Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
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Los autores agradecen a sus colegas Jeffrey Tom y Aimin Song por la síntesis de péptidos, Nianfeng Ge por la construcción de TMA, Shari Lau por la tinción de IHC, Melissa Edick por el escaneo microscópico digital y Hai Ngu por la cuantificación digital de imágenes.

1. Preparación de soluciones de stock y herramientas
<ol><li>Preparar 20 ml de una solución de BSA al 25% p/v mezclando 5 g de polvo de BSA en 14 ml de PBS, pH 7,2 en un tubo cónico de 50 ml hasta que se disperse uniformemente. Vórtice según sea necesario para dispersar el polvo de BSA.<ol><li>Mantenga la solución durante la noche a 4 °C para permitir la disolución completa. Ajuste el volumen final a 20 ml con PBS para hacer una solución de stock al 25% p/v.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar 20 ml de una solució...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

Este método permite al usuario crear muestras uniformes de composición conocida y concentración de antígenos como estándares en las reacciones de IHC, utilizando materiales y técnicas familiares para la mayoría de los laboratorios de histología. El paso más crucial es identificar el epítopo al que se une el anticuerpo de interés. Este protocolo describe el uso de un antígeno peptídico lineal del ICD ERBB2/HER2. El mismo protocolo se puede utilizar para formar geles BSA que contienen oligonucleótidos, etique...

