इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए सिंथेटिक एंटीजन नियंत्रण

बीएसए एंटीजन जैल अच्छी तरह से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आईएचसी मानक हैं जो मौजूदा नियंत्रणों को पूरक कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल ज्ञात रचना के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानकों को बनाने के लिए मानक ऊतक विज्ञान और आईएचसी अभिकर्मकों और विधियों का उपयोग करता है। ये नियंत्रण विभिन्न प्रयोगशालाओं को कई नैदानिक रूप से प्रासंगिक परखों के लिए आईएचसी परखों को कैलिब्रेट और मानकीकृत करने का अवसर प्रदान करते हैं।

पेप्टाइड या प्रोटीन को भंग करने के लिए एक उपयुक्त विलायक खोजना महत्वपूर्ण है। बुलबुले पेश किए बिना एंटीजन और फॉर्मलाडेहाइड समाधानों को जल्दी से मिलाना मुश्किल हो सकता है। शुरू करने के लिए, समान रूप से वितरित होने तक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, पीबीएस के 14 मिलीलीटर में पांच ग्राम बीएसए पाउडर मिलाकर वॉल्यूम बीएसए समाधान द्वारा 25% वजन के 20 मिलीलीटर तैयार करें।

भंवर बीएसए पाउडर को भंग करने के लिए समाधान। पूर्ण विघटन के लिए घोल को रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर रखें। अगले दिन, पीबीएस के साथ अंतिम मात्रा को 20 मिलीलीटर में समायोजित करें।

इसी तरह, 13 मिलीलीटर पीबीएस में 6.26 ग्राम बीएसए पाउडर मिलाकर वॉल्यूम बीएसए समाधान द्वारा 31.3% वजन के 20 मिलीलीटर तैयार करें। पूर्ण विघटन के लिए रात भर इनक्यूबेशन के बाद, अंतिम मात्रा को पीबीएस के साथ 20 मिलीलीटर में समायोजित करें। यह परीक्षण करने के लिए कि बीएसए फॉर्मलाडेहाइड मिश्रण एक जेल बनाता है, गर्मी ब्लॉक को 85 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।

फिर 25% बीएसए समाधान के 700 माइक्रोलीटर को 37% फॉर्मलाडेहाइड के 700 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं। हवा के बुलबुले बनाने के बिना पांच से 10 सेकंड के भीतर पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। मिश्रण के तुरंत बाद, बंद माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब को गर्मी ब्लॉक में 85 डिग्री सेल्सियस तक गरम करें।

10 मिनट के बाद, गर्मी ब्लॉक से ट्यूब को हटा दें। इसे ठंडा होने दें और पुष्टि करें कि जेल अपेक्षित रूप से बन गया है। आठ 1.5 मिलीलीटर माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार करें और स्पष्ट रूप से लेबल करें।

फिर एक 5x पेप्टाइड स्टॉक समाधान तैयार करें, उपयुक्त विलायक के 60 माइक्रोलीटर में उदारीकृत पेप्टाइड के पूरे द्रव्यमान को फिर से निलंबित करके 12.5 मिलीमोलर एकाग्रता जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए समाधान का निरीक्षण करें कि पेप्टाइड पूरी तरह से भंग हो गया है। फिर पेप्टाइड्स आणविक भार, द्रव्यमान और शुद्धता के अनुसार 12.5 मिलीमोलर समाधान बनाने के लिए आवश्यक विलायक की एक अतिरिक्त मात्रा जोड़ें।

इस उदाहरण में, 5x पेप्टाइड स्टॉक में 626.9 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा है। अन्य पेप्टाइड नमूनों को एक अलग अंतिम मात्रा की आवश्यकता होगी। अगला, 1 एक्स पेप्टाइड स्टॉक समाधान के 150 माइक्रोलीटर तैयार करें विलायक के 120 माइक्रोलीटर में 5 एक्स पेप्टाइड स्टॉक के 30 माइक्रोलीटर को पतला करके 2.5 मिलीमोलर एकाग्रता जोड़ें।

कमरे के तापमान पर पांच सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए समाधान भंवर। अगला, 31.3% बीएसए समाधान के 560 माइक्रोलीटर में 1 एक्स पेप्टाइड स्टॉक के 140 माइक्रोलीटर को पतला करके 0.5 मिलीमोलर पेप्टाइड बीएसए समाधान के 700 माइक्रोलीटर तैयार करें। भंवर के बाद, कमरे के तापमान पर समाधान अपकेंद्रित्र।

इसी तरह, पेप्टाइड बीएसए समाधान के 70 माइक्रोलीटर को 25% बीएसए समाधान के 630 माइक्रोलीटर में जोड़कर पेप्टाइड बीएसए स्टॉक के चार क्रमिक 10x सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें। बीएसए पेप्टाइड जैल तैयार करने के लिए, पेप्टाइड बीएसए कमजोर पड़ने के लिए 37% फॉर्मलाडेहाइड को एक समय में एक से एक अनुपात में एक नमूना काम करने के लिए जोड़ें। हवा के बुलबुले बनाने के बिना पांच से 10 सेकंड के भीतर पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।

