Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
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Os autores agradecem seus colegas Jeffrey Tom e Aimin Song pela síntese de peptídeos, Nianfeng Ge para construção de TMA, Shari Lau para coloração do IHC, Melissa Edick para digitalização microscópica e Hai Ngu para quantificação de imagem digital.

1. Elaboração de solução de estoque e ferramentas
<ol><li>Prepare 20 mL de uma solução BSA de 25% w/v misturando pó BSA de 5 g em 14 mL de PBS, pH 7,2 em um tubo cônico de 50 mL até dispersar uniformemente. Vórtice, conforme necessário, para dispersar o pó BSA.<ol><li>Mantenha a solução durante a noite a 4 °C para permitir a dissolução completa. Ajuste o volume final para 20 mL com PBS para fazer uma solução de estoque de 25% em w/v.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare 20 mL de uma solução BSA de 31,3% w...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

Este método permite ao usuário criar amostras uniformes de composição conhecida e concentração de antígenos como padrões em reações de IHC, utilizando materiais e técnicas familiares à maioria dos laboratórios de histologia. O passo mais crucial é identificar o epítope ao qual o anticorpo de interesse se liga. Este protocolo descreve o uso de um antígeno de peptídeo linear da CID ERBB2/HER2. O mesmo protocolo pode ser usado para formar géis BSA contendo oligonucleotídeos, rótulos fluorescentes, domín...

