Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

Författarna erkänner tacksamt sina kollegor Jeffrey Tom och Aimin Song för peptidsyntes, Nianfeng Ge för TMA-konstruktion, Shari Lau för IHC-färgning, Melissa Edick för digital mikroskopisk skanning och Hai Ngu för digital bildkvantifiering.

1. Beredning av lagerlösning och verktyg
<ol><li>Bered 20 ml av en 25 % w/v BSA-lösning genom att blanda 5 g BSA-pulver i 14 ml PBS, pH 7,2 i ett 50 ml koniskt rör tills det är jämnt dispergerat. Virvel vid behov för att sprida BSA-pulvret.<ol><li>Förvara lösningen över natten vid 4 °C för att möjliggöra fullständig upplösning. Justera den slutliga volymen till 20 ml med PBS för att skapa en 25% w / v lagerlösning.</li>
	</ol></li>
	<li>Bered 20 ml av en 31,3 % w/v BSA-lösning genom att blanda 6,26 g ...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

Denna metod gör det möjligt för användaren att skapa enhetliga prover av känd sammansättning och antigenkoncentration som standarder i IHC-reaktioner, med hjälp av material och tekniker som är bekanta för de flesta histologilaboratorier. Det mest avgörande steget är att identifiera epitopen som antikroppen av intresse binder till. Detta protokoll beskriver användning av ett linjärt peptidantigen från ERBB2 / HER2 ICD. Samma protokoll kan användas för att bilda BSA-geler som innehåller oligonukleotider, f...

