Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
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저자들은 펩티드 합성을 위한 제프리 톰과 아이민 송, TMA 구축을 위한 Nianfeng Ge, IHC 염색을 위한 Shari Lau, 디지털 현미경 스캐닝을 위한 Melissa Edick, 디지털 이미지 정량화를 위한 Hai Ngu를 감사하게 여긴다.

1. 원액 및 도구의 준비
<ol><li>50 mL 원뿔형 튜브에서 5 mL의 PBS, pH 7.2의 5 mL BSA 분말을 혼합하여 25% w/v BSA 용액 20 mL를 고르게 분산시킬 때까지 준비한다. BSA 분말을 분산시키기 위해 필요에 따라 소용돌이.<ol><li>완전한 용해를 허용하도록 용액을 4°C에서 하룻밤 동안 유지한다. PBS로 최종 부피를 20 mL로 조정하여 25% w/v 원액을 만든다.</li>
	</ol></li>
	<li>6.26 g BSA 분말을 PBS 13 mL에 혼합하고, pH 7.2를 50 mL ?...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

이 방법을 통해 사용자는 대부분의 조직학 실험실에 익숙한 재료 및 기술을 사용하여 IHC 반응의 표준으로 알려진 조성 및 항원 농도의 균일 한 샘플을 만들 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 관심있는 항체가 결합하는 에피토프를 확인하는 것이다. 이 프로토콜은 ERBB2/HER2 ICD로부터의 선형 펩티드 항원을 사용하는 것을 기술한다. 동일한 프로토콜이 올리고뉴클레오티드, 형광 표지, 단백질 도메인,...