A imunohistoquímica (IHC) permite a detecção sensível e específica e espacialmente precisa de antígenos de destino em seções de tecido com fixo de formalina e parafina (FFPE). No entanto, os resultados de coloração do IHC podem ser afetados por múltiplas variáveis, incluindo tempo de isquemia quente e fria, fixação tecidual, pré-tratamento de tecido, reatividade e concentração de anticorpos, química de detecção de ensaios e vezesde reação 1. Assim, o desempenho reprodutível e a interpretação das reações do IHC requerem um controle rigoroso dessas variáveis e o uso de amostras de controle positivas e negativas bem caracterizadas. Os controles frequentemente utilizados incluem tecidos embutidos em parafina ou linhas de células cultivadas conhecidas a partir de análises independentes para expressar o antígeno de interesse, mas essas amostras nem sempre estão disponíveis1. Além disso, os níveis de expressão dos antígenos alvo em tecidos e controles de linha celular são geralmente compreendidos apenas qualitativamente e podem ser variáveis. Controles contendo concentrações reprodutíveis e precisamente conhecidas de antígeno alvo podem auxiliar na otimização das condições de reação do IHC. Um método geral, adaptável a uma variedade de tipos de antígenos em uma gama fisiologicamente relevante de concentrações para criar amostras de controle de IHC sintéticas, foi descrito pelos autores2. Um protocolo detalhado é fornecido aqui para a criação e uso deste tipo de padrão.
Os controles apropriados são essenciais para a interpretação válida dos ensaiosiHC 1,3,4. Tecidos, células cultivadas e substratos revestidos de peptídeos têm sido empregados como controles de IHC de acordo com as necessidades específicas dos investigadores. As vantagens e limitações inerentes ao uso de tecidos como controles de IHC foram amplamente discutidas 1,4. Para muitos anticorpos, os controles apropriados podem ser escolhidos a partir de tecidos normais selecionados contendo populações celulares expressando o antígeno alvo em uma ampla faixa dinâmica. Os controles teciduais são menos adequados quando o antígeno alvo não é bem caracterizado em relação ao local de expressão ou abundância, ou quando antígenos potencialmente de reação cruzada são co-expressos nas mesmas células ou locais de tecido. Nesses contextos, blocos de linhas de células cultivadas expressando o antígeno de interesse podem ser úteis. Para fornecer mais evidências de especificidade de alvo, as linhas de celular podem ser projetadas para antígenos de alvos sobre-ou menos expressos. Por exemplo, tal abordagem foi recentemente usada para avaliar uma variedade de ensaios anti-PD-L1 usando uma microarraia tecidual de linhas celulares isogênicas expressando uma gama de antígeno PD-L15. Limitações práticas ao uso rotineiro de blocos de linha celular incluem o custo e o tempo necessários para produzir números celulares suficientes e o fato de que a expressão de alguns antígenos pode não ser confiável consistente, mesmo dentro das linhas de células clonais6. Peptídeos sintéticos são uma terceira opção para controles IHC para anticorpos que reconhecem epítopos lineares curtos. Steven Bogen e colegas publicaram extensivamente sobre o uso de peptídeos acoplado à superfície de lâminas de vidro 7,8 e contas de vidro9. Um estudo desse grupo demonstrou que a análise quantitativa dos controles de IHC baseados em peptídeos poderia detectar variação do processo de coloração perdida pela avaliação qualitativa dos controles teciduais analisados emparalelo 10. Embora os padrões que usam antígenos baseados em contas possam ser amplamente aplicáveis, muitos detalhes são proprietários dos autores, limitando a adoção generalizada.
Outra abordagem aos padrões de IHC incorpora antígenos-alvo em géis proteicos criados artificialmente. Este conceito foi demonstrado pela primeira vez por Per Brandtzaeg em 1972 em um estudo no qual o soro de coelho normal foi polimerizado usando glutaraldeído11. Pequenos blocos do gel resultante foram então encharcados por 1-4 semanas em soluções contendo os antígenos de imunoglobulina de interesse em várias concentrações. Após a fixação do álcool e a incorporação de parafinas, seções dos controles resultantes mostraram-se manchas com intensidades correspondentes ao logaritmo das soluções de antígeno em que haviam sido encharcadas. Mais tarde, os pesquisadores prepararam conjugados de glutaraldeído de aminoácidos específicos em soluções de BSA diluída ou homogeneizar cérebro como controles positivos em estudos de microscopia imuno-elétron12,13. Trabalho mais recente investigou o uso de géis feitos a partir de soluções proteicas fixas por formaldeído como substitutos para o tecido FFPE na análise de espectrometria de massa14. Outro trabalho recente investigou a estrutura e propriedades dos géis formados pelo aquecimento de soluções de albumina de soro humano ou bovino em diversas concentrações e pH15. Esses autores descobriram que a albumina séum forma três tipos de géis que diferem na elasticidade mecânica, preservação da estrutura secundária e capacidade de ligação de ácidos graxos, dependendo das condições experimentais. Juntos, esses trabalhos demonstram a viabilidade geral da abordagem aqui empregada. Soluções proteicas de composição definida criam géis semelhantes a tecidos que podem ser processados, seccionados e manchados usando métodos histológicos de rotina.
Este protocolo descreve a formação de um controle de IHC sintético feito de albumina de soro bovino (BSA) polimerizada com calor e formaldeído. Os géis podem incorporar uma grande variedade de antígenos, incluindo proteínas de comprimento total, domínios de proteínas e peptídeos lineares, bem como antígenos não proteicos, incluindo oligonucleotídeos2. Esta demonstração usa um exemplo de antígeno um peptídeo linear codificando os aminoácidos C-terminal 16 da proteína humana ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (ver Tabela de Materiais). Esta sequência inclui os epítos reconhecidos por três anticorpos comercialmente disponíveis e relevantes diagnósticos, incluindo o reagente policlonal Herceptest (ENPEYLGLDVP) e os anticorpos monoclonais CB11 (AENPEYL) e 4B5 (TAENPEYLGL) (ver Tabela de Materiais)16.
O método aqui demonstrado emprega reagentes prontamente disponíveis utilizando processos e técnicas familiares a qualquer laboratório de histologia praticante. A limitação mais significativa é a necessidade de identificar e comprar os antígenos alvo, que podem ser realizados em muitos casos a um custo relativamente modesto. Como esses controles sintéticos são de composição totalmente definida e feitos com métodos simples, eles podem ser implementados em muitos laboratórios com resultados reprodutíveis. Seu uso pode facilitar a avaliação objetiva e quantificável dos resultados de coloração do IHC e permitir maior reprodutibilidade intra e interseção de laboratório.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

