Name: automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes
Uploaded: 2021-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح NIH / NCI (R01CA207189 ، R21CA243701) إلى C.C. KMO.G. حاصل على جائزة زمالة ما بعد الدكتوراه TRDRP (T30FT0952). BioTek Cytation 5 هو جزء من Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core ، الذي يتلقى دعما ماليا من منحة دعم مركز NCI للسرطان (P30 CA030199). تم إنشاء الأشكال 1-3 باستخدام BioRender.

1. إعداد المواد
<ol><li>قم بإذابة 70 كيلو دالتون ديكستران الموسوم ب FITC أو رباعي ميثيل الرودامين (TMR) في PBS للحصول على محلول 20 ملغم / مل. تخزين aliquots في -20 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بإذابة DAPI في ddH2O للحصول على محلول 1 ملغم / مل. تخزين aliquots في -20 درجة مئوية. تحذير: DAPI هو مادة مسرطنة محتملة ويجب التعامل مع?...

<ol>
	<li>Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+different+cell+types:+similarities+and+differences.">Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences.</a> Membranes. 10 (8), 21 (2020).</li><li>Recouvreux, M. V., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+a+metabolic+adaptation+to+nutrient+stress+in+cancer.">Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Zhang, Y. J., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer:+a+complex+signaling+network.">Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network.</a> Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+deficiency+and+AMPK+activation+promote+nutrient+scavenging+and+anabolism+in+prostate+cancer+cells.">PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells.</a> Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Kamphorst, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+cancer+tumors+are+nutrient+poor+and+tumor+cells+actively+scavenge+extracellular+protein.">Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein.</a> Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).</li><li>Olivares, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-derived+proline+promotes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cell+survival+under+nutrient+limited+conditions.">Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Seguin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3,+a+druggable+vulnerability+for+KRAS-addicted+cancers.">Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).</li><li>Redelman-Sidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Wnt+pathway+drives+macropinocytosis+in+cancer.">The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer.</a> Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).</li><li>Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+canonical+pathway+activates+macropinocytosis+and+lysosomal+degradation+of+extracellular+proteins.">Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).</li><li>Schmees, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+the+PDGF+beta-receptor+promotes+fibroblast+transformation+by+H-RasG12V.">Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).</li><li>Recouvreux, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+regulates+Slug+to+promote+EMT+and+metastasis+in+pancreatic+cancer.">Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+escape+autophagy+inhibition+via+NRF2-induced+macropinocytosis.">Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis.</a> Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Mishra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+epigenetic+alterations+drive+metabolic+and+neuroendocrine+prostate+cancer+reprogramming.">Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinosome+quantitation+assay.">Macropinosome quantitation assay.</a> MethodsX. 1, 36-41 (2014).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li></ol>

تعتمد جودة التجارب والحصول على البيانات بشكل كبير على جودة الكواشف ، وتحسين الإعدادات ، ونظافة الأغطية والألواح الدقيقة. وينبغي أن تعطي النتائج النهائية الحد الأدنى من التباين بين النسخ المتماثلة؛ ومع ذلك ، فإن الاختلافات البيولوجية تحدث بشكل طبيعي أو قد تكون ناجمة عن عدد من العوامل. قد ?...

