Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner takknemlig sine kolleger Jeffrey Tom og Aimin Song for peptidsyntese, Nianfeng Ge for TMA-konstruksjon, Shari Lau for IHC-farging, Melissa Edick for digital mikroskopisk skanning og Hai Ngu for digital bildekvantifisering.

1. Klargjøring av stamløsning og verktøy
<ol><li>Klargjør 20 ml av en 25 % w/v BSA-oppløsning ved å blande 5 g BSA pulver i 14 ml PBS, pH 7,2 i en 50 ml konisk slange til den er jevnt fordelt. Vortex etter behov for å dispergere BSA pulveret.<ol><li>Oppbevar oppløsningen over natten ved 4 °C for å tillate fullstendig oppløsning. Juster det endelige volumet til 20 ml med PBS for å lage en 25 % w/v lagerløsning.</li>
	</ol></li>
	<li>Klargjør 20 ml av en 31,3 % w/v BSA-oppløsning ved å blande 6,26 g BSA p...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

Denne metoden gjør det mulig for brukeren å lage ensartede prøver av kjent sammensetning og antigenkonsentrasjon som standarder i IHC-reaksjoner, ved hjelp av materialer og teknikker som er kjent for de fleste histologiske laboratorier. Det mest avgjørende trinnet er å identifisere epitopen som antistoffet av interesse binder seg til. Denne protokollen beskriver bruk av et lineært peptidantigen fra ERBB2/HER2 ICD. Den samme protokollen kan brukes til å danne BSA-geler som inneholder oligonukleotider, fluorescerend...