Immunohistokemi (IHC) möjliggör känslig och specifik, rumsligt exakt detektion av målantigener i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnadssektioner. IHC-färgningsresultat kan dock påverkas av flera variabler, inklusive varm och kall ischemitid, vävnadsfixering, vävnadsförbehandling, antikroppsreaktivitet och koncentration, analysdetekteringskemi och reaktionstider1. Följaktligen kräver reproducerbar prestanda och tolkning av IHC-reaktioner noggrann kontroll av dessa variabler och användning av väl karakteriserade positiva och negativa kontrollprover. Ofta använda kontroller inkluderar paraffininbäddade vävnader eller odlade cellinjer som är kända från oberoende analyser för att uttrycka antigenet av intresse, men sådana prover är inte alltid tillgängliga1. Dessutom förstås uttrycksnivåerna för målantigenerna i vävnader och cellinjekontroller i allmänhet endast kvalitativt och kan vara varierande. Kontroller som innehåller reproducerbara, exakt kända koncentrationer av målantigen kan hjälpa till att optimera IHC-reaktionsbetingelserna. En allmän metod, anpassningsbar till en mängd olika antigentyper i ett fysiologiskt relevant koncentrationsområde för att skapa syntetiska IHC-kontrollprover, har beskrivits av författarna2. Ett detaljerat protokoll tillhandahålls här för skapande och användning av denna typ av standard.
Lämpliga kontroller är avgörande för en giltig tolkning av IHC-testerna 1,3,4. Vävnader, odlade celler och peptidbelagda substrat har använts som IHC-kontroller enligt utredarnas specifika behov. Fördelarna och begränsningarna med att använda vävnader som IHC-kontroller har diskuterats utförligt 1,4. För många antikroppar kan lämpliga kontroller väljas från utvalda normala vävnader som innehåller cellpopulationer som uttrycker målantigenet över ett brett dynamiskt intervall. Vävnadskontroller är mindre lämpliga när målantigenet inte är väl karakteriserat med avseende på uttrycksställe eller förekomst, eller när potentiellt korsreagerande antigener uttrycks samtidigt i samma celler eller vävnadsställen. I dessa sammanhang kan block av odlade cellinjer som uttrycker antigenet av intresse vara till hjälp. För att ge ytterligare bevis på målspecificitet kan cellinjer konstrueras för att över- eller underuttrycka målantigen. Till exempel användes ett sådant tillvägagångssätt nyligen för att utvärdera en mängd olika anti-PD-L1-analyser med användning av en vävnadsmikroarray av isogena cellinjer som uttrycker ett intervall av PD-L1-antigen5. Praktiska begränsningar för den rutinmässiga användningen av cellinjeblock inkluderar kostnaden och tiden som krävs för att producera tillräckligt med cellnummer och det faktum att uttrycket av vissa antigener kanske inte är tillförlitligt konsekvent, även inom klonala cellinjer6. Syntetiska peptider är ett tredje alternativ för IHC-kontroller för antikroppar som känner igen korta linjära epitoper. Steven Bogen och kollegor har publicerat mycket om användningen av peptider kopplade till ytan av glasskivor 7,8 och glaspärlor9. En studie av denna grupp visade att kvantitativ analys av peptidbaserade IHC-kontroller kunde upptäcka färgningsprocessvariation missad av kvalitativ utvärdering av vävnadskontroller analyserade parallellt10. Även om standarder som använder pärlbaserade antigener kan vara allmänt tillämpliga, är många detaljer proprietära för författarna, vilket begränsar utbredd användning.
Ett annat tillvägagångssätt för IHC-standarder innehåller målantigener i artificiellt skapade proteingeler. Detta koncept demonstrerades först av Per Brandtzaeg 1972 i en studie där normalt kaninserum polymeriserades med användning av glutaraldehyd11. Små block av den resulterande gelén blötläggdes sedan i 1-4 veckor i lösningar innehållande immunoglobulinantigen av intresse vid olika koncentrationer. Efter alkoholfixering och paraffininbäddning visade sig delar av de resulterande kontrollerna fläcka med intensiteter som motsvarade logaritmen för antigenlösningarna i vilka de hade blötläggts. Senare framställde utredare glutaraldehydkonjugat av specifika aminosyror i utspädda BSA- eller hjärnhomogenatlösningar som positiva kontroller i immunelektronmikroskopistudier 12,13. Nyare arbete undersökte användningen av geler tillverkade av formaldehydfixerade proteinlösningar som surrogater för FFPE-vävnad i masspektrometrianalys14. Ett annat nyligen utfört arbete undersökte strukturen och egenskaperna hos geler som bildas genom upphettning av humana eller bovina serumalbuminlösningar vid olika koncentrationer och pH15. Dessa författare fann att serumalbumin bildar tre typer av geler som skiljer sig åt i mekanisk elasticitet, sekundär strukturbevarande och fettsyrabindande förmåga beroende på experimentella förhållanden. Tillsammans visar dessa dokument den allmänna genomförbarheten av det tillvägagångssätt som används här. Proteinlösningar med definierad sammansättning skapar vävnadsliknande geler som kan bearbetas, sektioneras och färgas ytterligare med rutinmässiga histologiska metoder.
Detta protokoll beskriver bildandet av en syntetisk IHC-kontroll gjord av bovint serumalbumin (BSA) polymeriserat med värme och formaldehyd. Gelerna kan innehålla en mängd olika antigener, inklusive proteiner i full längd, proteindomäner och linjära peptider, såväl som icke-proteinantigener inklusive oligonukleotider2. Denna demonstration använder ett exempelantigen en linjär peptid som kodar för C-terminala 16 aminosyror av det humana ERBB2 (HER2 / neu) proteinet TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (se materialtabell). Denna sekvens inkluderar de epitoper som känns igen av tre kommersiellt tillgängliga, diagnostiskt relevanta antikroppar inklusive Herceptest polyklonalt reagens (ENPEYLGLDVP) och de monoklonala antikropparna CB11 (AENPEYL) och 4B5 (TAENPEYLGL) (se materialtabell)16.
Metoden som demonstreras här använder lättillgängliga reagenser med hjälp av processer och tekniker som är bekanta för alla praktiserande histologilaboratorier. Den viktigaste begränsningen är behovet av att identifiera och köpa målantigenerna, vilket i många fall kan uppnås till en relativt blygsam kostnad. Eftersom dessa syntetiska kontroller är av helt definierad sammansättning och gjorda med enkla metoder kan de implementeras i många laboratorier med reproducerbara resultat. Deras användning kan underlätta en objektiv, kvantifierbar utvärdering av IHC-färgningsresultat och möjliggöra större reproducerbarhet inom och mellan laboratorier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