La inmunohistoquímica (IHC) permite la detección sensible y específica y espacialmente precisa de antígenos diana en secciones de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina (FFPE). Sin embargo, los resultados de la tinción de IHC pueden verse afectados por múltiples variables, incluido el tiempo de isquemia caliente y fría, la fijación tisular, el pretratamiento tisular, la reactividad y concentración de anticuerpos, la química de detección de ensayos y los tiempos de reacción1. En consecuencia, el rendimiento reproducible y la interpretación de las reacciones de IHC requieren un control riguroso de estas variables y el uso de muestras de control positivas y negativas bien caracterizadas. Los controles de uso frecuente incluyen tejidos incrustados en parafina o líneas celulares cultivadas conocidas por análisis independientes para expresar el antígeno de interés, pero tales muestras no siempre están disponibles1. Además, los niveles de expresión de los antígenos diana en tejidos y controles de líneas celulares generalmente se entienden solo cualitativamente y pueden ser variables. Los controles que contienen concentraciones reproducibles y conocidas con precisión de antígeno objetivo pueden ayudar a optimizar las condiciones de reacción de la IHC. Los autores han descrito un método general, adaptable a una variedad de tipos de antígenos en un rango de concentraciones fisiológicamente relevante para crear muestras sintéticas de control de IHC2. Aquí se proporciona un protocolo detallado para la creación y el uso de este tipo de estándar.
Los controles adecuados son esenciales para la interpretación válida de los ensayos de IHC 1,3,4. Los tejidos, las células cultivadas y los sustratos recubiertos de péptidos se han empleado como controles de IHC de acuerdo con las necesidades específicas de los investigadores. Las ventajas y limitaciones inherentes al uso de tejidos como controles de IHC han sido ampliamente discutidas 1,4. Para muchos anticuerpos, se pueden elegir controles apropiados de tejidos normales seleccionados que contienen poblaciones celulares que expresan el antígeno objetivo en un amplio rango dinámico. Los controles tisulares son menos adecuados cuando el antígeno objetivo no está bien caracterizado en cuanto al sitio de expresión o la abundancia, o cuando los antígenos potencialmente de reacción cruzada se coexpresan en las mismas células o sitios tisulares. En estos contextos, los bloques de líneas celulares cultivadas que expresan el antígeno de interés pueden ser útiles. Para proporcionar más evidencia de la especificidad del objetivo, las líneas celulares pueden diseñarse para sobreexpresar o subexpresar los antígenos objetivo. Por ejemplo, este enfoque se utilizó recientemente para evaluar una variedad de ensayos anti-PD-L1 utilizando un microarray tisular de líneas celulares isogénicas que expresan un rango de antígenoPD-L1 5. Las limitaciones prácticas para el uso rutinario de bloques de líneas celulares incluyen el costo y el tiempo necesarios para producir un número suficiente de células y el hecho de que la expresión de algunos antígenos puede no ser confiablemente consistente, incluso dentro de las líneas celulares clonales6. Los péptidos sintéticos son una tercera opción para los controles de IHC para anticuerpos que reconocen epítopos lineales cortos. Steven Bogen y sus colegas han publicado extensamente sobre el uso de péptidos acoplados a la superficie de los portaobjetos de vidrio 7,8 y las perlas de vidrio9. Un estudio realizado por este grupo demostró que el análisis cuantitativo de los controles de IHC basados en péptidos podría detectar la variación del proceso de tinción omitida por la evaluación cualitativa de los controles tisulares analizados en paralelo10. Si bien los estándares que utilizan antígenos basados en cuentas podrían ser ampliamente aplicables, muchos detalles son propiedad de los autores, lo que limita la adopción generalizada.
Otro enfoque para los estándares de IHC incorpora antígenos objetivo en geles de proteínas creados artificialmente. Este concepto fue demostrado por primera vez por Per Brandtzaeg en 1972 en un estudio en el que el suero normal de conejo se polimerizó utilizando glutaraldehído11. Pequeños bloques del gel resultante se remojaron durante 1-4 semanas en soluciones que contenían los antígenos de inmunoglobulina de interés en varias concentraciones. Después de la fijación de alcohol y la incrustación de parafina, se demostró que las secciones de los controles resultantes se tiñen con intensidades correspondientes al logaritmo de las soluciones de antígenos en las que se habían empapado. Posteriormente, los investigadores prepararon conjugados de glutaraldehído de aminoácidos específicos en soluciones diluidas de BSA u homogeneizados cerebrales como controles positivos en estudios de microscopía inmunoelectrónica12,13. Trabajos más recientes investigaron el uso de geles hechos de soluciones proteicas fijadas con formaldehído como sustitutos para el tejido FFPE en el análisis de espectrometría de masas14. Otro trabajo reciente investigó la estructura y las propiedades de los geles formados por el calentamiento de soluciones de albúmina sérica humana o bovina a diversas concentraciones y pH15. Estos autores encontraron que la albúmina sérica forma tres tipos de geles que difieren en elasticidad mecánica, preservación de la estructura secundaria y capacidad de unión a ácidos grasos dependiendo de las condiciones experimentales. Juntos, estos documentos demuestran la viabilidad general del enfoque empleado aquí. Las soluciones proteicas de composición definida crean geles similares a los tejidos que se pueden procesar, seccionar y teñir utilizando métodos histológicos de rutina.
Este protocolo describe la formación de un control sintético de IHC hecho de albúmina sérica bovina (BSA) polimerizada con calor y formaldehído. Los geles pueden incorporar una amplia variedad de antígenos, incluyendo proteínas de longitud completa, dominios proteicos y péptidos lineales, así como antígenos no proteicos incluyendo oligonucleótidos2. Esta demostración utiliza un antígeno de ejemplo, un péptido lineal que codifica los aminoácidos C-terminal 16 de la proteína humana ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (ver Tabla de Materiales). Esta secuencia incluye los epítopos reconocidos por tres anticuerpos disponibles comercialmente y relevantes para el diagnóstico, incluidos el reactivo policlonal Herceptest (ENPEYLGLDVP) y los anticuerpos monoclonales CB11 (AENPEYL) y 4B5 (TAENPEYLGL) (ver Tabla de Materiales)16.
El método demostrado aquí emplea reactivos fácilmente disponibles utilizando procesos y técnicas familiares para cualquier laboratorio de histología practicante. La limitación más importante es la necesidad de identificar y comprar los antígenos objetivo, lo que se puede lograr en muchos casos a un costo relativamente modesto. Debido a que estos controles sintéticos son de composición totalmente definida y están hechos con métodos simples, se pueden implementar en muchos laboratorios con resultados reproducibles. Su uso puede facilitar la evaluación objetiva y cuantificable de los resultados de tinción de IHC y permitir una mayor reproducibilidad intra e interlaboratorio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

