Name: automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes
Uploaded: 2021-08-24T15:00:00
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这项工作得到了NIH / NCI资助（R01CA207189，R21CA243701）的支持，C.C. KMO.G.是TRDRP博士后奖学金（T30FT0952）的获得者。BioTek Cytation 5是Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core的一部分，该核心获得了NCI癌症中心支持补助金（P30 CA030199）的财政支持。图1-3是使用BioRender创建的。

1. 准备材料
<ol><li>将标有FITC或四甲基罗丹明（TMR）的70 kDa葡聚糖溶解在PBS中，以获得20mg / mL溶液。将等分试样储存在-20°C。</li>
	<li>将DAPI溶解在ddH 2 O中，以获得1mg / mL溶液。将等分试样储存在-20°C。 注意：DAPI 是一种潜在的致癌物质，应谨慎处理。</li>
	<li>在固定当天，在PBS中制备新鲜的3.7%ACS级甲醛。 注意：甲醛是一种固定剂，已知致癌物质，吸入有毒。在化学通风橱中制作溶液?...

<ol>
	<li>Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+different+cell+types:+similarities+and+differences.">Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences.</a> Membranes. 10 (8), 21 (2020).</li><li>Recouvreux, M. V., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+a+metabolic+adaptation+to+nutrient+stress+in+cancer.">Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Zhang, Y. J., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer:+a+complex+signaling+network.">Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network.</a> Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+deficiency+and+AMPK+activation+promote+nutrient+scavenging+and+anabolism+in+prostate+cancer+cells.">PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells.</a> Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Kamphorst, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+cancer+tumors+are+nutrient+poor+and+tumor+cells+actively+scavenge+extracellular+protein.">Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein.</a> Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).</li><li>Olivares, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-derived+proline+promotes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cell+survival+under+nutrient+limited+conditions.">Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Seguin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3,+a+druggable+vulnerability+for+KRAS-addicted+cancers.">Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).</li><li>Redelman-Sidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Wnt+pathway+drives+macropinocytosis+in+cancer.">The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer.</a> Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).</li><li>Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+canonical+pathway+activates+macropinocytosis+and+lysosomal+degradation+of+extracellular+proteins.">Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).</li><li>Schmees, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+the+PDGF+beta-receptor+promotes+fibroblast+transformation+by+H-RasG12V.">Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).</li><li>Recouvreux, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+regulates+Slug+to+promote+EMT+and+metastasis+in+pancreatic+cancer.">Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+escape+autophagy+inhibition+via+NRF2-induced+macropinocytosis.">Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis.</a> Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Mishra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+epigenetic+alterations+drive+metabolic+and+neuroendocrine+prostate+cancer+reprogramming.">Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinosome+quantitation+assay.">Macropinosome quantitation assay.</a> MethodsX. 1, 36-41 (2014).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li></ol>

实验和数据采集的质量在很大程度上取决于试剂的质量、设置的优化以及盖玻片和微孔板的清洁度。最终结果应给出重复之间的最小差异;然而，生物变异确实是自然发生的，或者可能是由许多因素引起的。细胞密度可能导致细胞或多或少地对巨噬细胞增多诱导剂或抑制剂作出反应。因此，遵守协议中建议的80%汇合度至关重要。或者，微孔板制造商有充分的记录，即介质蒸发发生在96孔微孔板上。?...

