Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

Yazarlar, peptid sentezi için meslektaşları Jeffrey Tom ve Aimin Song'a, TMA yapımı için Nianfeng Ge'ye, IHC boyama için Shari Lau'ya, dijital mikroskobik tarama için Melissa Edick'e ve dijital görüntü ölçümü için Hai Ngu'ya minnetle teşekkür ediyor.

1. Stok çözeltisinin ve takımlarının hazırlanması
<ol><li>5 g BSA tozunu 14 mL PBS içinde, pH 7.2'yi 50 mL'lik bir konik tüpte eşit olarak dağılana kadar karıştırarak 20 mL'lik bir w/v BSA çözeltisi hazırlayın. BSA tozunu dağıtmak için gerektiği gibi vorteks.<ol><li>Tamamen çözünmesini sağlamak için çözeltiyi gece boyunca 4 ° C'de tutun. PBS ile son ses seviyesini 20 mL'ye ayarlayarak %25 w/v stok çözümü elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>6.26 g BSA tozunu 13 mL PBS içinde, pH 7.2'yi 5...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

Bu yöntem, kullanıcının çoğu histoloji laboratuvarına aşina olan malzeme ve teknikleri kullanarak, IHC reaksiyonlarında standart olarak bilinen bileşim ve antijen konsantrasyonunun tek tip numunelerini oluşturmasına olanak tanır. En önemli adım, ilgilenilen antikorun bağlandığı epitopu tanımlamaktır. Bu protokol, ERBB2 / HER2 ICD'den doğrusal bir peptid antijeninin kullanılmasını açıklar. Aynı protokol, oligonükleotidler, floresan etiketler, protein alanları veya tam uzunlukta proteinler iç...