면역조직화학(IHC)은 포르말린-고정, 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편에서 표적 항원의 민감하고 특이적이며 공간적으로 정밀한 검출을 가능하게 한다. 그러나, IHC 염색 결과는 온온 및 냉 허혈 시간, 조직 고정, 조직 전처리, 항체 반응성 및 농도, 분석 검출 화학, 및 반응 시간1을 포함하는 다수의 변수에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, IHC 반응의 재현 가능한 성능 및 해석은 이들 변수의 엄격한 제어와 잘 특성화된 양성 및 음성 대조군 샘플의 사용을 필요로 한다. 자주 사용되는 대조군에는 관심 항원을 발현하는 독립적인 분석으로부터 공지된 파라핀 포매된 조직 또는 배양된 세포주가 포함되지만, 이러한 샘플이 항상 이용가능한 것은 아니다1. 더욱이, 조직 및 세포주 조절에서 표적 항원의 발현 수준은 일반적으로 단지 정성적으로만 이해되고 가변적일 수 있다. 재현 가능하고 정확하게 알려진 표적 항원 농도를 함유하는 대조군은 IHC 반응 조건의 최적화를 보조할 수 있다. 합성 IHC 대조군 샘플을 생성하기 위해 생리학적으로 관련된 농도 범위에서 다양한 항원 유형에 적응할 수 있는 일반적인 방법이 저자2에 의해 기술되었다. 이러한 유형의 표준을 만들고 사용하기 위해 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.
적절한 조절은 IHC 검정 1,3,4의 유효한 해석을 위해 필수적이다. 조직, 배양된 세포 및 펩티드-코팅된 기질은 조사자의 특정 필요에 따라 IHC 대조군으로 사용되었다. IHC 대조군으로서 조직을 사용하는 데 내재된 이점과 한계는 광범위하게 논의되었다 1,4. 많은 항체의 경우, 적절한 대조군은 넓은 동적 범위에 걸쳐 표적 항원을 발현하는 세포 집단을 함유하는 선택된 정상 조직으로부터 선택될 수 있다. 조직 조절은 표적 항원이 발현 부위 또는 풍부함에 관하여 잘 특성화되지 않을 때, 또는 잠재적으로 교차-반응하는 항원이 동일한 세포 또는 조직 부위에서 공동-발현될 때 덜 적합하다. 이러한 맥락에서, 관심있는 항원을 발현하는 배양된 세포주의 블록이 도움이 될 수 있다. 표적 특이성의 추가의 증거를 제공하기 위해, 세포주는 표적 항원을 과발현 또는 과발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 접근법은 최근에 PD-L1 항원5의 범위를 발현하는 원형 세포주의 조직 마이크로어레이를 사용하여 다양한 항-PD-L1 검정을 평가하는데 사용되었다. 세포주 블록의 일상적인 사용에 대한 실질적인 제한은 충분한 세포 수를 생산하는데 필요한 비용 및 시간 및 일부 항원의 발현이 클론 세포주 내에서도 신뢰성 있게 일관되지 않을 수 있다는 사실을포함한다(6). 합성 펩티드는 짧은 선형 에피토프를 인식하는 항체에 대한 IHC 조절을 위한 세 번째 옵션이다. 스티븐 보겐 (Steven Bogen)과 동료들은 유리 슬라이드 7,8 및 유리 비드9의 표면에 결합 된 펩타이드의 사용에 대해 광범위하게 발표했습니다. 이 그룹의 한 연구는 펩티드 기반 IHC 대조군의 정량 분석이 병행10에서 분석 된 조직 대조군의 정성적 평가에 의해 놓친 염색 과정 변화를 검출 할 수 있음을 보여주었습니다. 비드 기반 항원을 사용하는 표준이 널리 적용될 수 있지만, 많은 세부 사항은 저자에게 독점적이어서 광범위한 채택을 제한합니다.
IHC 표준에 대한 또 다른 접근법은 표적 항원을 인위적으로 생성 된 단백질 겔에 통합합니다. 이 개념은 1972 년 Per Brandtzaeg에 의해 글루타르 알데히드11을 사용하여 정상적인 토끼 혈청을 중합 한 연구에서 처음 입증되었습니다. 이어서, 생성된 겔의 작은 블록들을 다양한 농도에서 관심있는 면역글로불린 항원을 함유하는 용액에 1-4주 동안 담갔다. 알콜 고정 및 파라핀 임베딩 후, 생성된 대조군의 절편은 그들이 담근 항원 용액의 로그에 상응하는 강도로 염색되는 것으로 나타났다. 나중에, 연구자들은 면역 전자 현미경 연구12,13에서 양성 대조군으로 희석 된 BSA 또는 뇌 균질 용액에서 특정 아미노산의 글루타르 알데히드 접합체를 준비했습니다. 보다 최근의 연구는 질량 분광법 분석14에서 FFPE 조직에 대한 대리자로서 포름 알데히드 고정 단백질 용액으로 만든 젤의 사용을 조사했다. 최근의 또 다른 연구는 인간 또는 소 혈청 알부민 용액을 다양한 농도 및 pH15로 가열하여 형성된 겔의 구조 및 특성을 조사했습니다. 이 저자들은 혈청 알부민이 실험 조건에 따라 기계적 탄력성, 이차 구조 보존 및 지방산 결합 능력이 다른 세 가지 유형의 젤을 형성한다는 것을 발견했습니다. 함께,이 논문들은 여기에 사용 된 접근법의 일반적인 타당성을 보여줍니다. 정의된 조성물의 단백질 용액은 일상적인 조직학적 방법을 사용하여 추가로 처리, 절편화 및 염색될 수 있는 조직형 겔을 생성한다.
이 프로토콜은 열 및 포름알데히드로 중합된 소 혈청 알부민 (BSA)으로부터 제조된 합성 IHC 대조군의 형성을 기술한다. 겔은 전장 단백질, 단백질 도메인 및 선형 펩티드뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드2를 포함하는 비단백질 항원을 포함하는 매우 다양한 항원을 혼입할 수 있다. 본 실증은 인간 ERBB2 (HER2/neu) 단백질 TPTAENPEYLGLDVPV-COOH의 C 말단 16개 아미노산을 코딩하는 선형 펩티드의 예시적인 항원을 사용한다 (표 문헌 참조). 이 서열은 허셉테스트 폴리클로날 시약 (ENPEYLGLDVP) 및 모노클로날 항체 CB11 (AENPEYL) 및 4B5 (TAENPEYLGL) (표 문헌 참조)16을 포함하는 세 개의 상업적으로 입수가능한, 진단적으로 관련된 항체에 의해 인식되는 에피토프를 포함한다.
여기에서 입증 된 방법은 모든 조직학 실험실에 익숙한 프로세스와 기술을 사용하여 쉽게 사용할 수있는 시약을 사용합니다. 가장 중요한 한계는 표적 항원을 동정하고 구매할 필요성이며, 이는 많은 경우에 비교적 적은 비용으로 달성될 수 있다. 이러한 합성 제어는 완전히 정의 된 구성이며 간단한 방법으로 만들어지기 때문에 재현 가능한 결과로 많은 실험실에서 구현할 수 있습니다. 이들의 사용은 IHC 염색 결과의 객관적이고 정량화 가능한 평가를 촉진하고 실험실 내 및 실험실 간 재현성을 더 크게 허용 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

