अलग कंटेनर का उपयोग करके, प्रति जेल 10% तटस्थ बफर फॉर्मलिन के कम से कम 15 मिलीलीटर में कैसेट जैल रखें। अगला, दबाव और वैक्यूम के साथ एक बड़े ऊतक अनुसूची के बाद एक स्वचालित ऊतक विज्ञान ऊतक प्रोसेसर में जैल को संसाधित करें।जब नमूना प्रसंस्करण पूरा हो जाता है, तो ऊतक प्रोसेसर से कैसेट निकालें और उन्हें पैराफिन एम्बेडिंग केंद्र में ले जाएं। बायोप्सी रैप से जैल को खोलने के बाद, जैल को पैराफिन में एम्बेड करें या प्रत्येक नमूना एक छोटे से 15 बाई 15 मिलीमीटर मोल्ड में जेल की एक डिस्क एम्बेड करें। और शेष जेल डिस्क एक दूसरे बड़े मोल्ड में एक साथ होती है।प्रत्येक पेप्टाइड कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए, कुल छह अलग-अलग वर्गों वाली दो ग्लास स्लाइड बनाएं। पांच कमजोर पड़ने श्रृंखला नमूनों में से प्रत्येक से एक अनुभाग और बीएसए से एक अनुभाग केवल नकारात्मक नियंत्रण नमूना। स्लाइड्स को सेक्शनिंग और सुखाने के बाद, वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ प्रत्येक पेप्टाइड के लिए तैयार दो स्लाइड्स को दाग दें।मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक जेल अनुभाग के भीतर अपेक्षाकृत समान संकेत देखने की उम्मीद है। पेप्टाइड कमजोर पड़ने के अनुरूप संकेत तीव्रता की एक श्रृंखला दिखा विभिन्न जेल नमूनों के साथ। बीएसए जेल ऊतक माइक्रोएरे निर्माण के लिए, ऊतक माइक्रोएरे के चार माइक्रोमीटर मोटे वर्गों में कटौती करें और प्रयोगशाला मानक प्रोटोकॉल के अनुसार खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग दें।निरीक्षण द्वारा गुणात्मक रूप से परिणामी दाग तीव्रता का आकलन करें या मात्रात्मक रूप से डिजिटल छवि स्कैनिंग और विश्लेषण खरीदें। उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया करने के बाद, नकारात्मक नियंत्रण बीएसए केवल जेल नमूनों ने न्यूनतम संकेत दिखाया। एक व्यक्तिगत जेल नमूने में सिग्नल तीव्रता अपेक्षाकृत समान है और एंटीजन सांद्रता बढ़ने के साथ बढ़ती है।एमडीए-एमबी -175 कोशिकाओं के 10% से अधिक बेहोश और पूरी तरह से परिधीय झिल्लीदार धुंधला दिखाते हैं। इसके विपरीत, एसकेबीआर -3 कोशिकाओं के 10% से अधिक, तीव्र पूरी तरह से परिधीय झिल्लीदार धुंधला दिखाते हैं फॉर्मलाडेहाइड को जोड़ने के बाद जल्दी से काम करें क्योंकि समाधान कमरे के तापमान पर भी जेल करना शुरू कर देंगे। हम नए एंटीबॉडी का परीक्षण करते समय आईएचसी नियंत्रण करने के लिए इस विधि का उपयोग करते हैं ताकि हमें विश्वास दिलाया जा सके कि परख अपेक्षित रूप से प्रदर्शन करती है, भले ही परीक्षण एंटीबॉडी कोई संकेत न दिखाएं।ऊतक या सेल लाइन नियंत्रण स्वाभाविक रूप से परिवर्तनशील हैं। सिंथेटिक एंटीजन नियंत्रण हमें विशिष्ट आईएसडी प्रतिक्रिया स्थितियों को अधिक सटीक रूप से बदलने के प्रभाव को मापने की अनुमति देता है।

Research

JoVE Journal

Medicine

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With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक में मानव और मूत्र न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्यूलर ट्रैप्स का इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

सचेत चूहों में सहज बैरोरिफ्लेक्स संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए संयुक्त टेलीमेट्रिक ईसीजी और रक्तचाप ट्रांसमीटरों का आरोपण

Blood pressure (BP) and heart rate (HR) are both controlled by the autonomic nervous system (ANS) and are closely intertwined due to reflex mechanisms. ...