Os ensaios de imunohistoquímica (IHC) fornecem insights valiosos sobre padrões de expressão proteica, a interpretação confiável da qual requer amostras de controle positivas e negativas bem caracterizadas. Como os controles adequados de tecido ou linha celular nem sempre estão disponíveis, um método simples para criar controles sintéticos de IHC pode ser benéfico. Tal método é descrito aqui. É adaptável a vários tipos de antígeno, incluindo proteínas, peptídeos ou oligonucleotídeos, em uma ampla gama de concentrações. Este protocolo explica as etapas necessárias para a criação de controles de antígeno sintético, utilizando como exemplo um peptídeo do domínio intracelular oncogene B2 (ERBB2/HER2) reconhecido por uma variedade de anticorpos diagnosticicamente relevantes. Diluições seriais do peptídeo HER2 ICD em grédulo bovino (BSA) são misturadas com formaldeído e aquecidas por 10 min a 85 °C para solidificar e cruzar a mistura peptídeo/BSA. O gel resultante pode ser processado, seccionado e manchado como um tecido, produzindo uma série de amostras de concentrações de antígeno conhecidas abrangendo uma ampla gama de intensidades de coloração.
Este protocolo simples é consistente com procedimentos de laboratório de histologia de rotina. O método exige apenas que o usuário tenha uma quantidade suficiente do antígeno desejado. Proteínas recombinantes, domínios proteicos ou peptídeos lineares que codificam epítopos relevantes podem ser sintetizados localmente ou comercialmente. Laboratórios que geram anticorpos internos podem reservar alíquotas do antígeno imunizante como alvo de controle sintético. A oportunidade de criar controles positivos bem definidos em uma ampla gama de concentrações permite que os usuários avaliem o desempenho de ensaios intra e inter-laboratorial, obtenham insights sobre o alcance dinâmico e linearidade de seus ensaios e otimizem condições de ensaio para seus objetivos experimentais particulares.

Os peptídeos devem dissolver-se inteiramente em um solvente apropriado à temperatura ambiente para formar uma solução opticamente clara. Se o material de partículas visíveis ainda estiver presente após 30-60 min, pode ser útil adicionar volumes adicionais do solvente original ou um solvente alternativo não excedendo o volume pretendido da solução de estoque de peptídeo de 5x calculada na Tabela 1. Da mesma forma, a solução de peptídeo/BSA combinada deve permanecer translúcida (<strong cla...

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Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

Este trabalho documenta um método simples para criar controles de antígeno sintético para a imunohistoquímica. A técnica é adaptável a uma variedade de antígenos em uma ampla gama de concentrações. As amostras fornecem uma referência para avaliar o desempenho intra e o ensaio e a reprodutibilidade.