Immunhistokjemi (IHC) tillater sensitiv og spesifikk, romlig presis påvisning av målantigener i formalinfaste, paraffininnstøpte (FFPE) vevsseksjoner. Resultatene av IHC-farging kan imidlertid påvirkes av flere variabler, inkludert varm og kald iskemitid, vevsfiksering, vevsforbehandling, antistoffreaktivitet og konsentrasjon, analysedeteksjonskjemi og reaksjonstider1. Følgelig krever reproduserbar ytelse og tolkning av IHC-reaksjoner streng kontroll av disse variablene og bruk av godt karakteriserte positive og negative kontrollprøver. Ofte brukte kontroller inkluderer paraffininnstøpt vev eller dyrkede cellelinjer kjent fra uavhengige analyser for å uttrykke antigenet av interesse, men slike prøver er ikke alltid tilgjengelige1. Videre forstås ekspresjonsnivåene av målantigenene i vev og cellelinjekontroller generelt bare kvalitativt og kan være variable. Kontroller som inneholder reproduserbare, nøyaktig kjente konsentrasjoner av målantigen kan hjelpe til med optimalisering av IHC-reaksjonsbetingelser. En generell metode, som kan tilpasses en rekke antigentyper i et fysiologisk relevant konsentrasjonsområde for å lage syntetiske IHC-kontrollprøver, er beskrevet av forfatterne2. En detaljert protokoll er gitt her for opprettelse og bruk av denne typen standard.
Hensiktsmessige kontroller er avgjørende for gyldig tolkning av IHC-analyser 1,3,4. Vev, dyrkede celler og peptidbelagte substrater har blitt brukt som IHC-kontroller i henhold til etterforskernes spesifikke behov. Fordelene og begrensningene som ligger i bruk av vev som IHC-kontroller har blitt grundig diskutert 1,4. For mange antistoffer kan passende kontroller velges fra utvalgte normale vev som inneholder cellepopulasjoner som uttrykker målantigenet over et bredt dynamisk område. Vevskontroller er mindre egnet når målantigenet ikke er godt karakterisert med hensyn til ekspresjonssted eller overflod, eller når potensielt kryssreagerende antigener uttrykkes samtidig i de samme cellene eller vevsstedene. I disse sammenhengene kan blokker av dyrkede cellelinjer som uttrykker antigenet av interesse være nyttige. For å gi ytterligere bevis på målspesifisitet, kan cellelinjer konstrueres for å over- eller underuttrykke målantigener. For eksempel ble en slik tilnærming nylig brukt til å evaluere en rekke anti-PD-L1-analyser ved hjelp av en vevsmikromatrise av isogene cellelinjer som uttrykker en rekke PD-L1-antigen5. Praktiske begrensninger for rutinemessig bruk av cellelinjeblokker inkluderer kostnaden og tiden som trengs for å produsere tilstrekkelige celletall, og det faktum at uttrykket av noen antigener kanskje ikke er pålitelig konsistent, selv innenfor klonale cellelinjer6. Syntetiske peptider er et tredje alternativ for IHC-kontroller for antistoffer som gjenkjenner korte lineære epitoper. Steven Bogen og kolleger har publisert mye om bruk av peptider koblet til overflaten av glassglass 7,8 og glassperler9. En studie av denne gruppen viste at kvantitativ analyse av peptidbaserte IHC-kontroller kunne oppdage fargeprosessvariasjon savnet ved kvalitativ evaluering av vevskontroller analysert parallelt10. Mens standarder som bruker perlebaserte antigener kan være allment anvendelige, er mange detaljer proprietære for forfatterne, noe som begrenser utbredt adopsjon.
En annen tilnærming til IHC-standarder inkorporerer målantigener i kunstig opprettede proteingeler. Dette konseptet ble først demonstrert av Per Brandtzaeg i 1972 i en studie der normalt kaninserum ble polymerisert ved bruk av glutaraldehyd11. Små blokker av den resulterende gelen ble deretter gjennomvåt i 1-4 uker i løsninger som inneholder immunoglobulinantigenene av interesse ved forskjellige konsentrasjoner. Etter alkoholfiksering og parafininnbygging ble deler av de resulterende kontrollene vist å flekke med intensiteter som tilsvarer logaritmen til antigenløsningene der de hadde blitt gjennomvåt. Senere fremstilte etterforskere glutaraldehydkonjugater av spesifikke aminosyrer i fortynnede BSA- eller hjernehomogenatløsninger som positive kontroller i immunelektronmikroskopistudier12,13. Nyere arbeid undersøkte bruken av geler laget av formaldehydfaste proteinløsninger som surrogater for FFPE-vev i massespektrometrianalyse14. Et annet nylig arbeid undersøkte strukturen og egenskapene til geler dannet ved oppvarming av humane eller bovine serumalbuminløsninger i forskjellige konsentrasjoner og pH15. Disse forfatterne fant at serumalbumin danner tre typer geler som er forskjellige i mekanisk elastisitet, sekundær strukturbevaring og fettsyrebindende evne avhengig av eksperimentelle forhold. Sammen demonstrerer disse papirene den generelle gjennomførbarheten av tilnærmingen som brukes her. Proteinløsninger med definert sammensetning skaper vevslignende geler som kan viderebehandles, seksjoneres og farges ved hjelp av rutinemessige histologiske metoder.
Denne protokollen beskriver dannelsen av en syntetisk IHC-kontroll laget av bovint serumalbumin (BSA) polymerisert med varme og formaldehyd. Gelene kan inkorporere et bredt utvalg av antigener, inkludert proteiner i full lengde, proteindomener og lineære peptider, samt ikke-proteinantigener inkludert oligonukleotider2. Denne demonstrasjonen bruker et eksempelantigen et lineært peptid som koder for de C-terminale 16 aminosyrene i det humane ERBB2 (HER2/ neu) proteinet TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (se materialtabell). Denne sekvensen inkluderer epitoper anerkjent av tre kommersielt tilgjengelige, diagnostisk relevante antistoffer, inkludert Herceptest polyklonale reagens (ENPEYLGLDVP) og de monoklonale antistoffene CB11 (AENPEYL) og 4B5 (TAENPEYLGL) (se materialtabell)16.
Metoden demonstrert her benytter lett tilgjengelige reagenser ved hjelp av prosesser og teknikker som er kjent for ethvert praktiserende histologisk laboratorium. Den viktigste begrensningen er behovet for å identifisere og kjøpe målantigenene, som i mange tilfeller kan oppnås til en relativt beskjeden kostnad. Fordi disse syntetiske kontrollene er av helt definert sammensetning og laget med enkle metoder, kan de implementeres i mange laboratorier med reproduserbare resultater. Bruken av dem kan lette den objektive, kvantifiserbare evalueringen av IHC-fargeresultater og tillate større intra- og interlaboratorisk reproduserbarhet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