İmmünohistokimya (IHC), formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku kesitlerinde hedef antijenlerin hassas ve spesifik, mekansal olarak hassas tespitini sağlar. Bununla birlikte, IHC boyama sonuçları, sıcak ve soğuk iskemi süresi, doku fiksasyonu, doku ön tedavisi, antikor reaktivitesi ve konsantrasyonu, tahlil tespit kimyası vereaksiyon süreleri 1 dahil olmak üzere birçok değişkenden etkilenebilir. Buna göre, tekrarlanabilir performans ve IHC reaksiyonlarının yorumlanması, bu değişkenlerin sıkı kontrolünü ve iyi karakterize edilmiş pozitif ve negatif kontrol örneklerinin kullanılmasını gerektirir. Sık kullanılan kontroller, ilgilenilen antijeni ifade etmek için bağımsız analizlerden bilinen parafin gömülü dokuları veya kültürlenmiş hücre hatlarını içerir, ancak bu tür örnekler her zaman mevcut değildir1. Ayrıca, hedef antijenlerin dokulardaki ekspresyon düzeyleri ve hücre hattı kontrolleri genellikle sadece kalitatif olarak anlaşılır ve değişken olabilir. Tekrarlanabilir, kesin olarak bilinen hedef antijen konsantrasyonlarını içeren kontroller, IHC reaksiyon koşullarının optimizasyonuna yardımcı olabilir. Sentetik IHC kontrol numuneleri oluşturmak için fizyolojik olarak ilgili bir konsantrasyon aralığında çeşitli antijen tiplerine uyarlanabilen genel bir yöntem, yazarlar tarafından tanımlanmıştır2. Bu tür bir standardın oluşturulması ve kullanılması için burada ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır.
IHC tahlilleri 1,3,4'ün geçerli yorumlanması için uygun kontroller şarttır. Dokular, kültürlenmiş hücreler ve peptit kaplı substratlar, araştırmacıların özel ihtiyaçlarına göre IHC kontrolleri olarak kullanılmıştır. Dokuların İHH kontrolleri olarak kullanılmasının doğasında var olan avantajlar ve sınırlamalar kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır 1,4. Birçok antikor için, geniş bir dinamik aralıkta hedef antijeni eksprese eden hücre popülasyonlarını içeren seçilmiş normal dokulardan uygun kontroller seçilebilir. Doku kontrolleri, hedef antijen ekspresyon bölgesi veya bolluğu ile ilgili olarak iyi karakterize edilmediğinde veya potansiyel olarak çapraz reaksiyona giren antijenler aynı hücrelerde veya doku bölgelerinde birlikte eksprese edildiğinde daha az uygundur. Bu bağlamlarda, ilgilenilen antijeni ifade eden kültürlenmiş hücre hatları blokları yardımcı olabilir. Hedef özgüllüğüne dair daha fazla kanıt sağlamak için, hücre hatları hedef antijenleri aşırı veya az eksprese edecek şekilde tasarlanabilir. Örneğin, böyle bir yaklaşım yakın zamanda, bir dizi PD-L1 antijeni5'i eksprese eden izojenik hücre hatlarından oluşan bir doku mikrodizisi kullanarak çeşitli anti-PD-L1 tahlillerini değerlendirmek için kullanılmıştır. Hücre hattı bloklarının rutin kullanımındaki pratik sınırlamalar, yeterli hücre sayıları üretmek için gereken maliyet ve zamanı ve bazı antijenlerin ekspresyonunun, klonal hücre hatları6 içinde bile güvenilir bir şekilde tutarlı olmayabileceği gerçeğini içerir. Sentetik peptitler, kısa lineer epitopları tanıyan antikorlar için IHC kontrolleri için üçüncü bir seçenektir. Steven Bogen ve meslektaşları, cam slaytların 7,8 ve cam boncukların 9 yüzeyine bağlanmış peptitlerin kullanımı hakkında kapsamlı bir şekilde yayınyaptılar. Bu grup tarafından yapılan bir çalışma, peptid bazlı IHC kontrollerinin kantitatif analizinin, paralel10'da analiz edilen doku kontrollerinin kalitatif değerlendirmesi ile kaçırılan boyama süreci varyasyonunu tespit edebileceğini göstermiştir. Boncuk bazlı antijenleri kullanan standartlar yaygın olarak uygulanabilirken, birçok ayrıntı yazarlara aittir ve yaygın olarak benimsenmesini sınırlar.
IHC standartlarına bir başka yaklaşım, hedef antijenleri yapay olarak oluşturulan protein jellerine dahil eder. Bu kavram ilk olarak 1972 yılında Per Brandtzaeg tarafından normal tavşan serumunun glutaraldehit11 kullanılarak polimerize edildiği bir çalışmada gösterilmiştir. Elde edilen jelin küçük blokları daha sonra çeşitli konsantrasyonlarda ilgilenilen immünoglobulin antijenlerini içeren çözeltilerde 1-4 hafta bekletildi. Alkol fiksasyonu ve parafin gömülmesinden sonra, ortaya çıkan kontrollerin bölümlerinin, ıslatıldıkları antijen çözeltilerinin logaritmasına karşılık gelen yoğunluklarda lekelendiği gösterilmiştir. Daha sonra, araştırmacılar immün-elektron mikroskobu çalışmalarında pozitif kontroller olarak seyreltik BSA veya beyin homojenat çözeltilerinde spesifik amino asitlerin glutaraldehit konjugatlarını hazırladılar12,13. Daha yeni çalışmalar, formaldehit sabit protein çözeltilerinden yapılan jellerin, kütle spektrometrisi analizinde FFPE dokusu için vekil olarak kullanımını araştırdı14. Son zamanlarda yapılan bir başka çalışmada, insan veya sığır serum albümin çözeltilerinin çeşitli konsantrasyonlarda ve pH15'te ısıtılmasıyla oluşan jellerin yapısı ve özellikleri araştırılmıştır. Bu yazarlar, serum albüminin, deneysel koşullara bağlı olarak mekanik elastikiyet, ikincil yapı koruması ve yağ asidi bağlama kabiliyeti bakımından farklılık gösteren üç tip jel oluşturduğunu bulmuşlardır. Birlikte, bu makaleler burada kullanılan yaklaşımın genel fizibilitesini göstermektedir. Tanımlanmış bileşimin protein çözeltileri, rutin histolojik yöntemler kullanılarak daha fazla işlenebilen, kesitlenebilen ve boyanabilen doku benzeri jeller oluşturur.
Bu protokol, ısı ve formaldehit ile polimerize edilmiş sığır serum albümininden (BSA) yapılan sentetik bir IHC kontrolünün oluşumunu tanımlar. Jeller, tam uzunlukta proteinler, protein alanları ve doğrusal peptitlerin yanı sıra oligonükleotidler2 dahil olmak üzere protein olmayan antijenler de dahil olmak üzere çok çeşitli antijenleri içerebilir. Bu gösterim, insan ERBB2 (HER2 / neu) proteini TPTAENPEYLGLDVPV-COOH'un C-terminal 16 amino asitlerini kodlayan bir doğrusal peptit örneği antijen kullanmaktadır (bkz. Bu sekans, Herceptest poliklonal reaktifi (ENPEYLGLDVP) ve monoklonal antikorlar CB11 (AENPEYL) ve 4B5 (TAENPEYLGL) dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen, tanısal olarak ilgili üç antikor tarafından tanınan epitopları içerir (bakınız Malzeme Tablosu)16.
Burada gösterilen yöntem, herhangi bir pratik histoloji laboratuvarına aşina olan süreçleri ve teknikleri kullanarak hazır bulunan reaktifleri kullanır. En önemli sınırlama, birçok durumda nispeten mütevazı bir maliyetle gerçekleştirilebilecek hedef antijenleri tanımlama ve satın alma ihtiyacıdır. Bu sentetik kontroller tamamen tanımlanmış bileşime sahip olduğundan ve basit yöntemlerle yapıldığından, birçok laboratuvarda tekrarlanabilir sonuçlarla uygulanabilirler. Bunların kullanımı, IHC boyama sonuçlarının objektif, ölçülebilir değerlendirmesini kolaylaştırabilir ve laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası daha fazla tekrarlanabilirlik sağlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