Los ensayos de inmunohistoquímica (IHC) proporcionan información valiosa sobre los patrones de expresión de proteínas, cuya interpretación confiable requiere muestras de control positivas y negativas bien caracterizadas. Debido a que los controles apropiados de tejido o línea celular no siempre están disponibles, un método simple para crear controles sintéticos de IHC puede ser beneficioso. Tal método se describe aquí. Es adaptable a varios tipos de antígenos, incluyendo proteínas, péptidos u oligonucleótidos, en una amplia gama de concentraciones. Este protocolo explica los pasos necesarios para crear controles de antígenos sintéticos, utilizando como ejemplo un péptido del dominio intracelular (ICD) del oncogén eritroblástico humano B2 (ERBB2 / HER2) reconocido por una variedad de anticuerpos relevantes para el diagnóstico. Las diluciones seriadas del péptido HER2 ICD en solución de albúmina sérica bovina (BSA) se mezclan con formaldehído y se calientan durante 10 min a 85 °C para solidificar y reticular la mezcla de péptido/BSA. El gel resultante puede ser procesado, seccionado y teñido como un tejido, produciendo una serie de muestras de concentraciones conocidas de antígenos que abarcan una amplia gama de intensidades de tinción.
Este protocolo simple es consistente con los procedimientos rutinarios del laboratorio de histología. El método solo requiere que el usuario tenga una cantidad suficiente del antígeno deseado. Las proteínas recombinantes, los dominios proteicos o los péptidos lineales que codifican epítopos relevantes pueden sintetizarse local o comercialmente. Los laboratorios que generan anticuerpos internos pueden reservar alícuotas del antígeno inmunizante como objetivo de control sintético. La oportunidad de crear controles positivos bien definidos en una amplia gama de concentraciones permite a los usuarios evaluar el rendimiento de los ensayos intra e interlaboratorios, obtener información sobre el rango dinámico y la linealidad de sus ensayos y optimizar las condiciones de ensayo para sus objetivos experimentales particulares.

Los péptidos deben disolverse completamente en un disolvente apropiado a temperatura ambiente para formar una solución ópticamente transparente. Si el material particulado visible todavía está presente después de 30-60 min, puede ser útil agregar volúmenes adicionales del disolvente original o un disolvente alternativo que no exceda el volumen previsto de la solución de 5x péptido calculada en la Tabla 1. Del mismo modo, la solución combinada de péptido/BSA debe permanecer translúcida (<stro...

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Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

Este trabajo documenta un método simple para crear controles de antígenos sintéticos para la inmunohistoquímica. La técnica es adaptable a una variedad de antígenos en una amplia gama de concentraciones. Las muestras proporcionan una referencia con la que evaluar el rendimiento y la reproducibilidad intra e interensayo.