Controles de Antígeno Sintético para Imunohistoquímica

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

Os géis de antígeno BSA são padrões de IHC reprodutíveis bem caracterizados que podem complementar os controles existentes. Este protocolo usa histologia padrão e reagentes IHC e métodos para fazer padrões reprodutíveis de composição conhecida. Esses controles oferecem a oportunidade para diferentes laboratórios calibrarem e padronizarem ensaios de IHC para muitos ensaios diagnosticamente relevantes.É importante encontrar um solvente adequado para dissolver o peptídeo ou proteína. Pode ser complicado misturar soluções de antígeno e formaldeído rapidamente sem introduzir bolhas. Para começar, prepare 20 mililitros de uma solução BSA de 25% de peso em volume, misturando cinco gramas de pó BSA em 14 mililitros de PBS, em um tubo cônico de 50 mililitros até distribuído uniformemente.Vórtice a solução para dissolver o pó BSA. Mantenha a solução durante a noite a quatro graus Celsius para dissolução completa. No dia seguinte, ajuste o volume final para 20 mililitros com PBS.Da mesma forma, prepare 20 mililitros de um peso de 31,3% em volume de solução BSA misturando 6,26 gramas de pó BSA em 13 mililitros de PBS. Após a incubação durante a noite para dissolução completa, ajuste o volume final para 20 mililitros com PBS. Para testar que a mistura de formaldeído BSA forma um gel, pré-aqueça um bloco de calor a 85 graus Celsius.Em seguida, misture 700 microliters da solução 25% BSA com 700 microliters de 37%. Misture bem ao subir e descer cinco vezes dentro de cinco a dez segundos sem criar bolhas de ar. Imediatamente após a mistura, coloque o tubo de micro centrífuga fechado no bloco de calor pré-aquecido a 85 graus Celsius.Após 10 minutos, retire o tubo do bloco de calor. Deixe esfriar e confirme se o gel se formou como esperado. Prepare e rotule claramente oito tubos de micro centrífugas de 1,5 mililitro.Em seguida, prepare uma solução de estoque de peptídeo de 5x, adicione uma concentração de 12,5 mililitros, reutilizando toda a massa do peptídeo liberalizado em 60 microliters do solvente apropriado. Observe a solução para garantir que o peptídeo seja completamente dissolvido. Em seguida, adicione um volume adicional de solvente conforme necessário para fazer uma solução de 12,5 milimões de acordo com os peptídeos peso molecular, massa e pureza.Neste exemplo, o estoque de peptídeos 5x tem um volume final de 626,9 microliters. Outras amostras de peptídeos exigirão um volume final diferente. Em seguida, prepare 150 microliters de uma solução de estoque de peptídeo de 1x adicione uma concentração de 2,5 mililitros diluindo 30 microliters do estoque de peptídeos de 5x em 120 microlitres do solvente.Vórtice a solução por cinco segundos e centrífuga à temperatura ambiente. Em seguida, prepare 700 microliters de uma solução BSA de peptídeo de 0,5 mililitro, diluindo 140 microliters do estoque de peptídeos 1x em 560 microliters da solução BSA de 31,3%. Após o vórtice, centrifufique a solução à temperatura ambiente.Da mesma forma, prepare quatro diluições seriais sucessivas de 10x do estoque bsa peptídeo adicionando 70 microliters da solução peptídeo BSA a 630 microliters da solução 25% BSA. Para preparar os géis de peptídeo bsa, adicione 37% de formaldeído às diluições de peptídeos BSA em uma razão de um para um trabalhando uma amostra de cada vez. Misture bem ao subir e descer cinco vezes dentro de cinco a dez segundos sem criar bolhas de ar.Após a mistura, coloque o tubo de micro centrífuga fechado em um bloco de calor a 85 graus Celsius por 10 minutos. Depois de todas as soluções de peptídeo BSA e formaldeído terem sido preparadas e aquecidas, permita que os géis esfriem no banco por cinco a 10 minutos. Em seguida, usando uma espátula de laboratório descartável limpa e flexível, remova a amostra de gel do tubo de micro centrífuga em uma peça.E coloque-o em um recipiente selado contendo pelo menos 15 mililitros de formalina tamponada neutra, usando um recipiente separado para cada amostra. Alternativamente, usando uma nova lâmina de barbear de borda única, corte a parte inferior do tubo de micro centrífuga e empurre o gel para fora da parte inferior com ar ou uma sonda adequada. Usando uma lâmina de barbear de borda única limpa aparar o cone de gel em discos cilíndricos com aproximadamente cinco milímetros de espessura.Depois de embrulhar os discos em um envoltório de biópsia, coloque um disco de gel maior em um e os discos de gel restantes juntos em um segundo para uso na construção de microarray tecidual. Antes do processamento, coloque os géis em pelo menos 15 mililitros de formalina tamponada 10% neutra por gel, usando um recipiente separado para cada amostra. Em seguida, processe os géis em um processador automatizado de tecido histologia seguindo um grande cronograma de tecido com pressão e vácuo.Quando o processamento da amostra estiver concluído, remova as fitas do processador de tecido e mova-as para o centro de incorporação da parafina. Depois de desembrulhar os géis do envoltório da biópsia, incorpore os géis em parafina ou cada amostra incorpore um disco de gel em um pequeno molde de 15 por 15 milímetros. E os discos de gel restantes juntos em um segundo molde maior.Para cada série de diluição de peptídeos, crie dois slides de vidro contendo um total de seis seções separadas. Uma seção de cada uma das cinco amostras da série de diluição e uma seção da BSA apenas amostra de controle negativo. Após a secção e secagem dos slides, manche os dois slides preparados para cada peptídeo com o anticorpo primário desejado.De acordo com os protocolos padrão de imunohistoquímica esperam ver um sinal relativamente uniforme dentro de cada seção de gel. Com as diferentes amostras de gel mostrando uma gama de intensidade de sinal correspondente às diluições do peptídeo. Para a construção de microarray de tecido gel BSA, corte quatro seções de micrometro de espessura da microarray tecidual e colorisse com um anticorpo monoclonal de coelho de acordo com protocolos padrão laboratorial.Avalie a intensidade da mancha resultante qualitativamente por inspeção ou compre quantitativamente digitalização e análise de imagens. Após reagir com os anticorpos apropriados, o controle negativo BSA apenas amostras de gel mostrou sinal mínimo. A intensidade do sinal em uma amostra de gel individual é relativamente uniforme e aumenta com o aumento das concentrações de antígeno.Mais de 10% das células MDA-MB-175 apresentam leve e em coloração membranous completamente circunferencial. Em contraste, mais de 10% das células SKBR-3, mostram uma mancha membranous completamente circunferencial intensa Trabalhe rapidamente uma vez que o formaldeído tenha sido adicionado porque as soluções começarão a gelar mesmo à temperatura ambiente. Usamos este método para fazer controles de IHC ao testar novos anticorpos para nos dar confiança de que o ensaio realizado como esperado, mesmo quando os anticorpos de teste não mostram nenhum sinal.Os controles de tecido ou linha celular são inerentemente variáveis. Os controles de antígeno sintético permitem medir o efeito da mudança das condições específicas de reação do ISD com mais precisão.

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