İmmünohistokimya (IHC) testleri, güvenilir yorumu iyi karakterize edilmiş pozitif ve negatif kontrol örnekleri gerektiren protein ekspresyon paternleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Uygun doku veya hücre hattı kontrolleri her zaman mevcut olmadığından, sentetik IHC kontrolleri oluşturmak için basit bir yöntem faydalı olabilir. Böyle bir yöntem burada açıklanmıştır. Çok çeşitli konsantrasyonlarda proteinler, peptitler veya oligonükleotidler dahil olmak üzere çeşitli antijen tiplerine uyarlanabilir. Bu protokol, sentetik antijen kontrolleri oluşturmak için gerekli adımları açıklamakta, örnek olarak çeşitli tanısal olarak ilgili antikorlar tarafından tanınan insan eritroblastik onkogen B2 (ERBB2 / HER2) hücre içi alanından (ICD) bir peptid kullanmaktadır. Sığır serum albümini (BSA) çözeltisindeki HER2 ICD peptidinin seri seyreltimleri formaldehit ile karıştırılır ve peptid / BSA karışımını katılaştırmak ve çapraz bağlamak için 85 ° C'de 10 dakika ısıtılır. Elde edilen jel, bir doku gibi işlenebilir, kesitlenebilir ve boyanabilir, böylece çok çeşitli boyama yoğunluklarını kapsayan bilinen antijen konsantrasyonlarında bir dizi örnek elde edilebilir.
Bu basit protokol rutin histoloji laboratuarı prosedürleri ile tutarlıdır. Yöntem sadece kullanıcının istenen antijenden yeterli miktarda olmasını gerektirir. İlgili epitopları kodlayan rekombinant proteinler, protein alanları veya doğrusal peptitler lokal veya ticari olarak sentezlenebilir. Kurum içi antikorlar üreten laboratuvarlar, bağışıklayıcı antijenin alikotlarını sentetik kontrol hedefi olarak rezerve edebilir. Çok çeşitli konsantrasyonlarda iyi tanımlanmış pozitif kontroller oluşturma fırsatı, kullanıcıların laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tahlil performansını değerlendirmelerine, tahlillerinin dinamik aralığı ve doğrusallığı hakkında fikir edinmelerine ve tahlil koşullarını belirli deneysel hedefleri için optimize etmelerine olanak tanır.

