Name: automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes
Uploaded: 2021-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH / NCI (R01CA207189, R21CA243701) ל- C.C. KMO.G. הוא מקבל פרס מלגת פוסט-דוקטורט TRDRP (T30FT0952). BioTek Cytation 5 הוא חלק מליבת הדמיית התאים של סנפורד ברנהם פרביס, המקבלת תמיכה כספית ממענק התמיכה של מרכז הסרטן NCI (P30 CA030199). איורים 1-3 נוצרו באמצעות BioRender.

1. הכנת חומרים
<ol><li>להמיס 70 kDa dextran מסומן עם FITC או tetramethylrhodamine (TMR) ב- PBS כדי לקבל פתרון 20 מ"ג / מ"ל. לאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F).</li>
	<li>יש להמיס את DAPI ב-ddH2O כדי לקבל פתרון של 1 מ"ג/מ"ל. לאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F). זהירות: DAPI הוא מסרטן פוטנציאלי ויש לטפל בו בזהירות.</li>
	<li>ביום הקיבעון, להכין טרי 3.7% פורמל...

<ol>
	<li>Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+different+cell+types:+similarities+and+differences.">Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences.</a> Membranes. 10 (8), 21 (2020).</li><li>Recouvreux, M. V., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+a+metabolic+adaptation+to+nutrient+stress+in+cancer.">Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Zhang, Y. J., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer:+a+complex+signaling+network.">Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network.</a> Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+deficiency+and+AMPK+activation+promote+nutrient+scavenging+and+anabolism+in+prostate+cancer+cells.">PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells.</a> Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Kamphorst, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+cancer+tumors+are+nutrient+poor+and+tumor+cells+actively+scavenge+extracellular+protein.">Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein.</a> Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).</li><li>Olivares, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-derived+proline+promotes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cell+survival+under+nutrient+limited+conditions.">Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Seguin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3,+a+druggable+vulnerability+for+KRAS-addicted+cancers.">Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).</li><li>Redelman-Sidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Wnt+pathway+drives+macropinocytosis+in+cancer.">The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer.</a> Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).</li><li>Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+canonical+pathway+activates+macropinocytosis+and+lysosomal+degradation+of+extracellular+proteins.">Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).</li><li>Schmees, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+the+PDGF+beta-receptor+promotes+fibroblast+transformation+by+H-RasG12V.">Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).</li><li>Recouvreux, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+regulates+Slug+to+promote+EMT+and+metastasis+in+pancreatic+cancer.">Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+escape+autophagy+inhibition+via+NRF2-induced+macropinocytosis.">Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis.</a> Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Mishra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+epigenetic+alterations+drive+metabolic+and+neuroendocrine+prostate+cancer+reprogramming.">Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinosome+quantitation+assay.">Macropinosome quantitation assay.</a> MethodsX. 1, 36-41 (2014).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li></ol>

איכות הניסויים ורכישת הנתונים תלויה מאוד באיכות הריאגנטים, באופטימיזציה של ההגדרות ובניקיון כיסויי הכיסוי והמיקרו-לוחית. התוצאות הסופיות צריכות לתת שונות מינימלית בין שכפולים; עם זאת, שינויים ביולוגיים מתרחשים באופן טבעי או עלולים להיגרם בדרך אחרת על ידי מספר גורמים. צפיפות תאים עלולה ל...