Immunohistokemi (IHC) analyser ger värdefulla insikter i proteinuttrycksmönster, vars tillförlitliga tolkning kräver väl karakteriserade positiva och negativa kontrollprover. Eftersom lämpliga vävnads- eller cellinjekontroller inte alltid är tillgängliga kan en enkel metod för att skapa syntetiska IHC-kontroller vara fördelaktig. En sådan metod beskrivs här. Det är anpassningsbart till olika antigentyper, inklusive proteiner, peptider eller oligonukleotider, i ett brett spektrum av koncentrationer. Detta protokoll förklarar de steg som krävs för att skapa syntetiska antigenkontroller, med hjälp av som exempel en peptid från den humana erytroblastiska onkogenen B2 (ERBB2 / HER2) intracellulära domänen (ICD) som känns igen av en mängd diagnostiskt relevanta antikroppar. Seriella utspädningar av HER2 ICD-peptiden i bovin serumalbuminlösning (BSA) blandas med formaldehyd och upphettas i 10 minuter vid 85 °C för att stelna och tvärbinda peptid/BSA-blandningen. Den resulterande gelén kan bearbetas, sektioneras och färgas som en vävnad, vilket ger en serie prover av kända antigenkoncentrationer som spänner över ett brett spektrum av färgningsintensiteter.
Detta enkla protokoll överensstämmer med rutinmässiga histologilabbprocedurer. Metoden kräver endast att användaren har en tillräcklig mängd av det önskade antigenet. Rekombinanta proteiner, proteindomäner eller linjära peptider som kodar för relevanta epitoper kan syntetiseras lokalt eller kommersiellt. Laboratorier som genererar interna antikroppar kan reservera alikvoter av det immuniserande antigenet som syntetiskt kontrollmål. Möjligheten att skapa väldefinierade positiva kontroller över ett brett spektrum av koncentrationer gör det möjligt för användare att bedöma analysprestanda inom och mellan laboratorier, få insikt i det dynamiska omfånget och linjäriteten hos deras analyser och optimera analysförhållandena för deras specifika experimentella mål.

Peptider bör lösas upp helt i ett lämpligt lösningsmedel vid rumstemperatur för att bilda en optiskt klar lösning. Om synligt partikelmaterial fortfarande finns kvar efter 30–60 minuter kan det vara till hjälp att tillsätta ytterligare volymer av det ursprungliga lösningsmedlet eller ett alternativt lösningsmedel som inte överstiger den avsedda volymen av den 5x peptidbeståndslösning som beräknas i tabell 1. På samma sätt bör den kombinerade peptid/BSA-lösningen förbli genomskinlig (...

Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

Detta arbete dokumenterar en enkel metod för att skapa syntetiska antigenkontroller för immunhistokemi. Tekniken är anpassningsbar till en mängd olika antigener i ett brett spektrum av koncentrationer. Proverna ger en referens för att bedöma prestanda och reproducerbarhet inom och mellan analyser.