Immunhistokjemi (IHC) analyser gir verdifull innsikt i proteinuttrykksmønstre, hvis pålitelige tolkning krever godt karakteriserte positive og negative kontrollprøver. Fordi passende vevs- eller cellelinjekontroller ikke alltid er tilgjengelige, kan en enkel metode for å lage syntetiske IHC-kontroller være gunstig. En slik metode er beskrevet her. Det kan tilpasses forskjellige antigentyper, inkludert proteiner, peptider eller oligonukleotider, i et bredt spekter av konsentrasjoner. Denne protokollen forklarer trinnene som er nødvendige for å lage syntetiske antigenkontroller, ved å bruke som eksempel et peptid fra det humane erytroblastiske onkogenet B2 (ERBB2 / HER2) intracellulære domenet (ICD) anerkjent av en rekke diagnostisk relevante antistoffer. Serielle fortynninger av HER2 ICD-peptidet i bovint serumalbumin (BSA)-oppløsning blandes med formaldehyd og varmes opp i 10 minutter ved 85 °C for å størkne og kryssbinde peptidet/BSA-blandingen. Den resulterende gelen kan behandles, seksjoneres og farges som et vev, noe som gir en rekke prøver av kjente antigenkonsentrasjoner som spenner over et bredt spekter av fargeintensiteter.
Denne enkle protokollen er i samsvar med rutinemessige histologiske laboratorieprosedyrer. Metoden krever bare at brukeren har en tilstrekkelig mengde av ønsket antigen. Rekombinante proteiner, proteindomener eller lineære peptider som koder for relevante epitoper kan syntetiseres lokalt eller kommersielt. Laboratorier som genererer interne antistoffer kan reservere aliquots av immuniseringsantigenet som det syntetiske kontrollmålet. Muligheten til å lage veldefinerte positive kontroller over et bredt spekter av konsentrasjoner gjør det mulig for brukere å vurdere intra- og interlaboratorieanalyseytelse, få innsikt i det dynamiske området og lineariteten til analysene og optimalisere analyseforholdene for deres spesielle eksperimentelle mål.

Peptider skal oppløses helt i et egnet oppløsningsmiddel ved romtemperatur for å danne en optisk klar oppløsning. Hvis det fortsatt er synlig partikkelformet materiale etter 30-60 minutter, kan det være nyttig å tilsette ytterligere volumer av det opprinnelige oppløsningsvæsken eller et alternativt løsningsmiddel som ikke overstiger det tiltenkte volumet av 5x peptidløsningen beregnet i tabell 1. På samme måte bør den kombinerte peptid/BSA-oppløsningen forbli gjennomskinnelig (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

Dette arbeidet dokumenterer en enkel metode for å lage syntetiske antigenkontroller for immunhistokjemi. Teknikken kan tilpasses en rekke antigener i et bredt spekter av konsentrasjoner. Prøvene gir en referanse for å vurdere intra- og interanalyseytelse og reproduserbarhet.