巨噬细胞增多症的非特异性内吞途径允许细胞通过大量摄取细胞外液及其成分来内化各种细胞外成分，包括营养素、蛋白质、抗原和病原体1。虽然对许多细胞类型的生物学很重要，但越来越多地描述了巨细胞增多途径在肿瘤生物学中起着至关重要的作用，其中通过大囊泡摄取，肿瘤细胞能够在营养耗尽的微环境中存活和增殖2，3。细胞外大分子（包括白蛋白和细胞外基质）以及坏死细胞碎片的摄取，通过大卵子体和溶酶体融合介导的货物分解代谢产生氨基酸、糖、脂质和核苷酸，为生物质生产提供了替代营养来源4，5，6，7，8。
巨噬细胞增多症的诱导和调节是复杂的，并且可能因细胞环境而异。到目前为止，已经确定了几种大吞细胞增多症的诱导剂，包括配体，例如表皮生长因子（EGF），血小板衍生生长因子（PDGF），半乳糖凝集素-3和Wnt3A9，10，11，12，13。此外，模拟肿瘤微环境的培养条件可以触发该途径的激活。胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤营养不足，特别是对于氨基酸谷氨酰胺，它导致癌细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）依赖巨噬细胞增多症生存7，13，14，15。此外，缺氧和氧化应激等肿瘤应激可以激活这种清除途径16。除了可以诱导巨噬细胞增多症的众多外在影响因素外，多种细胞内途径控制着巨噬细胞体的形成。致癌性Ras介导的转化足以启动大棘球机制，多种癌症类型表现出致癌Ras驱动的组成性巨噬细胞增多症4，5，9，17。或者，已经鉴定出野生型Ras激活和Ras非依赖性途径可以激活癌细胞和CAFs中的巨肺细胞增多症10，11，15，18。使用各种体外模型与抑制剂治疗相结合，已经鉴定出几种巨噬细胞增多调节剂，包括钠氢交换剂，小GTP酶Rac1，磷酸肌醇3-激酶（PI3K），p21活化激酶（Pak）和AMP活化蛋白激酶（AMPK）4，13，15.然而，鉴于调节巨噬细胞增多症的众多所述因素和条件，可以想象更多的调节剂和刺激仍未被发现。通过在单个实验中自动评估多种条件，可以促进新型调节剂和刺激的鉴定。这种方法可以阐明参与大卵子体形成的因素，并可能允许发现靶向该途径的新型小分子或生物制剂。
在这里，我们将先前建立的用于在体外测定癌细胞中巨噬细胞中巨噬细胞作用程度的方案调整为96孔微孔板格式以及自动成像和定量19，20。该协议基于荧光显微镜，已成为在体外和体内确定巨肺细胞增多症领域的标准4，5，6，7，9，10，11，12，13，15，16，17，18，19，20，21，22。大卵磷脂体可以通过其内化大分子的能力与其他内吞途径区分开来，例如高分子量葡聚糖（即70 kDa）2，3，4，20，21，22，23。因此，可以通过摄取细胞外施用的荧光团标记的70 kDa葡聚糖来定义大卵子体。结果，大脊髓细胞囊泡表现为细胞内荧光点簇，大小范围为0.2-5μm。这些点可以进行显微镜成像并随后进行定量，以确定细胞中巨肺细胞增多的程度 - "大棘球细胞指数"。
在该协议中，描述了使用标准实验室设备在96孔微孔板和盖玻片上 体外 可视化贴壁细胞中巨卵子体的基本步骤 （图1）。此外，还提供了使用细胞成像多模读板仪自动获取图像和定量大旋心核细胞指数的方向。与我们之前描述的协议相比，这种自动化减少了时间、成本和工作量19，20。此外，它避免了无意中偏倚的成像采集和分析，从而提高了再现性和可靠性。该方法可以很容易地适应不同的细胞类型或读板器，或者用于确定替代的大促卵子体特征，如大小，数量和位置。本文描述的方法特别适用于筛选诱导巨噬细胞增多症的细胞培养条件，鉴定新型调节剂，或优化已知抑制剂的药物浓度。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62828/62828fig01.jpg"> 图1：用于确定贴壁细胞中"大脊髓细胞指数"的自动测定示意图。 使用BioRender创建。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62828/62828fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25053CI</td>
			<td>0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent reservoir</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>28-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>155503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter for standard tips</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>159024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories Inc</td>
			<td>4355226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia-free glass cleaner</td>
			<td>Sparkle</td>
			<td>FUN20500CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well high-content screening microplate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055300</td>
			<td>CellCarrier-96 Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>CYT5FW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.08741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - FITC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1822</td>
			<td>Lysine-fixable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - TMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21031CV</td>
			<td>Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 37%</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>RSOF0010-250A</td>
			<td>ACS Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardening fluorescence mounting media</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td>DAKO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Certified ACS Plus, 36.5%&#8211;38.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td>Premium plain glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10013</td>
			<td>8 channels, 0.5&#8211;10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10012&#160;</td>
			<td>12 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td>8 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Pechiney</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Kirkland Signature</td>
			<td>208733</td>
			<td>Stretch-Tite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone isolators</td>
			<td>Grace Bio Labs Inc</td>
			<td>664107</td>
			<td>13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide adapter</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>1220548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0340922C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes

大吞细胞增多症是一种非特异性液相摄取途径，允许细胞通过大量内吞作用内吞化大细胞外货物，如蛋白质、病原体和细胞碎片。该途径在各种细胞过程中起着至关重要的作用，包括免疫反应和癌细胞代谢的调节。鉴于这种在生物学功能中的重要性，检查细胞培养条件可以通过识别该途径的调节因子并优化用于发现新治疗方法的条件来提供有价值的信息。该研究描述了一种使用标准实验室设备和细胞成像多模读板仪的自动成像和分析技术，用于快速定量贴壁细胞中的大旋囊细胞指数。该自动化方法基于高分子量荧光葡聚糖的摄取，可应用于96孔微孔板，以方便评估一个实验中的多种条件或安装在玻璃盖玻片上的固定样品。这种方法旨在最大限度地提高可重复性并减少实验变异，同时节省时间和成本效益。

当相应地遵循上述方案的步骤和调整时，最终实验结果应提供有关所研究的细胞培养条件或抑制剂是否诱导或减少目标细胞系中的巨噬细胞增多症的信息。为了加强这些发现的有效性，纳入控制条件将允许对结果进行仔细检查，以确定实验是否已成功完成。巨噬细胞增多症诱导对照将提供有关巨噬细胞增多症相对水平的信息。为此，配体EGF是最常用的13。在AsPC-1 PDAC细胞中，在加...

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Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

使用多孔微孔板的自动测定是识别通路调节剂的有利方法，因为它允许在单个实验中评估多种条件。在这里，我们将完善的巨噬菌体成像和定量方案改编为96孔微孔板格式，并为使用多模读板仪的自动化提供了全面的概述。