Syntetiska antigenkontroller för immunhistokemi

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

BSA-antigengeler är väl karakteriserade reproducerbara IHC-standarder som kan komplettera befintliga kontroller. Detta protokoll använder standardhistologi och IHC-reagenser och metoder för att göra reproducerbara standarder för känd sammansättning. Dessa kontroller ger möjlighet för olika laboratorier att kalibrera och standardisera IHC-analyser för många diagnostiskt relevanta analyser.Det är viktigt att hitta ett lämpligt lösningsmedel för att lösa upp peptiden eller proteinet. Det kan vara knepigt att blanda antigen- och formaldehydlösningar snabbt utan att införa bubblor. För att börja, förbered 20 ml av en 25% vikt i volym BSA-lösning genom att blanda fem gram BSA-pulver i 14 ml PBS, i ett 50 ml koniskt rör tills det är jämnt fördelat.Vortex lösningen för att lösa upp BSA-pulvret. Håll lösningen över natten vid fyra grader Celsius för fullständig upplösning. Följande dag, justera den slutliga volymen till 20 ml med PBS.På samma sätt bereder du 20 ml av en 31,3 volymprocent BSA-lösning genom att blanda 6,26 gram BSA-pulver i 13 ml PBS. Efter inkubation över natten för fullständig upplösning, justera den slutliga volymen till 20 ml med PBS. För att testa att BSA-formaldehydblandningen bildar en gel, förvärm ett värmeblock till 85 grader Celsius.Blanda sedan 700 mikroliter av 25% BSA-lösningen med 700 mikroliter 37% formaldehyd. Blanda väl genom att pipettera upp och ner fem gånger inom fem till 10 sekunder utan att skapa luftbubblor. Omedelbart efter blandning, placera det slutna mikrocentrifugröret i värmeblocket förvärmt till 85 grader Celsius.Efter 10 minuter, ta bort röret från värmeblocket. Låt det svalna och bekräfta att gelén har bildats som förväntat. Förbered och märk tydligt åtta 1,5 ml mikrocentrifugrör.Förbered sedan en 5x peptidstamlösning, tillsätt en 12,5 millimolär koncentration genom att återsuspendera hela massan av den liberaliserade peptiden i 60 mikroliter av lämpligt lösningsmedel. Observera lösningen för att säkerställa att peptiden är helt upplöst. Tillsätt sedan en ytterligare volym lösningsmedel efter behov för att göra en 12,5 millimolär lösning enligt peptidernas molekylvikt, massa och renhet.I detta exempel har 5x peptidbeståndet en slutlig volym på 626,9 mikroliter. Andra peptidprover kräver en annan slutlig volym. Förbered sedan 150 mikroliter av en 1x peptidstamlösning tillsätt en 2,5 millimolär koncentration genom att späda 30 mikroliter av 5x peptidbeståndet i 120 mikroliter av lösningsmedlet.Vörda lösningen i fem sekunder och centrifugera vid rumstemperatur. Förbered sedan 700 mikroliter av en 0,5 millimolär peptid BSA-lösning genom att späda 140 mikroliter av 1x peptidbeståndet i 560 mikroliter av 31,3% BSA-lösningen. Efter virvel, centrifugera lösningen vid rumstemperatur.På liknande sätt framställa fyra på varandra följande 10x seriell utspädning av peptid BSA-stammen genom att tillsätta 70 mikroliter peptid BSA-lösning till 630 mikroliter av 25% BSA-lösningen. För att bereda BSA-peptidgelerna, tillsätt 37% formaldehyd till peptiden BSA-utspädningar i ett till ett förhållande som arbetar ett prov i taget. Blanda väl genom att pipettera upp och ner fem gånger inom fem till 10 sekunder utan att skapa luftbubblor.Efter blandning placerar du det slutna mikrocentrifugröret i ett värmeblock vid 85 grader Celsius i 10 minuter. När alla peptid-BSA- och formaldehydlösningar har framställts och värmts upp, låt gelerna svalna på bänkskivan i fem till 10 minuter. Ta sedan bort gelprovet från mikrocentrifugröret i ett stycke med en ren, flexibel laboratoriespatel för engångsbruk.Och placera den i en förseglad behållare som innehåller minst 15 ml neutralt buffrat formalin, med hjälp av en separat behållare för varje prov. Alternativt, med ett nytt rakblad med en kant, skär av botten av mikrocentrifugröret och tryck ut gelén från botten med luft eller en lämplig sond. Använd en ren enkantad rakhyvel trimma gelkonen i cylindriska skivor som är cirka fem millimeter tjocka.Efter att ha förpackat skivorna i en biopsifolie, placera en större gelskiva i en kassett och de återstående gelskivorna tillsammans i en andra kassett för användning i vävnadsmikroarraykonstruktion. Före bearbetning, placera kassettgelerna i minst 15 ml 10% neutralt buffrat formalin per gel, med en separat behållare för varje prov. Bearbeta sedan gelerna i en automatiserad histologivävnadsprocessor enligt ett stort vävnadsschema med tryck och vakuum.När provbearbetningen är klar, ta bort kassetterna från vävnadsprocessorn och flytta dem till paraffinbäddningscentret. Efter att ha packat upp gelerna från biopsifolien, bädda in gelerna i paraffin eller varje prov bädda in en skiva gel i en liten 15 x 15 millimeter form. Och de återstående gelskivorna tillsammans i en andra större form.För varje peptidutspädningsserie, skapa två glasskivor som innehåller totalt sex separata sektioner. Ett avsnitt från vart och ett av de fem provexemplaren i utspädningsserien och ett avsnitt från det negativa kontrollprovet med enbart BSA. Efter sektionering och torkning av objektglasen, fläcka de två objektglasen som är förberedda för varje peptid med önskad primär antikropp.Enligt standard immunohistokemi protokoll förväntar sig att se en relativt enhetlig signal inom varje gelsektion. Med de olika gelproverna som visar ett signalintensitetsintervall som motsvarar peptidutspädningarna. För BSA-gelvävnadsmikroarraykonstruktionen, skär fyra mikrometer tjocka sektioner av vävnadsmikroarrayen och fläcka med en kaninmonoklonal antikropp enligt laboratoriestandardprotokoll.Bedöm den resulterande fläckintensiteten kvalitativt genom inspektion eller köp kvantitativt digital bildskanning och analys. Efter att ha reagerat med lämpliga antikroppar visade negativa BSA-kontrollgelprover minimal signal. Signalintensiteten i ett enskilt gelprov är relativt enhetlig och ökar med ökande antigenkoncentrationer.Mer än 10% av MDA-MB-175-cellerna visar svag och i helt omkrets membranfärgning. Däremot visar mer än 10% av SKBR-3-cellerna intensiv helt omkretsmembranfärgning Arbeta snabbt när formaldehyden har tillsatts eftersom lösningarna börjar gela även vid rumstemperatur. Vi använder denna metod för att göra IHC-kontroller när vi testar nya antikroppar för att ge oss förtroende för att analysen fungerade som förväntat, även när testantikropparna inte visar någon signal.Vävnads- eller cellinjekontroller är i sig varierande. Syntetiska antigenkontroller gör det möjligt för oss att mäta effekten av att ändra specifika ISD-reaktionsförhållanden mer exakt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Visual and Narrative Methods to Achieve Fair Process in Clinical Care