Controles de antígenos sintéticos para inmunohistoquímica

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

Los geles de antígenos BSA son estándares IHC reproducibles bien caracterizados que pueden complementar los controles existentes. Este protocolo utiliza histología estándar y reactivos y métodos de IHQ para hacer estándares reproducibles de composición conocida. Estos controles brindan la oportunidad a diferentes laboratorios de calibrar y estandarizar los ensayos IHQ para muchos ensayos relevantes para el diagnóstico.Es importante encontrar un disolvente adecuado para disolver el péptido o proteína. Puede ser difícil mezclar soluciones de antígeno y formaldehído rápidamente sin introducir burbujas. Para comenzar, prepare 20 mililitros de una solución de BSA de 25% de peso por volumen mezclando cinco gramos de polvo de BSA en 14 mililitros de PBS, en un tubo cónico de 50 mililitros hasta que se distribuya uniformemente.Vortex la solución para disolver el polvo BSA. Mantenga la solución durante la noche a cuatro grados centígrados para una disolución completa. Al día siguiente, ajuste el volumen final a 20 mililitros con PBS.Del mismo modo, prepare 20 mililitros de una solución de BSA de 31.3% de peso por volumen mezclando 6.26 gramos de polvo de BSA en 13 mililitros de PBS. Después de la incubación nocturna para una disolución completa, ajuste el volumen final a 20 mililitros con PBS. Para probar que la mezcla de formaldehído BSA forma un gel, precaliente un bloque de calor a 85 grados centígrados.Luego mezcle 700 microlitros de la solución BSA al 25% con 700 microlitros de formaldehído al 37%. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces en cinco a 10 segundos sin crear burbujas de aire. Inmediatamente después de mezclar, coloque el tubo de microcentrífuga cerrado en el bloque de calor precalentado a 85 grados centígrados.Después de 10 minutos, retire el tubo del bloque de calor. Deje que se enfríe y confirme que el gel se ha formado como se esperaba. Prepare y etiquete claramente ocho tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Luego prepare una solución madre de péptidos 5x, agregue una concentración de 12.5 milimolar resuspendiendo toda la masa del péptido liberalizado en 60 microlitros del solvente apropiado. Observe la solución para asegurarse de que el péptido esté completamente disuelto. Luego agregue un volumen adicional de solvente según sea necesario para hacer una solución milimolar de 12.5 de acuerdo con el peso, la masa y la pureza molecular de los péptidos.En este ejemplo, el stock de péptidos 5x tiene un volumen final de 626.9 microlitros. Otras muestras de péptidos requerirán un volumen final diferente. A continuación, prepare 150 microlitros de una solución madre de péptidos 1x y agregue una concentración de 2.5 milimolar diluyendo 30 microlitros del stock de péptidos 5x en 120 microlitros del solvente.Vortex la solución durante cinco segundos y centrifugar a temperatura ambiente. A continuación, prepare 700 microlitros de una solución BSA de péptido 0,5 milimolar diluyendo 140 microlitros del stock de péptidos 1x en 560 microlitros de la solución BSA al 31,3%. Después del vórtice, centrifugar la solución a temperatura ambiente.Del mismo modo, prepare cuatro diluciones seriadas sucesivas 10x del cepto BSA agregando 70 microlitros de la solución de péptido BSA a 630 microlitros de la solución BSA al 25%. Para preparar los geles peptídicos BSA, agregue formaldehído al 37% a las diluciones de péptidos BSA en una proporción de uno a uno trabajando una muestra a la vez. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces en cinco a 10 segundos sin crear burbujas de aire.Después de mezclar, coloque el tubo de microcentrífuga cerrado en un bloque de calor a 85 grados centígrados durante 10 minutos. Después de que todas las soluciones de péptidos BSA y formaldehído se hayan preparado y calentado, deje que los geles se enfríen en la mesa de trabajo durante cinco a 10 minutos. A continuación, utilizando una espátula de laboratorio desechable limpia y flexible, retire la muestra de gel del tubo de microcentrífuga en una sola pieza.Y colóquelo en un recipiente sellado que contenga al menos 15 mililitros de formalina tamponada neutra, utilizando un recipiente separado para cada muestra. Alternativamente, usando una nueva cuchilla de afeitar de un solo filo, corte la parte inferior del tubo de microcentrífuga y empuje el gel desde la parte inferior con aire o una sonda adecuada. Usando una maquinilla de afeitar limpia de un solo borde, recorte el cono de gel en discos cilíndricos de aproximadamente cinco milímetros de espesor.Después de envolver los discos en una envoltura de biopsia, coloque un disco de gel más grande en un casete y los discos de gel restantes juntos en un segundo casete para su uso en la construcción de microarrays de tejido. Antes del procesamiento, coloque los geles de casete en al menos 15 mililitros de formalina tamponada neutra al 10% por gel, utilizando un recipiente separado para cada muestra. A continuación, procese los geles en un procesador de tejido histológico automatizado siguiendo un programa de tejido grande con presión y vacío.Cuando se complete el procesamiento de la muestra, retire los casetes del procesador de tejidos y muévalos al centro de incrustación de parafina. Después de desenvolver los geles de la envoltura de biopsia, incruste los geles en parafina o cada muestra inserte un disco de gel en un molde pequeño de 15 por 15 milímetros. Y los discos de gel restantes se unen en un segundo molde más grande.Para cada serie de dilución peptídica, cree dos portaobjetos de vidrio que contengan un total de seis secciones separadas. Una sección de cada una de las cinco muestras de la serie de dilución y una sección de la muestra de control negativo de BSA solamente. Después de seccionar y secar los portaobjetos, tiñe los dos portaobjetos preparados para cada péptido con el anticuerpo primario deseado.De acuerdo con los protocolos estándar de inmunohistoquímica, espere ver una señal relativamente uniforme dentro de cada sección de gel. Con las diferentes muestras de gel mostrando un rango de intensidad de señal correspondiente a las diluciones peptídicas. Para la construcción de microarrays de tejido de gel BSA, corte secciones de cuatro micrómetros de espesor del microarray de tejido y tiñe con un anticuerpo monoclonal de conejo de acuerdo con los protocolos estándar de laboratorio.Evalúe cualitativamente la intensidad de la mancha resultante mediante inspección o compre cuantitativamente escaneo y análisis de imágenes digitales. Después de reaccionar con los anticuerpos apropiados, las muestras de gel de control negativo de BSA solo mostraron una señal mínima. La intensidad de la señal en una muestra de gel individual es relativamente uniforme y aumenta con el aumento de las concentraciones de antígenos.Más del 10% de las células MDA-MB-175 muestran tinción membranosa débil y completamente circunferencial. En contraste, más del 10% de las células SKBR-3, muestran una intensa tinción membranosa completamente circunferencial Trabajar rápidamente una vez que se ha agregado el formaldehído porque las soluciones comenzarán a gelificarse incluso a temperatura ambiente. Utilizamos este método para realizar controles de IHQ cuando se prueban nuevos anticuerpos para darnos la confianza de que el ensayo funcionó como se esperaba, incluso cuando los anticuerpos de prueba no muestran ninguna señal.Los controles de tejidos o líneas celulares son inherentemente variables. Los controles de antígenos sintéticos nos permiten medir el efecto de cambiar las condiciones específicas de reacción ISD con mayor precisión.

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