Name: automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes
Uploaded: 2021-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch NIH/NCI-Zuschüsse (R01CA207189, R21CA243701) an C.C unterstützt. KMO.G. erhielt einen TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). Der BioTek Cytation 5 ist Teil des Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, der finanzielle Unterstützung aus dem NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199) erhält. Die Abbildungen 1-3 wurden mit BioRender erstellt.

1. Vorbereitung der Materialien
<ol><li>Lösen Sie 70 kDa Dextran, das mit FITC oder Tetramethylrhodamin (TMR) markiert ist, in PBS, um eine 20 mg/ml-Lösung zu erhalten. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C.</li>
	<li>DaPI in ddH2O auflösen, um eine 1 mg/ml Lösung zu erhalten. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C. VORSICHT: DAPI ist ein potenzielles Karzinogen und sollte mit Vorsicht behandelt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie am Tag der Fixierung frisches 3,7% ACS-Formaldehyd in PBS zu. VORSICHT: Formal...

<ol>
	<li>Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+different+cell+types:+similarities+and+differences.">Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences.</a> Membranes. 10 (8), 21 (2020).</li><li>Recouvreux, M. V., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+a+metabolic+adaptation+to+nutrient+stress+in+cancer.">Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Zhang, Y. J., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer:+a+complex+signaling+network.">Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network.</a> Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+deficiency+and+AMPK+activation+promote+nutrient+scavenging+and+anabolism+in+prostate+cancer+cells.">PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells.</a> Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Kamphorst, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+cancer+tumors+are+nutrient+poor+and+tumor+cells+actively+scavenge+extracellular+protein.">Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein.</a> Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).</li><li>Olivares, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-derived+proline+promotes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cell+survival+under+nutrient+limited+conditions.">Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Seguin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3,+a+druggable+vulnerability+for+KRAS-addicted+cancers.">Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).</li><li>Redelman-Sidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Wnt+pathway+drives+macropinocytosis+in+cancer.">The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer.</a> Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).</li><li>Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+canonical+pathway+activates+macropinocytosis+and+lysosomal+degradation+of+extracellular+proteins.">Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).</li><li>Schmees, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+the+PDGF+beta-receptor+promotes+fibroblast+transformation+by+H-RasG12V.">Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).</li><li>Recouvreux, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+regulates+Slug+to+promote+EMT+and+metastasis+in+pancreatic+cancer.">Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+escape+autophagy+inhibition+via+NRF2-induced+macropinocytosis.">Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis.</a> Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Mishra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+epigenetic+alterations+drive+metabolic+and+neuroendocrine+prostate+cancer+reprogramming.">Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinosome+quantitation+assay.">Macropinosome quantitation assay.</a> MethodsX. 1, 36-41 (2014).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li></ol>

Die Qualität der Experimente und der Datenerfassung hängt stark von der Qualität der Reagenzien, der Optimierung der Einstellungen und der Sauberkeit der Deckgläser und der Mikrotiterplatte ab. Die Endergebnisse sollten eine minimale Variation zwischen den Replikaten ergeben; Biologische Variationen kommen jedoch natürlich vor oder können anderweitig durch eine Reihe von Faktoren verursacht werden. Die Zelldichte kann dazu führen, dass Zellen mehr oder weniger auf Makropinozytose-Induktoren oder -inhibitoren reagi...