用于荧光标记大促卵体定量的自动成像和分析

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

巨噬细胞增多症是一种内吞途径，对包括癌症代谢在内的各种细胞过程很重要。该协议允许您量化体外细胞中巨噬细胞增多的程度。自动化旨在最大限度地提高可重复性，生产率并减少实验差异。此外，荧光显微镜允许您目视检查样品以确定实验质量并评估其他巨噬细胞体特征。与我一起演示该过程的将是来自我实验室的研究助理Cheska Marie Galapate。对于带盖玻片格式的24孔板，使用镊子从乙醇浴中夹住单个盖玻片。将盖玻片轻拍到板的内壁以除去多余的乙醇，并将盖玻片平放在孔的底部。乙醇蒸发后，用DPBS洗涤盖玻片两次，然后通过向每个孔中加入500微升细胞悬浮液，将细胞接种在盖玻片顶部。将细胞置于具有5%二氧化碳的37摄氏度细胞培养箱中，直到细胞汇合度在大促卵体标记前一天达到60%至80%。在标记大促卵泡体的前一天，用500微升预热的无血清培养基替换孔中的培养基，并将细胞置于培养箱中16至24小时。对于96孔微孔板形式，首先将细胞悬浮液转移到25毫升试剂储液器中。然后使用多通道移液管，将100微升的细胞悬浮液接种到具有光学透明环烯烃或玻璃底部的黑色96孔高内涵筛选微孔板中。孵育细胞，直到细胞汇合度在巨噬细胞体标记前一天达到60%至80%。在标记大促卵体的前一天，使用多通道吸液适配器从每个孔中取出并丢弃培养基，用于连接到真空泵的标准吸头。或者，可以使用多通道移液器。使用试剂储液器和多通道移液器，轻轻地向每个孔中加入100微升预热的无血清培养基，然后将细胞置于细胞培养箱中16至24小时。对于具有盖玻片形式的24孔板，用200微升无血清培养基用荧光团标记的高分子量葡聚糖替换孔中的培养基，并将细胞置于细胞培养箱中30分钟。孵育后，吸出培养基，并使用预冷的洗涤瓶用冰冷的PBS轻轻但快速地洗涤细胞五次。在洗涤过程中用手用力摇动盘子，以帮助去除粘在盖玻片上的葡聚糖聚集体。接下来，通过加入350微升3.7%甲醛并孵育20分钟来固定细胞，然后吸出固定溶液并用PBS洗涤细胞两次。在PBS中用350微升DAPI染色细胞核。20分钟后，吸出DAPI溶液并用PBS洗涤细胞三次。将有机硅隔离器并排放在显微镜载玻片上，以获得成像自动化所需的盖玻片的均匀间距和可重复的定位。然后，对于每个盖玻片，在隔离器的开放空间内的显微镜载玻片上添加一滴硬化荧光安装介质。使用镊子拿起盖玻片，通过在无绒擦拭物上轻轻敲击盖玻片的侧面来去除多余的PBS。接下来，将盖玻片倒置在安装介质的落下，然后使用封闭的镊子轻轻敲击盖玻片，以清除安装介质上的气泡。将载玻片存放在黑暗的环境中，让安装介质在室温下干燥，通常需要16到24小时。在成像之前，从显微镜载玻片上取下隔离器。将载玻片平衡到室温后，使用用无氨玻璃清洁剂润湿的棉质贴片清洁盖玻片。随后，使用用70%乙醇润湿的清洁棉质涂抹器清洁盖玻片并保持干燥。对于96孔微孔板形式，在如前所述吸入孔后，将40微升含有荧光团标记的高分子量葡聚糖的无血清培养基加入孔中，然后将细胞在细胞培养箱中孵育30分钟。孵育后，通过手动将板倒置到空的五升烧杯中，将培养基丢弃在微孔板中，然后通过以轻微的角度将板垂直缓慢浸入充满冰冷PBS的两升烧杯中来冲洗细胞和微孔板两次，然后通过将板倒置到五升烧杯中来丢弃微孔板中的PBS。在最后一次PBS冲洗后，使用25毫升试剂储液器和多通道移液器向每个孔中加入PBS中100微升3.7%甲醛来固定细胞。在室温下孵育20分钟后，取出固定溶液并使用浸没和轻拂技术用PBS洗涤细胞。第二次PBS洗涤后，用每孔PBS中的100微升DAPI染色细胞核。20分钟后，如前所述，用冰冷的PBS冲洗细胞三次。通过将微孔板倒置在不起毛的湿巾上，去除任何残留的PBS。然后使用25毫升试剂储液器和多通道移液器向每个孔中加入100微升新鲜PBS。在成像之前，让板平衡到室温，然后用不起毛的擦拭擦干细胞培养板。或者，将盖在四摄氏度的光照下将盘子存放长达一周。对于自动大卵泡体成像，创建一个自动化协议，以在葡聚糖荧光团和DAPI的波长通道中采集具有40X空气物镜的图像。接下来，使用预测具有最高水平巨肺细胞增多症的样本优化曝光设置，以避免过度暴露，这可能导致信号饱和和强度数据丢失。使用可轻松、一致地定位样品的对焦设置，以生成高质量的图像。在每个孔或盖玻片上采集多张图像，以考虑样品的变异性并获得样品的准确表示。为了确定大棘球指数，通过应用适当的函数（通常称为滚动球函数）减去DAPI的背景和相应的葡聚糖图像。调整设置，使背景噪声最小化，对DAPI和葡聚糖信号的影响最小甚至没有减法。接下来，利用具有高葡聚糖信号的场，确定强度信号设置，通常称为阈值函数，选择细胞核，然后确定最小强度信号设置，只需要选择大倍体。对于葡聚糖图像，计算所创建的巨噬细胞体选择内的总荧光，或使用选择来确定葡聚糖阳性的总面积。对于 DAPI 图像，使用选择来确定图像中的细胞核数，以反映存在的细胞数。然后通过将总葡聚糖荧光或面积除以DAPI确定的细胞数量来确定大脊髓细胞指数。在AsPC-1 PDAK细胞中，在加入葡聚糖之前，以每毫升100纳克的速度添加EGF五分钟，激活巨噬细胞增多症。此外，自分泌EGF激活巨噬细胞增多症可以通过谷氨酰胺剥夺16至24小时来诱导。MIA PaCa-2细胞显示构成性巨噬细胞增多症，其通过75微摩尔EIPA治疗30分钟或用10微摩尔EHop-016治疗两小时来抑制。在剂量反应实验中，在EHop-016和EIPA的较高药物浓度下，大棘球细胞指数逐渐降低，从而证实了构成性Rac1依赖性巨噬细胞增多症的存在。您可以调整此程序来评估其他荧光标记货物（如白蛋白）的巨噬细胞增多症。此外，建议通过进行细胞活力测定来评估白蛋白的大脊髓细胞摄取是否有助于细胞健康。该技术一直是鉴定癌症和基质细胞中大脊髓细胞营养供应的核心，自动化大大提高了我们的状态测试能力。

Research

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