يسمح المسار الداخلي غير المحدد لندرة الخلايا الكبيرة للخلايا باستيعاب مجموعة متنوعة من المكونات خارج الخلية، بما في ذلك العناصر الغذائية والبروتينات والمستضدات ومسببات الأمراض، من خلال الامتصاص الأكبر للسوائل خارج الخلية ومكوناتها1. على الرغم من أهميته لبيولوجيا العديد من أنواع الخلايا، إلا أنه يوصف بشكل متزايد مسار زيادة عدد الخلايا الكبيرة بأنه يلعب دورا أساسيا في بيولوجيا الورم، حيث، من خلال امتصاص الخلايا السرطانية الكبيرة، تكون قادرة على البقاء والتكاثر في وجود بيئة دقيقة مستنفدة للمغذيات2،3. يوفر امتصاص الجزيئات الكبيرة خارج الخلية ، بما في ذلك الألبومين والمصفوفة خارج الخلية ، وحطام الخلايا الميتة ، مصدرا غذائيا بديلا لإنتاج الكتلة الحيوية عن طريق إنشاء الأحماض الأمينية والسكريات والدهون والنيوكليوتيدات من خلال هدم البضائع بوساطة اندماج الماكروبينوسوم والليزوسوم 4،5،6،7،8.
تحريض وتنظيم كثرة الخلايا الكبيرة معقدة ويمكن أن تختلف اعتمادا على السياق الخلوي. حتى الآن ، تم تحديد العديد من محفزات زيادة عدد الخلايا الكبيرة وتشمل الأربطة ، مثل عامل نمو البشرة (EGF) ، وعامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) ، و galectin-3 ، و Wnt3A9,10,11,12,13. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي ظروف الزراعة التي تحاكي البيئة الدقيقة للورم إلى تنشيط المسار. الأورام الغدية في القنوات البنكرياسية (PDAC) محرومة من المغذيات ، خاصة بالنسبة للغلوتامين الحمضي الأميني ، الذي يتسبب في اعتماد كل من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) على زيادة ندرة الخلايا الكبيرة للبقاء على قيد الحياة7،13،14،15. علاوة على ذلك، يمكن لضغوط الورم، مثل نقص الأكسجة والإجهاد التأكسدي، تنشيط مسار الكسح هذا16. بالإضافة إلى العديد من المؤثرين الخارجيين الذين يمكنهم تحفيز زيادة عدد الخلايا الكبيرة ، تتحكم مجموعة متنوعة من المسارات داخل الخلايا في تكوين macropinosome. التحول بوساطة راس الورمي يكفي لبدء آلية الخلايا الكبيرة ، وتظهر أنواع متعددة من السرطان زيادة الخلايا الكبيرة التأسيسية التي يحركها راس الورمي 4،5،9،17. بدلا من ذلك ، تم تحديد تنشيط Ras من النوع البري والمسارات المستقلة عن Ras لتنشيط macropinocytosis في الخلايا السرطانية و CAFs10،11،15،18. أدى استخدام نماذج مختلفة في المختبر بالاشتراك مع العلاجات المثبطة إلى تحديد العديد من معدلات ندرة الخلايا الكبيرة ، والتي تشمل مبادلات الصوديوم والهيدروجين ، و GTPase Rac1 الصغير ، و phosphoinositide 3-kinase (PI3K) ، و kinase المنشط p21 (Pak) ، و AMP-activated protein kinase (AMPK) 4,13,15 . ومع ذلك ، بالنظر إلى العديد من العوامل والظروف الموصوفة التي تنظم ندرة الخلايا الكبيرة ، فمن المتصور أن العديد من المعدلات والمحفزات الأخرى لا تزال غير مكتشفة. يمكن تسهيل تحديد المعدلات والمحفزات الجديدة من خلال التقييم الآلي للعديد من الحالات في تجربة واحدة. يمكن لهذه المنهجية أن تلقي الضوء على العوامل التي ينطوي عليها تكوين الماكروبينوسوم وقد تسمح باكتشاف جزيئات صغيرة جديدة أو بيولوجية تستهدف هذا المسار.
هنا ، قمنا بتكييف بروتوكولنا الذي تم إنشاؤه مسبقا لتحديد مدى ندرة الخلايا السرطانية في الخلايا السرطانية في المختبر إلى تنسيق microplate 96-well والتصوير الآلي وتحديد الكم19,20. يعتمد هذا البروتوكول على الفحص المجهري الفلوري ، والذي أصبح معيارا في هذا المجال لتحديد ندرة الخلايا الكبيرة في المختبر وفي الجسم الحي 4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. يمكن تمييز Macropinosomes عن مسارات الخلايا الداخلية الأخرى من خلال قدرتها على استيعاب الجزيئات الكبيرة الكبيرة ، مثل dextran عالي الوزن الجزيئي (أي 70 kDa) 2,3,4,20,21,22,23. وبالتالي ، يمكن تعريف macropinosomes من خلال امتصاص الفلوروفور خارج الخلية المسمى 70 kDa dextran. ونتيجة لذلك ، تظهر الحويصلات ذات الخلايا الكبيرة على شكل مجموعات داخل الخلايا من البقع الفلورية بأحجام تتراوح بين 0.2-5 ميكرومتر. يمكن تصوير هذه الثقوب مجهريا وتحديدها كميا لاحقا لتحديد مدى ندرة الخلايا الكبيرة في الخلية - "مؤشر الخلايا الكبيرة".
في هذا البروتوكول ، يتم وصف الخطوات الأساسية لتصور الماكروبينوسومات في الخلايا الملتصقة في المختبر على صفيحة دقيقة من 96 بئرا وأغطية باستخدام معدات المختبرات القياسية (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير التوجيهات لأتمتة الحصول على الصور وتحديد كميتها لمؤشر macropinocytic باستخدام قارئ لوحة متعدد الأوضاع لتصوير الخلايا. تقلل هذه الأتمتة من الوقت والتكلفة والجهد مقارنة ببروتوكولاتنا الموصوفة سابقا19,20. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتجنب الحصول على التصوير وتحليله بشكل غير مقصود ، وبالتالي يعزز قابلية التكرار والموثوقية. يمكن بسهولة تكييف هذه الطريقة مع أنواع الخلايا المختلفة أو قارئات الألواح أو استخدامها لتحديد ميزات macropinosome البديلة ، مثل الحجم والعدد والموقع. الطريقة الموصوفة هنا مناسبة بشكل خاص لفحص ظروف زراعة الخلايا التي تحفز ندرة الخلايا الكبيرة ، أو تحديد المعدلات الجديدة ، أو تحسين تركيزات الأدوية للمثبطات المعروفة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62828/62828fig01.jpg"> الشكل 1: مخطط للفحص الآلي لتحديد "مؤشر الخلايا الكبيرة" في الخلايا الملتصقة. تم إنشاؤه باستخدام BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62828/62828fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25053CI</td>
			<td>0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent reservoir</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>28-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>155503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter for standard tips</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>159024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories Inc</td>
			<td>4355226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia-free glass cleaner</td>
			<td>Sparkle</td>
			<td>FUN20500CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well high-content screening microplate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055300</td>
			<td>CellCarrier-96 Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>CYT5FW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.08741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - FITC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1822</td>
			<td>Lysine-fixable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - TMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21031CV</td>
			<td>Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 37%</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>RSOF0010-250A</td>
			<td>ACS Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardening fluorescence mounting media</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td>DAKO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Certified ACS Plus, 36.5%&#8211;38.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td>Premium plain glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10013</td>
			<td>8 channels, 0.5&#8211;10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10012&#160;</td>
			<td>12 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td>8 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Pechiney</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Kirkland Signature</td>
			<td>208733</td>
			<td>Stretch-Tite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone isolators</td>
			<td>Grace Bio Labs Inc</td>
			<td>664107</td>
			<td>13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide adapter</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>1220548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0340922C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes

Macropinocytosis هو مسار امتصاص غير محدد في مرحلة السوائل يسمح للخلايا باستيعاب شحنات كبيرة خارج الخلية ، مثل البروتينات ومسببات الأمراض وحطام الخلايا ، من خلال داء الخلايا الداخلية بالجملة. يلعب هذا المسار دورا أساسيا في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، بما في ذلك تنظيم الاستجابات المناعية واستقلاب الخلايا السرطانية. وبالنظر إلى هذه الأهمية في الوظيفة البيولوجية، فإن فحص ظروف زراعة الخلايا يمكن أن يوفر معلومات قيمة من خلال تحديد المنظمين لهذا المسار وتحسين الظروف لاستخدامها في اكتشاف أساليب علاجية جديدة. تصف الدراسة تقنية تصوير وتحليل آلي باستخدام معدات مختبرية قياسية وقارئ لوحات متعدد الأوضاع لتصوير الخلايا من أجل القياس الكمي السريع لمؤشر الخلايا الكبيرة في الخلايا الملتصقة. تعتمد الطريقة الآلية على امتصاص ديكستران الفلورسنت عالي الوزن الجزيئي ويمكن تطبيقها على 96 لوحة دقيقة لتسهيل تقييمات الظروف المتعددة في تجربة واحدة أو عينات ثابتة مثبتة على أغطية زجاجية. ويهدف هذا النهج إلى زيادة قابلية التكرار إلى أقصى حد والحد من التباين التجريبي مع توفير الوقت والفعالية من حيث التكلفة.