मिश्रण के बाद, बंद माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब को 10 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर हीट ब्लॉक में रखें। सभी पेप्टाइड बीएसए और फॉर्मलाडेहाइड समाधान तैयार और गर्म होने के बाद, जैल को पांच से 10 मिनट के लिए बेंचटॉप पर ठंडा होने दें। अगला, एक साफ, लचीला डिस्पोजेबल प्रयोगशाला स्पैटुला का उपयोग करके, एक टुकड़े में माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब से जेल के नमूने को हटा दें।

और प्रत्येक नमूने के लिए एक अलग कंटेनर का उपयोग करके इसे कम से कम 15 मिलीलीटर तटस्थ बफर किए गए फॉर्मलिन युक्त एक सीलबंद कंटेनर में रखें। वैकल्पिक रूप से, एक नए एकल किनारे रेजर ब्लेड का उपयोग करके, माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे से काट लें और जेल को हवा या उपयुक्त जांच के साथ नीचे से बाहर धकेल दें। एक साफ एकल धार वाले रेजर का उपयोग करके जेल शंकु को बेलनाकार डिस्क में लगभग पांच मिलीमीटर मोटी ट्रिम करें।

बायोप्सी रैप में डिस्क लपेटने के बाद, एक बड़ी जेल डिस्क को एक कैसेट में रखें और शेष जेल डिस्क को ऊतक माइक्रोएरे निर्माण में उपयोग के लिए एक दूसरे कैसेट में एक साथ रखें। प्रसंस्करण से पहले, प्रत्येक नमूने के लिए एक अलग कंटेनर का उपयोग करके, प्रति जेल 10% तटस्थ बफर फॉर्मलिन के कम से कम 15 मिलीलीटर में कैसेट जैल रखें। अगला, दबाव और वैक्यूम के साथ एक बड़े ऊतक अनुसूची के बाद एक स्वचालित ऊतक विज्ञान ऊतक प्रोसेसर में जैल को संसाधित करें।

जब नमूना प्रसंस्करण पूरा हो जाता है, तो ऊतक प्रोसेसर से कैसेट निकालें और उन्हें पैराफिन एम्बेडिंग केंद्र में ले जाएं। बायोप्सी रैप से जैल को खोलने के बाद, जैल को पैराफिन में एम्बेड करें या प्रत्येक नमूना एक छोटे से 15 बाई 15 मिलीमीटर मोल्ड में जेल की एक डिस्क एम्बेड करें। और शेष जेल डिस्क एक दूसरे बड़े मोल्ड में एक साथ होती है।

प्रत्येक पेप्टाइड कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए, कुल छह अलग-अलग वर्गों वाली दो ग्लास स्लाइड बनाएं। पांच कमजोर पड़ने श्रृंखला नमूनों में से प्रत्येक से एक अनुभाग और बीएसए से एक अनुभाग केवल नकारात्मक नियंत्रण नमूना। स्लाइड्स को सेक्शनिंग और सुखाने के बाद, वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ प्रत्येक पेप्टाइड के लिए तैयार दो स्लाइड्स को दाग दें।

मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक जेल अनुभाग के भीतर अपेक्षाकृत समान संकेत देखने की उम्मीद है। पेप्टाइड कमजोर पड़ने के अनुरूप संकेत तीव्रता की एक श्रृंखला दिखा विभिन्न जेल नमूनों के साथ। बीएसए जेल ऊतक माइक्रोएरे निर्माण के लिए, ऊतक माइक्रोएरे के चार माइक्रोमीटर मोटे वर्गों में कटौती करें और प्रयोगशाला मानक प्रोटोकॉल के अनुसार खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग दें।

निरीक्षण द्वारा गुणात्मक रूप से परिणामी दाग तीव्रता का आकलन करें या मात्रात्मक रूप से डिजिटल छवि स्कैनिंग और विश्लेषण खरीदें। उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया करने के बाद, नकारात्मक नियंत्रण बीएसए केवल जेल नमूनों ने न्यूनतम संकेत दिखाया। एक व्यक्तिगत जेल नमूने में सिग्नल तीव्रता अपेक्षाकृत समान है और एंटीजन सांद्रता बढ़ने के साथ बढ़ती है।

एमडीए-एमबी -175 कोशिकाओं के 10% से अधिक बेहोश और पूरी तरह से परिधीय झिल्लीदार धुंधला दिखाते हैं। इसके विपरीत, एसकेबीआर -3 कोशिकाओं के 10% से अधिक, तीव्र पूरी तरह से परिधीय झिल्लीदार धुंधला दिखाते हैं फॉर्मलाडेहाइड को जोड़ने के बाद जल्दी से काम करें क्योंकि समाधान कमरे के तापमान पर भी जेल करना शुरू कर देंगे। हम नए एंटीबॉडी का परीक्षण करते समय आईएचसी नियंत्रण करने के लिए इस विधि का उपयोग करते हैं ताकि हमें विश्वास दिलाया जा सके कि परख अपेक्षित रूप से प्रदर्शन करती है, भले ही परीक्षण एंटीबॉडी कोई संकेत न दिखाएं।

ऊतक या सेल लाइन नियंत्रण स्वाभाविक रूप से परिवर्तनशील हैं। सिंथेटिक एंटीजन नियंत्रण हमें विशिष्ट आईएसडी प्रतिक्रिया स्थितियों को अधिक सटीक रूप से बदलने के प्रभाव को मापने की अनुमति देता है।