Syntetiske antigenkontroller for immunhistokjemi

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

BSA antigengeler er godt karakteriserte reproduserbare IHC-standarder som kan supplere eksisterende kontroller. Denne protokollen bruker standard histologi og IHC-reagenser og metoder for å lage reproduserbare standarder for kjent sammensetning. Disse kontrollene gir mulighet for forskjellige laboratorier til å kalibrere og standardisere IHC-analyser for mange diagnostisk relevante analyser.Det er viktig å finne et egnet løsningsmiddel for å oppløse peptidet eller proteinet. Det kan være vanskelig å blande antigen- og formaldehydløsninger raskt uten å introdusere bobler. Til å begynne med, lag 20 milliliter av en 25 volumprosent BSA-løsning ved å blande fem gram BSA-pulver i 14 milliliter PBS, i et 50 milliliter konisk rør til jevnt fordelt.Vortex oppløsningen for å oppløse BSA pulveret. Oppbevar oppløsningen over natten ved fire grader Celsius for fullstendig oppløsning. Neste dag, juster det endelige volumet til 20 milliliter med PBS.På samme måte fremstilles 20 milliliter av en 31,3 volumprosent BSA-løsning ved å blande 6,26 gram BSA-pulver i 13 milliliter PBS. Etter nattlig inkubasjon for fullstendig oppløsning, juster sluttvolumet til 20 milliliter med PBS. For å teste at BSA-formaldehydblandingen danner en gel, forvarm en varmeblokk til 85 grader Celsius.Bland deretter 700 mikroliter av 25% BSA-løsningen med 700 mikroliter 37% formaldehyd. Bland godt ved å pipettere opp og ned fem ganger i løpet av fem til 10 sekunder uten å skape luftbobler. Umiddelbart etter blanding, plasser det lukkede mikrosentrifugerøret i varmeblokken forvarmet til 85 grader Celsius.Etter 10 minutter, fjern røret fra varmeblokken. La det avkjøles og bekreft at gelen har dannet seg som forventet. Forbered og merk åtte 1,5 milliliter mikrosentrifugerør tydelig.Lag deretter en 5x peptidoppløsning, tilsett en 12, 5 millimolar konsentrasjon ved å resuspendere hele massen av det liberaliserte peptidet i 60 mikroliter av det aktuelle løsningsmidlet. Vær oppmerksom på løsningen for å sikre at peptidet er helt oppløst. Tilsett deretter et ekstra volum løsningsmiddel etter behov for å lage en 12,5 millimolar løsning i henhold til peptidene molekylvekt, masse og renhet.I dette eksemplet har 5x peptidstammen et endelig volum på 626, 9 mikroliter. Andre peptidprøver vil kreve et annet sluttvolum. Deretter tilberedes 150 mikroliter av en 1x peptid lagerløsning tilsett en 2, 5 millimolar konsentrasjon ved å fortynne 30 mikroliter av 5x peptidstammen i 120 mikroliter av løsningsmidlet.Vortex løsningen i fem sekunder og sentrifuge ved romtemperatur. Deretter tilberedes 700 mikroliter av en 0, 5 millimolar peptid BSA-løsning ved å fortynne 140 mikroliter av 1x peptidstammen til 560 mikroliter av 31, 3% BSA-løsningen. Etter vortexing, sentrifuger løsningen ved romtemperatur.På samme måte fremstille fire påfølgende 10x seriell fortynning av peptid BSA-stammen ved å tilsette 70 mikroliter av peptid BSA-løsningen til 630 mikroliter av 25% BSA-løsningen. For å forberede BSA-peptidgelene, tilsett 37% formaldehyd til peptidet BSA-fortynninger i ett til ett forhold som arbeider en prøve om gangen. Bland godt ved å pipettere opp og ned fem ganger i løpet av fem til 10 sekunder uten å skape luftbobler.Etter blanding, plasser det lukkede mikrosentrifugerøret i en varmeblokk ved 85 grader Celsius i 10 minutter. Etter at alle peptid-BSA- og formaldehydoppløsningene er tilberedt og oppvarmet, la gelene avkjøles på benken i fem til 10 minutter. Deretter, ved hjelp av en ren, fleksibel disponibel laboratoriespatel, fjern gelprøven fra mikrosentrifugerøret i ett stykke.Og legg den i en forseglet beholder som inneholder minst 15 milliliter nøytral bufret formalin, ved hjelp av en separat beholder for hver prøve. Alternativt, ved hjelp av et nytt enkeltkantet barberblad, klipp av bunnen av mikrosentrifugerøret og skyv gelen ut fra bunnen med luft eller en passende sonde. Bruk en ren enkeltkantet barberhøvel til å trimme gelkeglen i sylindriske skiver omtrent fem millimeter tykke.Etter innpakning av platene i en biopsifolie, legg en større gelskive i en kassett og de resterende gelskivene sammen til en andre kassett for bruk i vevsmikroarraykonstruksjon. Før bearbeiding, plasser kassettgelene i minst 15 milliliter 10% nøytral bufret formalin per gel, ved hjelp av en separat beholder for hver prøve. Deretter behandler du gelene i en automatisert histologivevsprosessor etter en stor vevsplan med trykk og vakuum.Når prøvebehandlingen er fullført, fjern kassettene fra vevsprosessoren og flytt dem til parafininnbyggingssenteret. Etter å ha pakket ut gelene fra biopsifolien, legg inn gelene i parafin eller hver prøve legg inn en gel i en liten 15 x 15 millimeter form. Og de resterende gelskivene sammen i en annen større form.For hver peptidfortynningsserie lager du to glassglass som inneholder totalt seks separate seksjoner. En seksjon fra hver av de fem fortynningsserieprøvene og en seksjon fra BSA bare negativ kontrollprøve. Etter seksjonering og tørking av lysbildene, flekker de to lysbildene forberedt for hvert peptid med ønsket primært antistoff.I henhold til standard immunhistokjemiprotokoller forventer å se et relativt jevnt signal innenfor hver gelseksjon. Med de forskjellige gelprøvene som viser et område av signalintensitet som tilsvarer peptidfortynningene. For BSA gel vev microarray konstruksjon, kutt fire mikrometer tykke deler av vevet microarray og flekk med en kanin monoklonalt antistoff i henhold til laboratoriestandard protokoller.Vurder den resulterende flekkintensiteten kvalitativt ved inspeksjon eller kvantitativt kjøp digital bildeskanning og analyse. Etter å ha reagert med de aktuelle antistoffene, viste negative kontroll BSA bare gelprøver minimalt signal. Signalintensiteten i en individuell gelprøve er relativt jevn og øker med økende antigenkonsentrasjoner.Mer enn 10% av MDA-MB-175-celler viser svak og i helt omkretsmembranøs farging. I motsetning til dette viser mer enn 10% av SKBR-3-cellene intens helt omkretsmembranøs farging Arbeid raskt når formaldehydet er tilsatt fordi løsningene vil begynne å gele selv ved romtemperatur. Vi bruker denne metoden for å gjøre IHC-kontroller ved testing av nye antistoffer for å gi oss tillit til at analysen utføres som forventet, selv når testantistoffene ikke viser noe signal.Vevs- eller cellelinjekontroller er iboende variable. Syntetiske antigenkontroller tillater oss å måle effekten av å endre spesifikke ISD-reaksjonsbetingelser mer presist.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Visual and Narrative Methods to Achieve Fair Process in Clinical Care