Der unspezifische endozytäre Weg der Makropinozytose ermöglicht es Zellen, eine Vielzahl von extrazellulären Komponenten, einschließlich Nährstoffen, Proteinen, Antigenen und Krankheitserregern, durch Massenaufnahme von extrazellulärer Flüssigkeit und ihren Bestandteilen zu internalisieren1. Obwohl wichtig für die Biologie zahlreicher Zelltypen, wird zunehmend beschrieben, dass der Makropinozytoseweg eine wesentliche Rolle in der Tumorbiologie spielt, wo Tumorzellen durch makropinozytäre Aufnahme in der Lage sind, in Gegenwart einer nährstoffarmen Mikroumgebung zu überleben und sich zu vermehren2,3. Die Aufnahme extrazellulärer Makromoleküle, einschließlich Albumin und extrazellulärer Matrix, sowie nekrotischer Zelltrümmer bietet eine alternative Nährstoffquelle für die Biomasseproduktion, indem Aminosäuren, Zucker, Lipide und Nukleotide durch Makropinosomen- und Lysosomenfusions-vermittelte Frachtkatabolismus erzeugt werden4,5,6,7,8.
Die Induktion und Regulation der Makropinozytose ist komplex und kann je nach zellulärem Kontext variieren. Bisher wurden mehrere Induktoren der Makropinozytose identifiziert und umfassen Liganden wie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den von Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), Galectin-3 und Wnt3A9,10,11,12,13. Darüber hinaus können Kultivierungsbedingungen, die die Tumormikroumgebung nachahmen, die Aktivierung des Signalwegs auslösen. Tumoren des duktalen Adenokarzinoms (PDAC) der Bauchspeicheldrüse sind nährstoffarm, insbesondere für die Aminosäure Glutamin, die dazu führt, dass sowohl Krebszellen als auch krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) auf Makropinozytose angewiesen sind7,13,14,15. Darüber hinaus können Tumorbelastungen wie Hypoxie und oxidativer Stress diesen Fressweg aktivieren16. Zusätzlich zu den zahlreichen extrinsischen Einflussfaktoren, die Makropinozytose induzieren können, steuern eine Vielzahl von intrazellulären Signalwegen die Bildung von Makropinosomen. Die onkogene Ras-vermittelte Transformation reicht aus, um die makropinozytische Maschinerie zu initiieren, und mehrere Krebsarten weisen eine onkogene Ras-gesteuerte konstitutive Makropinozytose auf4,5,9,17. Alternativ wurden Wildtyp-Ras-Aktivierung und Ras-unabhängige Signalwege identifiziert, um makropinozytose in Krebszellen und CAFs zu aktivieren10,11,15,18. Die Verwendung verschiedener In-vitro-Modelle in Kombination mit Inhibitorbehandlungen hat zur Identifizierung mehrerer Makropinozytosemodulatoren geführt, darunter Natrium-Wasserstoff-Austauscher, die kleine GTPase Rac1, die Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K), die p21-aktivierte Kinase (Pak) und die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK)4,13,15 . Angesichts der Vielzahl der beschriebenen Faktoren und Bedingungen, die die Makropinozytose regulieren, ist es jedoch denkbar, dass noch viel mehr Modulatoren und Reize unentdeckt bleiben. Die Identifizierung neuartiger Modulatoren und Stimuli kann durch die automatisierte Bewertung einer Vielzahl von Bedingungen in einem einzigen Experiment erleichtert werden. Diese Methodik kann Aufschluss über die Faktoren geben, die an der Bildung von Makropinosomen beteiligt sind, und kann die Entdeckung neuartiger kleiner Moleküle oder Biologika ermöglichen, die auf diesen Signalweg abzielen.
Hier haben wir unser bisher etabliertes Protokoll zur Bestimmung des Ausmaßes der Makropinozytose in Krebszellen in vitro auf ein 96-Well-Mikroplattenformat und automatisierte Bildgebung und Quantifizierung angepasst19,20. Dieses Protokoll basiert auf der Fluoreszenzmikroskopie, die zu einem Standard auf dem Gebiet der Bestimmung der Makropinozytose in vitro und in vivo geworden ist4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. Makropinosomen können von anderen endozytären Signalwegen durch ihre Fähigkeit unterschieden werden, große Makromoleküle wie hochmolekulares Dextran (d.h. 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23 zu internalisieren. Somit können Makropinosomen durch aufnahme von extrazellulär verabreichtem Fluorophor-markiertem 70 kDa Dextran definiert werden. Infolgedessen manifestieren sich makropinozytäre Vesikel als intrazelluläre Cluster fluoreszierender Punktika mit Größen von 0,2-5 μm. Diese Puncta können mikroskopisch abgebildet und anschließend quantifiziert werden, um das Ausmaß der Makropinozytose in der Zelle - den "makropinozytären Index" - zu bestimmen.
In diesem Protokoll werden die wesentlichen Schritte zur Visualisierung von Makropinosomen in adhärenten Zellen in vitro auf einer 96-Well-Mikroplatte und Deckgläsern mit Standardlaborgeräten beschrieben (Abbildung 1). Darüber hinaus werden die Anweisungen zur Automatisierung der Bildaufnahme und Quantifizierung des makropinozytären Index mit einem cell imaging Multimode-Plattenleser bereitgestellt. Diese Automatisierung reduziert Zeit, Kosten und Aufwand im Vergleich zu unseren zuvor beschriebenen Protokollen19,20. Darüber hinaus vermeidet es eine unbeabsichtigt verzerrte Bilderfassung und -analyse und erhöht dadurch die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit. Diese Methode kann leicht an verschiedene Zelltypen oder Plattenleser angepasst oder zur Bestimmung alternativer Makropinosomenmerkmale wie Größe, Anzahl und Position verwendet werden. Das hierin beschriebene Verfahren eignet sich insbesondere für das Screening von Zellkulturbedingungen, die makropinozytose induzieren, die Identifizierung neuartiger Modulatoren oder die Optimierung von Wirkstoffkonzentrationen bekannter Inhibitoren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62828/62828fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des automatisierten Assays zur Bestimmung des "makropinozytären Index" in adhärenten Zellen. Erstellt mit BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62828/62828fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25053CI</td>
			<td>0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent reservoir</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>28-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>155503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter for standard tips</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>159024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories Inc</td>
			<td>4355226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia-free glass cleaner</td>
			<td>Sparkle</td>
			<td>FUN20500CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well high-content screening microplate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055300</td>
			<td>CellCarrier-96 Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>CYT5FW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.08741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - FITC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1822</td>
			<td>Lysine-fixable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - TMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21031CV</td>
			<td>Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 37%</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>RSOF0010-250A</td>
			<td>ACS Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardening fluorescence mounting media</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td>DAKO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Certified ACS Plus, 36.5%&#8211;38.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td>Premium plain glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10013</td>
			<td>8 channels, 0.5&#8211;10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10012&#160;</td>
			<td>12 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td>8 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Pechiney</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Kirkland Signature</td>
			<td>208733</td>
			<td>Stretch-Tite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone isolators</td>
			<td>Grace Bio Labs Inc</td>
			<td>664107</td>
			<td>13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide adapter</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>1220548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0340922C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes

Makropinozytose ist ein unspezifischer Flüssigkeitsphasenaufnahmeweg, der es Zellen ermöglicht, große extrazelluläre Fracht wie Proteine, Krankheitserreger und Zelltrümmer durch Bulk-Endozytose zu internalisieren. Dieser Signalweg spielt eine wesentliche Rolle bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Regulierung von Immunantworten und des Stoffwechsels von Krebszellen. Angesichts dieser Bedeutung für die biologische Funktion kann die Untersuchung der Zellkulturbedingungen wertvolle Informationen liefern, indem Regulatoren dieses Signalwegs identifiziert und die Bedingungen für die Entdeckung neuartiger therapeutischer Ansätze optimiert werden. Die Studie beschreibt eine automatisierte Bildgebungs- und Analysetechnik unter Verwendung von Standardlaborgeräten und einem zellbildenden Multimode-Plattenleser zur schnellen Quantifizierung des makropinozytären Index in adhärenten Zellen. Die automatisierte Methode basiert auf der Aufnahme von hochmolekularem fluoreszierendem Dextran und kann auf 96-Well-Mikrotiterplatten angewendet werden, um die Beurteilung mehrerer Bedingungen in einem Experiment oder fester Proben auf Glasdeckgläsern zu erleichtern. Dieser Ansatz zielt darauf ab, die Reproduzierbarkeit zu maximieren und die experimentelle Variation zu reduzieren, während er gleichzeitig zeitsparend und kostengünstig ist.