면역조직화학(IHC) 분석은 단백질 발현 패턴에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며, 이에 대한 신뢰할 수 있는 해석은 잘 특성화된 양성 및 음성 대조군 샘플을 필요로 합니다. 적절한 조직 또는 세포주 조절이 항상 이용 가능한 것은 아니기 때문에, 합성 IHC 대조군을 생성하는 간단한 방법이 유익할 수 있다. 이러한 방법은 여기에 설명되어 있습니다. 단백질, 펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한 다양한 항원 유형에 광범위한 농도로 적응할 수 있다. 이 프로토콜은 다양한 진단적 관련 항체에 의해 인식되는 인간 적혈구 종양유전자 B2 (ERBB2/HER2) 세포내 도메인 (ICD)으로부터의 펩티드를 예로서 사용하여 합성 항원 조절을 생성하는 데 필요한 단계를 설명한다. 소 혈청 알부민 (BSA) 용액에서 HER2 ICD 펩티드의 연속 희석물을 포름알데히드와 혼합하고 85°C에서 10분 동안 가열하여 펩티드/BSA 혼합물을 응고시키고 가교시킨다. 생성된 겔은 조직처럼 처리, 절편화 및 염색될 수 있고, 광범위한 염색 강도에 걸쳐 공지된 항원 농도의 일련의 샘플을 산출한다.
이 간단한 프로토콜은 일상적인 조직학 실험실 절차와 일치합니다. 상기 방법은 단지 사용자가 원하는 항원의 충분한 양을 가질 것을 요구한다. 관련 에피토프를 인코딩하는 재조합 단백질, 단백질 도메인, 또는 선형 펩티드는 국부적으로 또는 상업적으로 합성될 수 있다. 사내 항체를 생성하는 실험실은 합성 대조군 표적으로서 면역화 항원의 분취량을 예비할 수 있다. 광범위한 농도에 걸쳐 잘 정의된 양성 대조군을 만들 수 있는 기회를 통해 사용자는 실험실 내 및 실험실 간 분석 성능을 평가하고, 분석의 동적 범위와 선형성에 대한 통찰력을 얻고, 특정 실험 목표에 맞게 분석 조건을 최적화할 수 있습니다.

펩티드는 실온에서 적절한 용매에 전적으로 용해되어 광학적으로 투명한 용액을 형성해야 한다. 가시적 미립자 물질이 30-60분 후에도 여전히 존재하는 경우, 표 1에서 계산된 5x 펩티드 원액의 의도된 부피를 초과하지 않는 원래의 용매 또는 대체 용매의 추가 부피를 첨가하는 것이 도움이 될 수 있다. 마찬가지로 결합된 펩티드/BSA 용액은 반투명하게 유지되어야 합니다(<strong class="xfig...

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Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

이 작업은 면역 조직 화학을위한 합성 항원 대조군을 만드는 간단한 방법을 문서화합니다. 이 기술은 광범위한 농도에서 다양한 항원에 적응할 수 있다. 샘플은 인트라 및 인터-어세이 성능 및 재현성을 평가하기 위한 참조를 제공한다.