Visual och Narrative metoder för att uppnå rättvis process i klinisk vård

The Institute of Medicine has targeted patient-centeredness as an important area of quality improvement. A major dimension of patient-centeredness is ...

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Modellering stroke hos möss - Middle Cerebral artärocklusion med glödlamporna modell

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen

Förbättring av apoptotiska och Autophagic Induktion av en ny syntetisk C-1-analog av 7-deoxypancratistatin i human bröstadenokarcinoma och neuroblastomceller med Tamoxifen

Breast cancer is one of the most common cancers amongst women in North America. Many current anti-cancer treatments, including ionizing radiation, induce ...

Identification of Disease-related Spatial Covariance Patterns using Neuroimaging Data

Identifiering av Sjukdomsrelaterade Spatial Covariance Mönster där neuroavbildning Data

The scaled subprofile model (SSM)1-4 is a multivariate PCA-based algorithm that identifies major sources of variation in patient and control group brain ...

Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

Stigande Aorta Förträngning i råttor för att skapa övertryck hjärthypertrofi Model

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sekventiell<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Osteogena Stem / progenitorceller Under Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Modeling and Simulations of Olfactory Drug Delivery with Passive and Active Controls of Nasally Inhaled Pharmaceutical Aerosols

Modellering och Simulering av Olfactory Drug Delivery med passiva och aktiva kontroller av nasalt inhalerat Pharmaceutical Aerosoler

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the ...

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Kvantitativ immunohistokemi hos den cellulära mikromiljön vid patientglioblastomresektioner

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Immunofluorescenssmärkning av humana och murina neutrofila extracellulära fällor i paraffin-inbäddade vävnad

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

Implantation av kombinerade telemetriska EKG och blodtryckssändare för att bestämma spontan baroreflexkänslighet hos medvetna möss

Blood pressure (BP) and heart rate (HR) are both controlled by the autonomic nervous system (ANS) and are closely intertwined due to reflex mechanisms. ...