Wenn die Schritte und die Anpassung des oben beschriebenen Protokolls entsprechend befolgt werden, sollten die endgültigen experimentellen Ergebnisse Informationen darüber liefern, ob die untersuchten Zellkulturbedingungen oder Inhibitoren die Makropinozytose in der interessierenden Zelllinie induzieren oder reduzieren. Um die Validität dieser Ergebnisse zu stärken, ermöglicht die Einbeziehung von Kontrollbedingungen die Überprüfung der Ergebnisse, um festzustellen, ob das Experiment erfolgreich abgeschlossen wurd...

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Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Automatisierte Assays mit Multi-Well-Mikroplatten sind vorteilhafte Ansätze zur Identifizierung von Signalwegregulatoren, indem sie die Bewertung einer Vielzahl von Bedingungen in einem einzigen Experiment ermöglichen. Hier haben wir das etablierte Makropinosomen-Bildgebungs- und Quantifizierungsprotokoll an ein 96-Well-Mikroplattenformat angepasst und bieten einen umfassenden Überblick über die Automatisierung mit einem Multimode-Plattenleser.

Automatisierte Bildgebung und Analyse zur Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Makropinosomen

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Makropinozytose ist ein endozytärer Weg, der für eine Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich des Krebsstoffwechsels, wichtig ist. Dieses Protokoll ermöglicht es Ihnen, das Ausmaß der Makropinozytose in Zellen in vitro zu quantifizieren. Die Automatisierung zielt darauf ab, die Reproduzierbarkeit und Produktivität zu maximieren und die experimentelle Variation zu reduzieren.Darüber hinaus können Sie mit der Fluoreszenzmikroskopie die Probe visuell untersuchen, um die experimentelle Qualität zu bestimmen und zusätzliche Makropinosomeneigenschaften zu bewerten. Mit mir wird Cheska Marie Galapate, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, das Verfahren demonstrieren. Für die 24-Well-Platte mit Deckglasformat verwenden Sie eine Pinzette, um einen einzelnen Deckglas aus dem Ethanolbad zu greifen.Klopfen Sie mit dem Deckglas an die Innenwand der Platte, um überschüssiges Ethanol zu entfernen, und legen Sie den Deckglas flach auf den Boden des Brunnens. Nachdem das Ethanol verdampft ist, waschen Sie den Deckglas zweimal mit DPBS und säen Sie dann die Zellen auf den Deckglas, indem Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung geben. Legen Sie die Zellen in einen 37 Grad Celsius großen Zellinkubator mit 5% Kohlendioxid, bis die Zellkonfluenz am Tag vor der Makropinosomenmarkierung 60 bis 80% erreicht.Ersetzen Sie am Tag vor der Makropinosomenmarkierung die Medien in den Vertiefungen durch 500 Mikroliter vorgewärmte serumfreie Medien und legen Sie die Zellen für 16 bis 24 Stunden in den Inkubator. Für das 96-Well-Mikrotiterplattenformat beginnen Sie mit der Übertragung der Zellsuspension in ein 25-Milliliter-Reagenzreservoir. Anschließend werden mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-High-Content-Screening-Mikrotiterplatte mit einem optisch klaren zyklischen Olefin- oder Glasboden gesät.Inkubieren Sie die Zellen, bis die Zellkonfluenz am Tag vor der Makropinosomenmarkierung 60 bis 80% erreicht. Am Tag vor der Makropinosomen-Etikettierung entfernen und entsorgen Sie das Medium aus jedem Bohrloch mit einem Mehrkanal-Aspirationsadapter für Standardspitzen, die an einer Vakuumpumpe befestigt sind. Alternativ kann eine Mehrkanalpipette verwendet werden.Geben Sie mit einem Reagenzreservoir und einer Mehrkanalpipette vorsichtig 100 Mikroliter vorgewärmte serumfreie Medien in jede Vertiefung und legen Sie die Zellen dann für 16 bis 24 Stunden in