The Institute of Medicine has targeted patient-centeredness as an important area of quality improvement. A major dimension of patient-centeredness is ...

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen

Forbedring av apoptotiske og autophagic Induksjon av en roman syntetisk C-1 Analog av 7-deoxypancratistatin i Human Breast adenokarsinom og neuroblastom celler med Tamoxifen

Breast cancer is one of the most common cancers amongst women in North America. Many current anti-cancer treatments, including ionizing radiation, induce ...

Identification of Disease-related Spatial Covariance Patterns using Neuroimaging Data

Identifisering av sykdomsrelaterte Spatial kovariansverktøyene Oppskrifter hvor neuroimaging data

The scaled subprofile model (SSM)1-4 is a multivariate PCA-based algorithm that identifies major sources of variation in patient and control group brain ...

Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

Stigende Aorta Innsnevring i Rats for Opprettelse av Trykk Overbelastning Cardiac Hypertrofi Model

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sekvensiell<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av osteogent Stem / stamceller under brudd Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Modeling and Simulations of Olfactory Drug Delivery with Passive and Active Controls of Nasally Inhaled Pharmaceutical Aerosols

Modellering og Simulering av Olfactory Drug Delivery med passive og aktive kontroller av nasalt Inhalasjon Farmasøytiske Aerosoler

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the ...

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Kvantitativ immunhistokjemi av det cellulære mikromiljøet i pasientglioblastomreseksjoner

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Immunofluorescence merking av menneskelige og murine nøytrofile ekstracellulære feller i parafin-embedded tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

Implantasjon av kombinerte telemetriske EKG og blodtrykkssendere for å bestemme spontan Baroreflex-følsomhet hos bevisste mus

Blood pressure (BP) and heart rate (HR) are both controlled by the autonomic nervous system (ANS) and are closely intertwined due to reflex mechanisms. ...