면역조직화학을 위한 합성 항원 대조군

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

BSA 항원 겔은 기존 대조군을 보완할 수 있는 잘 특성화된 재현 가능한 IHC 표준물질입니다. 이 프로토콜은 표준 조직학 및 IHC 시약 및 방법을 사용하여 알려진 조성의 재현 가능한 표준을 만듭니다. 이러한 제어는 여러 실험실에서 진단적으로 관련된 많은 분석에 대해 IHC 분석을 교정하고 표준화할 수 있는 기회를 제공합니다.펩티드 또는 단백질을 용해시키기에 적합한 용매를 찾는 것이 중요하다. 기포를 도입하지 않고 항원과 포름알데히드 용액을 빠르게 혼합하는 것은 까다로울 수 있습니다. 시작하려면 고르게 분포 될 때까지 50 밀리리터의 원추형 튜브에 14 밀리리터의 PBS에 5 그램의 BSA 분말을 혼합하여 25 중량 % BSA 용액 20 밀리리터를 준비하십시오.용액을 와동시켜 BSA 분말을 용해시킨다. 완전히 용해되도록 용액을 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오. 다음날 PBS를 사용하여 최종 부피를 20 밀리리터로 조정하십시오.유사하게, 13 밀리리터의 PBS에 6.26 그램의 BSA 분말을 혼합하여 31.3 중량% 중량% BSA 용액 20 밀리리터를 준비합니다. 완전한 용해를 위해 밤새 배양 한 후 PBS로 최종 부피를 20 밀리리터로 조정하십시오. BSA 포름알데히드 혼합물이 겔을 형성하는지 테스트하려면 열 블록을 섭씨 85도로 예열합니다.그런 다음 700 마이크로 리터의 25 % BSA 용액과 700 마이크로 리터의 37 % 포름 알데히드를 혼합하십시오. 기포를 만들지 않고 5-10초 이내에 5회 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다. 혼합 직후 닫힌 마이크로 원심 분리기 튜브를 섭씨 85도로 예열된 열 블록에 놓습니다.10 분 후 열 블록에서 튜브를 제거하십시오. 식히고 젤이 예상대로 형성되었는지 확인하십시오. 8개의 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하고 명확하게 라벨을 붙입니다.이어서, 5x 펩티드 원액을 제조하고, 자유화된 펩티드의 전체 질량을 60 마이크로리터의 적절한 용매에 재현탁시켜 12.5 밀리몰 농도를 첨가한다. 펩타이드가 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 용액을 관찰하십시오. 그런 다음 필요에 따라 용매를 추가하여 펩타이드 분자량, 질량 및 순도에 따라 12.5 밀리몰 용액을 만듭니다.이 예에서, 5x 펩티드 스톡은 626.9 마이크로리터의 최종 부피를 갖는다. 다른 펩타이드 샘플은 다른 최종 부피를 필요로 할 것이다. 다음으로, 1x 펩티드 스톡 용액 150 마이크로리터를 준비하고, 5x 펩타이드 스톡 30 마이크로리터를 120 마이크로리터의 용매로 희석하여 2.5 밀리몰 농도를 첨가한다.용액을 5 초 동안 와동시키고 실온에서 원심 분리합니다. 다음으로, 1x 펩타이드 스톡 140마이크로리터를 31.3%BSA 용액 560마이크로리터로 희석하여 0.5밀리몰 펩타이드 BSA 용액 700마이크로리터를 준비합니다. 볼텍싱 후 실온에서 용액을 원심분리합니다.유사하게, 25% BSA 용액의 630 마이크로리터에 70 마이크로리터의 펩티드 BSA 용액을 첨가하여 펩티드 BSA 스톡의 4개의 연속 10x 연속 희석을 준비합니다. BSA 펩타이드 젤을 준비하려면 펩타이드 BSA 희석액에 37%포름알데히드를 한 번에 하나의 샘플씩 작동하는 1:1 비율로 첨가합니다. 