عندما يتم اتباع خطوات وتعديل البروتوكول الموصوف أعلاه وفقا لذلك ، يجب أن توفر النتائج التجريبية النهائية معلومات حول ما إذا كانت ظروف زراعة الخلايا المدروسة أو مثبطات تحفز أو تقلل من ندرة الخلايا الكبيرة في خط اهتمام الخلية. ولتعزيز صحة هذه النتائج، سيسمح إدراج شروط التحكم بالتدقيق في ال...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes at JoVE.com

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

تعد المقايسات الآلية باستخدام الصفائح الدقيقة متعددة الآبار طرقا مفيدة لتحديد منظمي المسارات من خلال السماح بتقييم العديد من الظروف في تجربة واحدة. هنا ، قمنا بتكييف بروتوكول التصوير والقياس الكمي الراسخ في macropinosome إلى تنسيق microplate 96-well وتوفير مخطط شامل للأتمتة باستخدام قارئ لوحات متعدد الأوضاع.

التصوير والتحليل الآليان لتحديد كمية الماكروبينوسومات الموسومة بالفلورسنت

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Macropinocytosis هو مسار الخلايا الداخلية التي هي مهمة لمجموعة متنوعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك التمثيل الغذائي للسرطان. يسمح لك هذا البروتوكول بتحديد مدى ندرة الخلايا الكبيرة في الخلايا في المختبر. تهدف الأتمتة إلى زيادة قابلية التكرار والإنتاجية والحد من التباين التجريبي.علاوة على ذلك ، يسمح لك الفحص المجهري الفلوري بفحص العينة بصريا لتحديد الجودة التجريبية وتقييم خصائص macropinosome الإضافية. ستوضح الإجراء معي تشيسكا ماري غالابات ، وهي مساعدة باحث من مختبري. بالنسبة للوحة المكونة من 24 بئرا بتنسيق coverslip ، استخدم الملقط للإمساك بغطاء واحد من حمام الإيثانول.اضغط على الغطاء إلى الجدار الداخلي للصفيحة لإزالة الإيثانول الزائد ووضع الغطاء مسطحا في قاع البئر. بعد أن يتبخر الإيثانول ، اغسل الغطاء مرتين باستخدام DPBS ، ثم قم بزرع الخلايا الموجودة أعلى الغطاء عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر. ضع الخلايا في حاضنة خلايا 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون حتى يصل التقاء الخلايا إلى 60 إلى 80٪ في اليوم السابق لوضع العلامات على macropinosome.في اليوم السابق لوضع العلامات على الماكروبينوسوم ، استبدل الوسائط الموجودة في الآبار ب 500 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل المسلية التي تم تسخينها مسبقا وضع الخلايا في الحاضنة لمدة 16 إلى 24 ساعة. بالنسبة لتنسيق الصفائح الدقيقة المكونة من 96 بئرا ، ابدأ بنقل تعليق الخلية إلى خزان كاشف سعة 25 ملليلتر. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بزرع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة فحص سوداء عالية المحتوى 96 بئرا مع أوليفين دوري واضح بصريا أو قاع زجاجي.احتضن الخلايا حتى يصل التقاء الخلايا إلى 60 إلى 80٪ في اليوم السابق لوضع العلامات على الماكروبينوسوم. في اليوم السابق لوضع العلامات على الماكروبينوسوم، قم بإزالة الوسائط والتخلص منها من كل بئر باستخدام محول شفط متعدد القنوات للحصول على نصائح قياسية متصلة بمضخة تفريغ. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ماصة متعددة القنوات.باستخدام خزان كاشف وماصة متعددة القنوات ، أضف بلطف 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل المسلية المسخنة مسبقا إلى كل بئر ، ثم ضع الخلايا في حاضنة الخلايا لمدة 16 إلى 24 ساعة. بالنسبة للوحة المكونة من 24 بئرا ذات شكل غطاء ، استبدل الوسائط الموجودة في الآبار ب 200 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل مع ديكستران عالي الوزن الجزيئي المسمى بالفلوروفور ووضع الخلايا في حاضنة الخلايا لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بشفط الوسائط واغسل الخلايا بلطف ولكن بسرعة خمس مرات باستخدام PBS البارد باستخدام زجاجة غسيل مبردة مسبقا.