Peptitler, optik olarak berrak bir çözelti oluşturmak için oda sıcaklığında uygun bir çözücü içinde tamamen çözülmelidir. Görünür partikül malzeme 30-60 dakika sonra hala mevcutsa, orijinal çözücünün ek hacimlerinin veya Tablo 1'de hesaplanan 5x peptid stok çözeltisinin amaçlanan hacmini aşmayan alternatif bir çözücünün eklenmesi yararlı olabilir. Benzer şekilde, kombine peptid / BSA çözeltisi yarı saydam kalmalıdır (Şekil 1A).
<...

Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry at JoVE.com

Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

Bu çalışma, immünohistokimya için sentetik antijen kontrolleri oluşturmak için basit bir yöntemi belgelemektedir. Teknik, çok çeşitli konsantrasyonlarda çeşitli antijenlere uyarlanabilir. Numuneler, tahlil içi ve tahliller arası performansı ve tekrarlanabilirliği değerlendirmek için bir referans sağlar.

İmmünohistokimya için Sentetik Antijen Kontrolleri

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

BSA antijen jelleri, mevcut kontrolleri tamamlayabilen, iyi karakterize edilmiş tekrarlanabilir IHC standartlarıdır. Bu protokol, bilinen bileşimin tekrarlanabilir standartlarını yapmak için standart histoloji ve IHC reaktiflerini ve yöntemlerini kullanır. Bu kontroller, farklı laboratuvarların tanısal olarak ilgili birçok tahlil için IHC tahlillerini kalibre etme ve standartlaştırma fırsatı sağlar.Peptit veya proteini çözmek için uygun bir çözücü bulmak önemlidir. Antijen ve formaldehit çözeltilerini kabarcıklar sokmadan hızlı bir şekilde karıştırmak zor olabilir. Başlamak için, 14 mililitre PBS içinde, eşit olarak dağılana kadar 50 mililitrelik bir konik tüp içinde beş gram BSA tozunu karıştırarak, hacimce% 25 ağırlığında 20 mililitre BSA çözeltisi hazırlayın.BSA tozunu çözmek için çözeltiyi vorteksleyin. Tamamen çözünme için çözeltiyi gece boyunca dört santigrat derecede tutun. Ertesi gün, PBS ile son ses seviyesini 20 mililitreye ayarlayın.Benzer şekilde, 13 mililitre PBS içinde 6.26 gram BSA tozunu karıştırarak hacimce% 31.3 ağırlığında 20 mililitre BSA çözeltisi hazırlayın. Tam çözünme için gece boyunca inkübasyondan sonra, PBS ile son hacmi 20 mililitreye ayarlayın. BSA formaldehit karışımının bir jel oluşturduğunu test etmek için, bir ısı bloğunu 85 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.Daha sonra% 25 BSA çözeltisinin 700 mikrolitresini% 700 mikrolitre% 37 formaldehit ile karıştırın. Hava kabarcıkları oluşturmadan beş ila 10 saniye içinde beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın. Karıştırmadan hemen sonra, kapalı mikro santrifüj tüpünü 85 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış ısı bloğuna yerleştirin.10 dakika sonra, tüpü ısı bloğundan çıkarın. Soğumasına izin verin ve jelin beklendiği gibi oluştuğunu onaylayın. Sekiz adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü hazırlayın ve açıkça etiketleyin.Daha sonra 5x peptid stok çözeltisi hazırlayın, serbestleştirilmiş peptidin tüm kütlesini uygun çözücünün 60 mikrolitresinde yeniden askıya alarak 12.5 milimolar konsantrasyon ekleyin. Peptitin tamamen çözündüğünden emin olmak için çözeltiyi gözlemleyin. Daha sonra, peptitlerin moleküler ağırlığına, kütlesine ve saflığına göre 12.5 milimolar bir çözelti yapmak için gerektiğinde ek bir çözücü hacmi ekleyin.Bu örnekte, 5x peptid stoğu 626.9 mikrolitrelik bir son hacme sahiptir. Diğer peptit örnekleri farklı bir son hacim gerektirecektir. Daha sonra, 150 mikrolitre 1x peptid stok çözeltisi hazırlayın, 5x peptid stoğunun 30 mikrolitresini çözücünün 120 mikrolitresine seyrelterek 2.5 milimolar konsantrasyon ekleyin.