기포를 만들지 않고 5-10초 이내에 5회 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.혼합 후 닫힌 마이크로 원심 분리기 튜브를 섭씨 85 도의 열 블록에 10 분 동안 놓습니다. 모든 펩타이드 BSA와 포름알데히드 용액을 준비하고 가열한 후 겔을 벤치탑에서 5-10분 동안 식힙니다. 다음으로, 깨끗하고 유연한 일회용 실험실 주걱을 사용하여 마이크로 원심 분리기 튜브에서 겔 샘플을 한 조각으로 제거합니다.적어도 15 밀리리터의 중성 완충 포르말린을 함유하는 밀봉 용기에 넣고, 각 샘플에 대해 별도의 용기를 사용한다. 또는 새로운 단일 모서리 면도날을 사용하여 마이크로 원심 분리기 튜브의 바닥을 잘라 내고 공기 또는 적절한 프로브로 바닥에서 젤을 밀어냅니다. 깨끗한 단일 날이 있는 면도기를 사용하여 겔 콘을 약 5mm 두께의 원통형 디스크로 자릅니다.디스크를 생검 랩으로 감싼 후 하나의 큰 젤 디스크를 하나의 카세트에 넣고 나머지 젤 디스크를 함께 두 번째 카세트에 넣어 조직 마이크로 어레이 구성에 사용합니다. 처리하기 전에 각 샘플에 대해 별도의 용기를 사용하여 젤 당 최소 15 밀리리터의 10 % 중성 완충 포르말린에 카세트 젤을 넣으십시오. 다음으로, 자동화된 조직학 조직 프로세서에서 압력과 진공으로 큰 조직 일정에 따라 젤을 처리합니다.샘플 처리가 완료되면 티슈 프로세서에서 카세트를 제거하고 파라핀 임베딩 센터로 옮깁니다. 생검 랩에서 젤을 개봉 한 후 젤을 파라핀에 삽입하거나 각 샘플에 젤 디스크 하나를 작은 15 x 15mm 몰드에 삽입합니다. 그리고 나머지 젤 디스크는 두 번째 더 큰 금형에서 함께 디스크됩니다.각 펩타이드 희석 시리즈에 대해 총 6개의 개별 섹션을 포함하는 2개의 유리 슬라이드를 만듭니다. 5개의 희석 시리즈 샘플 각각으로부터의 하나의 섹션 및 BSA 전용 음성 대조군 샘플로부터의 하나의 섹션. 슬라이드를 절편하고 건조시킨 후, 각각의 펩티드에 대해 준비된 2개의 슬라이드를 원하는 1차 항체로 염색한다.표준 면역 조직 화학 프로토콜에 따르면 각 겔 섹션 내에서 비교적 균일 한 신호를 볼 것으로 예상됩니다. 상이한 겔 샘플은 펩티드 희석물에 상응하는 신호 강도의 범위를 나타낸다. BSA 겔 조직 마이크로어레이 구축을 위해 조직 마이크로어레이의 4마이크로미터 두께 섹션을 절단하고 실험실 표준 프로토콜에 따라 토끼 단일클론 항체로 염색합니다.검사를 통해 결과 얼룩 강도를 정성적으로 평가하거나 정량적으로 디지털 이미지 스캐닝 및 분석을 구입합니다. 적절한 항체와 반응한 후, 음성 대조군 BSA 겔 샘플만이 최소한의 신호를 보였다. 개별 겔 샘플의 신호 강도는 비교적 균일하며 항원 농도가 증가함에 따라 증가합니다.MDA-MB-175 세포의 10 % 이상이 희미하고 완전히 원주 막 염색을 보입니다. 대조적으로, SKBR-3 세포의 10% 이상은 강렬한 완전 원주 막 염색을 보여줍니다 포름알데히드가 첨가되면 용액이 실온에서도 겔화되기 시작하기 때문에 빠르게 작동합니다. 우리는 이 방법을 사용하여 새로운 항체를 테스트할 때 IHC 대조군을 만들어 테스트 항체가 신호를 나타내지 않는 경우에도 분석이 예상대로 수행되었다는 확신을 줍니다.조직 또는 세포주 제어는 본질적으로 가변적입니다. 합성 항원 제어를 통해 특정 ISD 반응 조건 변화의 효과를보다 정확하게 측정 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

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연구

의학

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