هز الطبق باليد بقوة أثناء الغسيل للمساعدة في إزاحة مجاميع الدكستران التي تصبح عالقة في الأغطية. بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 350 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 3.7٪ واحتضانها لمدة 20 دقيقة ، ثم استنشق محلول التثبيت واغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين. وصمة عار النوى مع 350 ميكرولتر من DAPI في PBS.بعد 20 دقيقة ، قم بشفط محلول DAPI واغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات. قم بلصق عوازل السيليكون جنبا إلى جنب على شريحة المجهر للحصول على تباعد متساو وتوطين قابل للتكرار للأغطية المطلوبة لأتمتة التصوير. ثم لكل غطاء ، أضف قطرة من وسائط تركيب التألق المتصلب على شريحة المجهر داخل المساحة المفتوحة للعازل.التقط غطاء باستخدام ملقط وقم بإزالة PBS الزائد عن طريق النقر برفق على جانب الغطاء على منديل خال من الوبر. بعد ذلك ، ضع الغطاء رأسا على عقب على قطرة وسائط التركيب وانقر برفق على الغطاء باستخدام ملقط مغلق لإزالة الفقاعات من وسائط التركيب. قم بتخزين الشرائح في بيئة مظلمة واسمح لوسائط التركيب بالجفاف في درجة حرارة الغرفة، وعادة ما يستغرق الأمر من 16 إلى 24 ساعة.قبل التصوير ، قم بإزالة العوازل من شريحة المجهر. بعد أن يتم موازنة الشرائح مع درجة حرارة الغرفة، قم بتنظيف الأغطية باستخدام قضيب ذو رأس قطني مبلل بمنظف زجاجي خال من الأمونيا. بعد ذلك ، استخدم قضيب قطني نظيف مبلل بالإيثانول بنسبة 70٪ لتنظيف الغطاء وتركه جافا.بالنسبة لشكل الصفائح الدقيقة المكونة من 96 بئرا ، بعد شفط الآبار كما هو موضح سابقا ، أضف 40 ميكرولترا من الوسائط الخالية من المصل مع دكستران عالي الوزن الجزيئي المسمى بالفلوروفور إلى الآبار ، ثم احتضن الخلايا في حاضنة الخلايا لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، تخلص من الوسائط الموجودة في الصفيحة الدقيقة عن طريق تحريك اللوحة يدويا رأسا على عقب في كوب فارغ سعة خمسة لترات ، ثم شطف الخلايا والصفيحة الدقيقة مرتين عن طريق غمر اللوحة ببطء عموديا بزاوية طفيفة في كوب سعة لترين مملوء ب PBS بارد بالثلج ثم التخلص من PBS في الصفيحة الدقيقة عن طريق تحريك اللوحة رأسا على عقب في الوعاء سعة خمسة لترات. بعد شطف PBS الأخير ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 3.7٪ من الفورمالديهايد في PBS إلى كل بئر باستخدام خزان كاشف 25 ملليلتر وماصة متعددة القنوات.بعد حضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محلول التثبيت واغسل الخلايا باستخدام تقنية الغمر والنقر. بعد غسل PBS الثاني ، قم بتلطيخ النوى ب 100 ميكرولتر من DAPI في PBS لكل بئر. بعد 20 دقيقة ، اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS البارد كما هو موضح سابقا.قم بإزالة أي PBS متبقية عن طريق النقر على اللوحة الدقيقة رأسا على عقب على مسح خال من الوبر. ثم أضف 100 ميكرولتر من PBS الطازج إلى كل بئر باستخدام خزان كاشف 25 ملليلتر وماصة متعددة القنوات. قبل التصوير ، دع اللوحة تتوازن مع درجة حرارة الغرفة ، ثم امسح لوحة زراعة الخلايا الجافة بمسح خال من الوبر.بدلا من ذلك ، قم بتخزين اللوحة المغطاة بعيدا عن الضوء عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. للتصوير الآلي للماكروبينوسوم ، قم بإنشاء بروتوكول أتمتة للحصول على الصور ذات هدف جوي 40X في قناة الطول الموجي لفلوروفور ديكستران و DAPI. بعد ذلك ، قم بتحسين إعدادات التعرض باستخدام عينة من المتوقع أن تحتوي على أعلى مستوى من ندرة الخلايا الكبيرة لتجنب التعرض المفرط ، مما قد يؤدي إلى تشبع الإشارة وفقدان بيانات الكثافة.