Çözeltiyi beş saniye boyunca vorteksleyin ve oda sıcaklığında santrifüj yapın. Daha sonra, 1x peptid stoğunun 140 mikrolitresini% 31.3 BSA çözeltisinin 560 mikrolitresine seyrelterek 700 mikrolitre 0.5 milimolar peptid BSA çözeltisi hazırlayın. Vorteksten sonra, çözeltiyi oda sıcaklığında santrifüj edin.Benzer şekilde,% 25 BSA çözeltisinin 630 mikrolitresine 70 mikrolitre peptit BSA çözeltisi ekleyerek peptid BSA stoğunun dört ardışık 10x seri seyreltilmesini hazırlayın. BSA peptid jellerini hazırlamak için, peptid BSA seyreltmelerine% 37 formaldehit, bir seferde bir numune çalışan bire bir oranda% 37 formaldehit ekleyin. Hava kabarcıkları oluşturmadan beş ila 10 saniye içinde beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın.Karıştırdıktan sonra, kapalı mikro santrifüj tüpünü 10 dakika boyunca 85 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirin. Tüm peptid BSA ve formaldehit çözeltileri hazırlandıktan ve ısıtıldıktan sonra, jellerin tezgah üstünde beş ila 10 dakika soğumasını bekleyin. Daha sonra, temiz, esnek tek kullanımlık bir laboratuvar spatula kullanarak, jel numunesini mikro santrifüj tüpünden tek parça halinde çıkarın.Ve her numune için ayrı bir kap kullanarak, en az 15 mililitre nötr tamponlu formalin içeren kapalı bir kaba yerleştirin. Alternatif olarak, yeni bir tek kenarlı tıraş bıçağı kullanarak, mikro santrifüj tüpünün tabanını kesin ve jeli alttan hava veya uygun bir prob ile dışarı itin. Temiz tek kenarlı tıraş bıçağı kullanarak jel koniyi yaklaşık beş milimetre kalınlığında silindirik disklere kesin.Diskleri bir biyopsi sargısına sardıktan sonra, daha büyük bir jel diski bir kasete ve kalan jel diskleri doku mikroarray yapımında kullanılmak üzere ikinci bir kasete yerleştirin. İşlemden önce, kaset jellerini, her numune için ayrı bir kap kullanarak, jel başına en az 15 mililitre% 10 nötr tamponlanmış formalin içine yerleştirin. Daha sonra, jelleri basınç ve vakum ile büyük bir doku programını izleyerek otomatik bir histoloji doku işlemcisinde işleyin.Numune işleme tamamlandığında, kasetleri doku işlemcisinden çıkarın ve parafin gömme merkezine taşıyın. Jelleri biyopsi sargısından açtıktan sonra, jelleri parafin içine gömün veya her numune bir jel diskini 15 x 15 milimetrelik küçük bir kalıba gömün. Ve kalan jel diskler ikinci bir büyük kalıpta bir araya gelir.Her peptid seyreltme serisi için, toplam altı ayrı bölüm içeren iki cam slayt oluşturun. Beş seyreltme serisi numunenin her birinden bir bölüm ve BSA sadece negatif kontrol numunesinden bir bölüm. Slaytları kesitleyip kuruttuktan sonra, her peptid için hazırlanan iki slaytı istenen primer antikor ile boyayın.Standart İmmünohistokimya protokollerine göre, her jel bölümünde nispeten düzgün bir sinyal görmeyi bekler. Peptit seyreltmelerine karşılık gelen bir dizi sinyal yoğunluğu gösteren farklı jel örnekleri ile. BSA jel doku mikroarray yapısı için, doku mikrodizisinin dört mikrometre kalınlığındaki bölümlerini kesin ve laboratuvar standart protokollerine göre bir tavşan monoklonal antikoru ile boyanır.Ortaya çıkan leke yoğunluğunu inceleme yoluyla niteliksel olarak değerlendirin veya kantitatif olarak dijital görüntü tarama ve analizi satın alın. Uygun antikorlarla reaksiyona girdikten sonra, negatif kontrol BSA sadece jel örnekleri minimal sinyal gösterdi. Tek bir jel numunesindeki sinyal yoğunluğu nispeten homojendir ve artan antijen konsantrasyonları ile artar.MDA-MB-175 hücrelerinin% 10'undan fazlası soluk ve tamamen çevresel membranöz boyanma gösterir. Buna karşılık, SKBR-3 hücrelerinin% 10'undan fazlası, yoğun tamamen çevresel membranöz boyama gösterir Formaldehit eklendikten sonra hızlı bir şekilde çalışın, çünkü çözeltiler oda sıcaklığında bile jelleşmeye başlayacaktır. Bu yöntemi, test antikorları sinyal göstermediğinde bile, tahlilin beklendiği gibi yapıldığına dair bize güven vermek için yeni antikorları test ederken IHC kontrolleri yapmak için kullanıyoruz.Doku veya hücre hattı kontrolleri doğal olarak değişkendir. Sentetik antijen kontrolleri, değişen spesifik ISD reaksiyon koşullarının etkisini daha hassas bir şekilde ölçmemizi sağlar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Using Visual and Narrative Methods to Achieve Fair Process in Clinical Care