den Zellinkubator. Für die 24-Well-Platte mit Deckglasformat ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen durch 200 Mikroliter serumfreie Medien durch fluorophormarkiertes hochmolekulares Dextran und legen Sie die Zellen für 30 Minuten in den Zellinkubator. Nach der Inkubation das Medium absaugen und die Zellen mit einer vorgekühlten Waschflasche vorsichtig, aber schnell fünfmal mit eiskaltem PBS waschen.Schütteln Sie die Platte während des Waschens fest von Hand, um das Entfernen von Dextran-Aggregaten zu unterstützen, die an den Deckgläsern haften bleiben. Als nächstes fixieren Sie die Zellen, indem Sie 350 Mikroliter 3,7% Formaldehyd hinzufügen und 20 Minuten lang inkubieren, dann die Fixierungslösung absaugen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Färben Sie die Kerne mit 350 Mikrolitern DAPI in PBS.Nach 20 Minuten die DAPI-Lösung absaugen und die Zellen dreimal mit PBS waschen. Kleben Sie Silikonisolatoren nebeneinander auf einen Objektträger, um einen gleichmäßigen Abstand und eine reproduzierbare Lokalisierung der für die Bildgebungsautomatisierung erforderlichen Deckgläser zu erhalten. Fügen Sie dann für jeden Deckglas einen Tropfen gehärtetes Fluoreszenz-Montagemedium auf dem Objektträger im offenen Raum des Isolators hinzu.Heben Sie einen Deckglas mit einer Pinzette auf und entfernen Sie überschüssiges PBS, indem Sie vorsichtig auf die Seite der Deckgläser auf ein fusselfreies Tuch klopfen. Legen Sie als Nächstes den Deckglaskopf auf den Tropfen des Montagemediums und klopfen Sie vorsichtig mit einer geschlossenen Pinzette auf den Deckglas, um Blasen vom Montagemedium zu entfernen. Lagern Sie die Dias in einer dunklen Umgebung und lassen Sie die Montagemedien bei Raumtemperatur trocknen, was typischerweise 16 bis 24 Stunden dauert.Entfernen Sie vor der Bildgebung die Isolatoren vom Objektträger. Nachdem die Objektträger auf Raumtemperatur ausgeglichen wurden, reinigen Sie die Deckgläser mit einem mit ammoniakfreiem Glasreiniger benetzten Applikator mit Baumwollspitze. Verwenden Sie anschließend einen sauberen Applikator mit Baumwollspitze, der mit 70% Ethanol benetzt ist, um den Deckslip zu reinigen und trocken zu lassen.Für das 96-Well-Mikroplattenformat werden nach dem Absaugen der Vertiefungen, wie zuvor demonstriert, 40 Mikroliter serumfreie Medien mit fluorophormarkiertem Dextran mit hohem Molekulargewicht in die Vertiefungen gegeben und dann die Zellen im Zellinkubator für 30 Minuten inkubiert. Entsorgen Sie nach der Inkubation das Medium in der Mikroplatte, indem Sie die Platte manuell auf den Kopf stellen in ein leeres Fünf-Liter-Becherglas drehen, dann spülen Sie die Zellen und die Mikroplatte zweimal ab, indem Sie die Platte langsam vertikal in einem leichten Winkel in ein mit eiskaltem PBS gefülltes Zwei-Liter-Becherglas tauchen und anschließend das PBS in der Mikrotiterplatte verwerfen, indem Sie die Platte kopfüber in das Fünf-Liter-Becherglas werfen. Nach der letzten PBS-Spülung fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter 3,7% Formaldehyd in PBS in jede Vertiefung mit einem 25-Milliliter-Reagenzreservoir und einer Mehrkanalpipette geben.Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur entfernen Sie die Fixierlösung und waschen die Zellen mit PBS in der Tauch- und Flicktechnik. Färben Sie nach der zweiten PBS-Wäsche die Kerne mit 100 Mikrolitern DAPI in PBS pro Vertiefung. Nach 20 Minuten spülen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS aus, wie zuvor gezeigt.Entfernen Sie alle PBS-Reste, indem Sie die Mikroplatte kopfüber auf ein fusselfreies Tuch klopfen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter frisches PBS zu jeder Vertiefung mit einem 25-Milliliter-Reagenzreservoir und einer Mehrkanalpipette hinzu. Lassen Sie die Platte vor der Bildgebung auf Raumtemperatur ausgleichen und wischen Sie dann die Zellkulturplatte mit einem fusselfreien Tuch trocken.Alternativ lagern Sie den Teller lichtgeschützt bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche. Erstellen Sie für die automatisierte Makropinosomen-Bildgebung ein Automatisierungsprotokoll, um die Bilder mit einem 40-fachen Luftobjektiv im Wellenlängenkanal des Dextranfluorophors und DAPI zu erfassen. Als nächstes optimieren Sie die Expositionseinstellungen mit einer Probe, von der vorhergesagt wird, dass sie den höchsten Grad an Makropinozytose aufweist, um eine Überbelichtung zu vermeiden, die zu einer Sättigung des Signals und einem Verlust der Intensitätsdaten führen kann.Verwenden Sie Fokuseinstellungen, die das Sample schnell und konsistent lokalisieren, um qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen. Erfassen Sie mehrere Bilder in jedem Bohrloch oder Deckglas, um die Probenvariabilität zu berücksichtigen und eine genaue Darstellung der Probe zu erhalten. Um den makropinozytären Index zu bestimmen, subtrahieren Sie den Hintergrund für den DAPI und das entsprechende Dextranbild, indem Sie die entsprechende Funktion anwenden, die häufig als Rollkugelfunktion bezeichnet wird.Passen Sie die Einstellungen so an, dass das Hintergrundrauschen mit minimalem bis keinem Subtraktionseffekt auf das DAPI- und Dextran-Signal minimiert wird. Bestimmen Sie als Nächstes mit einem Feld mit hohem Dextransignal die Intensitätssignaleinstellungen, die häufig als Schwellenwertfunktion bezeichnet werden, um die Kerne auszuwählen, und bestimmen Sie dann die minimale Intensitätssignaleinstellung, die erforderlich ist, um nur die Makropinosomen auszuwählen. Berechnen Sie für das Dextranbild die Gesamtfluoreszenz innerhalb der erzeugten Makropinosomenauswahl oder verwenden Sie die Auswahl, um die für Dextran positive Gesamtfläche zu bestimmen.Verwenden Sie für das DAPI-Bild die Auswahl, um die Anzahl der Kerne im Bild zu bestimmen, um die Anzahl der vorhandenen Zellen widerzuspiegeln. Bestimmen Sie dann den makropinozytischen Index, indem Sie die gesamte Dextranfluoreszenz oder -fläche durch die Anzahl der durch DAPI bestimmten Zellen dividieren. In AsPC-1 PDAK-Zellen aktiviert die Zugabe von EGF bei 100 Nanogramm pro Milliliter für fünf Minuten vor der Zugabe des Dextrans die Makropinozytose.Darüber hinaus kann die autokrine EGF-Aktivierung der Makropinozytose durch Glutaminentzug für 16 bis 24 Stunden induziert werden. MIA PaCa-2-Zellen zeigen eine konstitutive Makropinozytose, die durch eine 30-minütige Behandlung mit 75 mikromolarer EIPA oder eine zweistündige Behandlung mit 10 mikromolaren EHop-016 gehemmt wird. In einem Dosis-Wirkungs-Experiment nahm der makropinozytische Index bei höheren Wirkstoffkonzentrationen von EHop-016 und EIPA allmählich ab, wodurch die Existenz einer konstitutiven Rac1-abhängigen Makropinozytose bestätigt wurde.Sie können dieses Verfahren anpassen, um die Makropinozytose anderer fluoreszierend markierter Fracht wie Albumin zu beurteilen. Darüber hinaus wird empfohlen, durch die Durchführung von Zelllebensfähigkeitstests zu bewerten, ob die makropinozytäre Aufnahme von Albumin zur Zellfitness beiträgt. Diese Technik war von zentraler Bedeutung für die Identifizierung der makropinozytären Nährstoffversorgung in Krebs- und Stromazellen, und die Automatisierung hat unsere Zustandstestkapazität erheblich erhöht.

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

Biologie

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