استخدم إعدادات التركيز البؤري التي تحدد موقع العينة بسهولة وثبات لإنتاج صور عالية الجودة. احصل على صور متعددة عبر كل بئر أو غطاء لمراعاة تباين العينة والحصول على تمثيل دقيق للعينة. لتحديد مؤشر الخلايا الكبيرة، اطرح خلفية DAPI وصورة dextran المقابلة عن طريق تطبيق الدالة المناسبة، والتي تسمى في كثير من الأحيان دالة الكرة المتداولة.اضبط الإعدادات بحيث يتم تقليل ضوضاء الخلفية إلى الحد الأدنى من تأثير الطرح أو بدون تأثير طرح على إشارة DAPI و dextran. بعد ذلك ، باستخدام حقل به إشارة ديكستران عالية ، حدد إعدادات إشارة الشدة ، التي تسمى في كثير من الأحيان دالة العتبة ، لتحديد النوى ، ثم حدد إعداد إشارة الحد الأدنى للكثافة المطلوب لتحديد الماكروبينوسومات فقط. بالنسبة لصورة الدكستران، احسب إجمالي التألق ضمن تحديد macropinosome الذي تم إنشاؤه أو استخدم التحديد لتحديد المساحة الإجمالية الموجبة للدكستران.بالنسبة لصورة DAPI، استخدم التحديد لتحديد عدد النوى في الصورة لتعكس عدد الخلايا الموجودة. ثم حدد مؤشر الخلايا الكبيرة عن طريق قسمة إجمالي فلورة الدكستران أو المساحة على عدد الخلايا التي تحددها DAPI. في خلايا AsPC-1 PDAK ، فإن إضافة EGF عند 100 نانوغرام لكل ملليلتر لمدة خمس دقائق قبل إضافة الدكستران ينشط زيادة عدد الخلايا الكبيرة.علاوة على ذلك ، يمكن أن يحدث تنشيط EGF الأوتوقراطي لندرة الخلايا الكبيرة عن طريق الحرمان من الجلوتامين لمدة 16 إلى 24 ساعة. تظهر خلايا MIA PaCa-2 ندرة الخلايا الكبيرة التأسيسية التي يتم تثبيطها عن طريق العلاج لمدة 30 دقيقة مع 75 ميكرومولار EIPA أو علاج لمدة ساعتين مع 10 ميكرومولار EHop-016. في تجربة الاستجابة للجرعة، انخفض مؤشر الخلايا الكبيرة تدريجيا عند تركيزات دوائية أعلى من EHop-016 و EIPA، مما يؤكد وجود زيادة عدد الخلايا الكبيرة المعتمدة على Rac1.يمكنك تكييف هذا الإجراء لتقييم ندرة الخلايا الكبيرة للبضائع الأخرى الموسومة بالفلورسنت مثل الألبومين. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بتقييم ما إذا كان امتصاص الخلايا الكبيرة للألبومين يساهم في لياقة الخلايا من خلال إجراء فحوصات صلاحية الخلية. كانت هذه التقنية أساسية لتحديد إمدادات المغذيات ذات الخلايا السرطانية الكبيرة في الخلايا السرطانية واللحمية ، وقد زادت الأتمتة بشكل كبير من قدرتنا على اختبار الحالة.

Research

JoVE Journal

Biology

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

شبه الآلي التحليل البصري نبضات القلوب الصغيرة

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

غرس Ferumoxides إعتبر الإنسان الخلايا الجذعية الوسيطة في عيوب الغضروف

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

قوية FISH DNA 3D استخدام مجسات إعتبر مباشرة

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

استخدام<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التصوير الجامع بالأعضاء والأنسجة الكمي الأنسجة لتحديد بيو توزيع الجزيئات Fluorescently إعتبر

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

بروتوكول الآلي السريع لالعضلات تحليل الألياف السكان في الجرذ العضلات المقاطع العرضية عن طريق سلسلة الميوسين الثقيلة المناعية

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

والتصور والتقدير الكمي للخلايا الوسيطة أديبوجينيك التمايز المحتملة مع علامة نسب المحددة

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...