Klinik Bakımı Fuar Süreci elde Görsel ve Anlatı Yöntemlerle

The Institute of Medicine has targeted patient-centeredness as an important area of quality improvement. A major dimension of patient-centeredness is ...

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Fare Modelleme İnme - Filament Model Orta Serebral Arter Tıkanıklığı

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen

İnsan Meme Adenokarsinom ve Tamoksifen Nöroblastom Hücreleri 7-deoxypancratistatin bir Roman Sentetik C-1 Analog tarafından Apoptotik ve Otofajik İndüksiyon Geliştirilmesi

Breast cancer is one of the most common cancers amongst women in North America. Many current anti-cancer treatments, including ionizing radiation, induce ...

Identification of Disease-related Spatial Covariance Patterns using Neuroimaging Data

Nörogörüntüleme Veri kullanarak Hastalık ile ilgili Mekansal Kovaryans Desenler belirlenmesi

The scaled subprofile model (SSM)1-4 is a multivariate PCA-based algorithm that identifies major sources of variation in patient and control group brain ...

Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

Basınç Aşırı Kardiyak hipertrofi Modeli Oluşturma Ratlarda Aort daralma, Artan

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Modeling and Simulations of Olfactory Drug Delivery with Passive and Active Controls of Nasally Inhaled Pharmaceutical Aerosols

Genizden İnhale İlaç Aerosollerin Pasif ve Aktif Kontroller ile Modelleme ve Koku Drug Delivery Simülasyonlar

There are many advantages of direct nose-to-brain drug delivery in the treatment of neurological disorders. However, its application is limited by the ...

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

Bilinçli Farelerde Spontan Barorefleks Duyarlılığını Belirlemek için Kombine Telemetrik EKG ve Kan Basıncı Transmitterlerinin İmplantasyonu

Blood pressure (BP) and heart rate (HR) are both controlled by the autonomic nervous system (ANS) and are closely intertwined due to reflex mechanisms. ...