המסלול האנדוציטי הלא ספציפי של מקרופינוציטוזיס מאפשר לתאים להפנים מגוון רכיבים חוץ-תאיים, כולל חומרים מזינים, חלבונים, אנטיגנים ופתוגנים, באמצעות ספיגה בתפזורת של נוזל חוץ-תאי ומרכיביו1. למרות חשוב עבור הביולוגיה של סוגי תאים רבים, יותר ויותר, מסלול macropinocytosis מתואר לשחק תפקיד חיוני בביולוגיה של הגידול, שבו, באמצעות ספיגה macropinocytic, תאים סרטניים מסוגלים לשרוד ולהתרבות בנוכחות microenvironment מזין מדולדל2,3. ספיגת מקרומולקולות חוץ-תאיות, כולל אלבומין ומטריצה חוץ-תאית, ופסולת תאים נמקיים, מספקת מקור מזין חלופי לייצור ביומסה על ידי יצירת חומצות אמינו, סוכרים, שומנים ונוקלאוטידים באמצעות מקרופינוזה ו-lysosome בתיווך קטבוליזם מטען4,5,6,7,8.
האינדוקציה והרגולציה של מקרופינוציטוזה הם מורכבים ויכולים להשתנות בהתאם להקשר התאי. עד כה זוהו מספר ממריצים של מקרופינוציטוזיס וכוללים ליגנדים, כגון גורם גדילה אפידרמלי (EGF), גורם גדילה נגזר טסיות דם (PDGF), גלקטין-3, ו Wnt3A9,10,11,12,13. בנוסף, תנאי פולחן המחקים את microenvironment הגידול יכול לעורר את ההפעלה של המסלול. גידולי אדנוקרצינומה בלבלב (PDAC) סובלים ממחסור בחומרים מזינים, במיוחד עבור חומצת האמינו גלוטמין, הגורמת הן לתאים סרטניים והן לפיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) להסתמך על מקרופינוציטוזה להישרדות7,13,14,15. יתר על כן, לחצי גידול, כגון היפוקסיה ומתח חמצוני, יכול להפעיל את מסלול ניקוי זה16. בנוסף למשפיעים החיצוניים הרבים שיכולים לגרום למקרופאינוציטוזה, מגוון מסלולים תאיים שולטים בהיווצרות מקרופינום. טרנספורמציה אונקוגנית בתיווך ראס מספיקה כדי ליזום את המכונות המקרופינוציטיות, וסוגי סרטן מרובים מציגים מקרופינוציטוזיס מונחה ראס אונקוגני4,5,9,17. לחלופין, סוג פראי הפעלה ראס מסלולים עצמאיים ראס זוהו כדי להפעיל macropinocytosis בתאים סרטניים ו CAFs10,11,15,18. השימוש במודלים שונים של הפריה חוץ גופית בשילוב עם טיפולים מעכבים הביא לזיהוי של מספר אפננים macropinocytosis, הכוללים מחליפי נתרן-מימן, GTPase Rac1 קטן, זרחן phosphoinositide 3-קינאז (PI3K), קינאז מופעל p21 (Pak), וקינאז חלבון מופעל AMP (AMPK)4,13,15 . עם זאת, בהתחשב בשפע של גורמים ותנאים המתוארים המסדירים macropinocytosis, זה מתקבל על הדעת כי הרבה יותר אפננים וגירויים להישאר לא ידוע. זיהוי של אפננים וגירויים חדשניים יכול להיות קל על ידי הערכה אוטומטית של שפע של תנאים בניסוי אחד. מתודולוגיה זו יכולה לשפוך אור על הגורמים המעורבים בהיווצרות מקרופינום ועשויה לאפשר גילוי של מולקולות קטנות או ביולוגיות חדשניות המכוונות למסלול זה.
כאן, התאמנו את הפרוטוקול שלנו שהוקם בעבר לקביעת היקף המקרופאינוציטוזיס בתאי סרטן במבחנה לפורמט מיקרו-פלטה של 96 well והדמיה וכימות אוטומטיים19,20. פרוטוקול זה מבוסס על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, שהפכה לסטנדרט בתחום לקביעת מקרופינוציטוזיס במבחנה וב- vivo4,5,6,7,9,10,11,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. ניתן להבחין בין מקרופינומיסומים למסלולים אנדוציטיים אחרים באמצעות יכולתם להפנים מקרומולקולות גדולות, כגון דקסטרן במשקל מולקולרי גבוה (כלומר, 70 kDa)2,3,4,20,20,21,22,23. לכן, מקרופינוזומים ניתן להגדיר באמצעות ספיגה של פלואורופור מנוהל מחוץ לתאים שכותרתו 70 kDa dextran. כתוצאה מכך, שלפוחיות מקרופינוציטיות מתבטאות כאשכולות תאיים של פונקטה פלואורסצנטית בגדלים הנעים בין 0.2-5 מיקרומטר. אלה puncta ניתן לדמיין מיקרוסקופי ולאחר מכן לכמת כדי לקבוע את מידת macropinocytosis בתא - "אינדקס macropinocytic".
בפרוטוקול זה מתוארים השלבים החיוניים להדמיית מקרופינומיסמים בתאים דביקים במבחנה על לוחית מיקרו-פלטה בת 96 well וכיסויים באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי (איור 1)." בנוסף, ההוראות להפוך את רכישת התמונה לאוטומטית וכימות האינדקס המקרו-פינוציטי באמצעות קורא לוחות מרובה מצבים הדמיה תא מסופקים. אוטומציה זו מפחיתה את הזמן, העלות והמאמץ בהשוואה לפרוטוקולים שתוארו בעבר19,20. בנוסף, הוא נמנע מרכישה וניתוח הדמיה מוטה בשוגג ובכך משפר את יכולת הרבייה והאמינות. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לסוגי תאים שונים או קוראי לוחות או להיות מנוצלת כדי לקבוע תכונות מקרופינום חלופיות, כגון גודל, מספר ומיקום. השיטה המתוארת להלן מתאימה במיוחד לסינון של תנאי תרבית התא הגורמים macropinocytosis, זיהוי של אפננים חדשים, או אופטימיזציה של ריכוזי סמים של מעכבים ידועים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62828/62828fig01.jpg"> איור 1: סכמטי של הבדיקה האוטומטית כדי לקבוע את 'האינדקס המקרו-פינוציטי' בתאים דבקים. נוצר באמצעות BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62828/62828fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25053CI</td>
			<td>0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent reservoir</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>28-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>155503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter for standard tips</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>159024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories Inc</td>
			<td>4355226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia-free glass cleaner</td>
			<td>Sparkle</td>
			<td>FUN20500CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well high-content screening microplate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055300</td>
			<td>CellCarrier-96 Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>CYT5FW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.08741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - FITC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1822</td>
			<td>Lysine-fixable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - TMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21031CV</td>
			<td>Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 37%</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>RSOF0010-250A</td>
			<td>ACS Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardening fluorescence mounting media</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td>DAKO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Certified ACS Plus, 36.5%&#8211;38.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td>Premium plain glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10013</td>
			<td>8 channels, 0.5&#8211;10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10012&#160;</td>
			<td>12 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td>8 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Pechiney</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Kirkland Signature</td>
			<td>208733</td>
			<td>Stretch-Tite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone isolators</td>
			<td>Grace Bio Labs Inc</td>
			<td>664107</td>
			<td>13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide adapter</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>1220548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0340922C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes

Macropinocytosis הוא מסלול ספיגה לא ספציפי של שלב הנוזלים המאפשר לתאים להפנים מטען חוץ-תאי גדול, כגון חלבונים, פתוגנים ופסולת תאים, באמצעות אנדוציטוזיס בתפזורת. מסלול זה ממלא תפקיד חיוני במגוון תהליכים תאיים, כולל ויסות תגובות חיסוניות וחילוף חומרים של תאים סרטניים. בהתחשב בחשיבות זו בתפקוד הביולוגי, בחינת תנאי תרבית התאים יכולה לספק מידע רב ערך על ידי זיהוי רגולטורים של מסלול זה ואופטימיזציה של תנאים להיות מועסקים בגילוי גישות טיפוליות חדשניות. המחקר מתאר טכניקת הדמיה וניתוח אוטומטית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי וקורא לוחות רב-מצבי הדמיית תאים לכימות המהיר של האינדקס המקרופאינוציטי בתאים דבקים. השיטה האוטומטית מבוססת על ספיגת dextran פלואורסצנטי במשקל מולקולרי גבוה וניתן ליישם אותה על מיקרופלסטיק 96-well כדי להקל על הערכות של תנאים מרובים בניסוי אחד או דגימות קבועות המותקנות על כיסויי זכוכית. גישה זו נועדה למקסם את הרבייה ולהפחית את השונות הניסיונית תוך חיסכון בזמן וחסכוני.

כאשר השלבים וההתאמה של הפרוטוקול המתואר לעיל מתבצעים בהתאם, התוצאות הניסיוניות הסופיות צריכות לספק מידע על אם תנאי תרבית התא הנחקרים או מעכבים לגרום או להפחית macropinocytosis בקו התא של עניין. כדי לחזק את תוקפם של ממצאים אלה, הכללת תנאי הבקרה תאפשר לבחון את התוצאות כדי לקבוע אם הניסוי הושלם בהצל?...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes at JoVE.com

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

בדיקות אוטומטיות באמצעות מיקרו-פלטות מרובות היטב הן גישות מועילות לזיהוי רגולטורים של מסלולים בכך שהן מאפשרות הערכה של מספר רב של תנאים בניסוי אחד. כאן, התאמנו את פרוטוקול ההדמיה והכימות של המקרופינום המבוסס היטב לפורמט מיקרו-לוחית של 96 בארות ומספקים מתאר מקיף לאוטומציה באמצעות קורא לוחות רב-מצבי.

הדמיה וניתוח אוטומטיים לכימות של מקרופינומיסומים המסומנים בפלואורסצנטות

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Macropinocytosis הוא מסלול אנדוציטי שחשוב למגוון תהליכים תאיים, כולל חילוף החומרים של הסרטן. פרוטוקול זה מאפשר לך לכמת את מידת macropinocytosis בתאים במבחנה. האוטומציה נועדה למקסם את רבייה, פרודוקטיביות והפחתת וריאציה ניסיונית.יתר על כן, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת לך לבדוק חזותית את המדגם כדי לקבוע את איכות הניסוי ולהעריך מאפיינים מקרופינום נוספים. מפגינה את ההליך איתי תהיה צ'סקה מארי גלפטה, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. עבור צלחת 24-well עם תבנית כיסוי, להשתמש מלקחיים כדי לאחוז כיסוי יחיד מאמבט האתנול.הקש על כיסוי על הקיר הפנימי של הצלחת כדי להסיר אתנול עודף ומניחים את כיסוי שטוח על החלק התחתון של הבאר. לאחר האתנול מתאדה, לשטוף את כיסוי פעמיים עם DPBS, ולאחר מכן לזרוע את התאים על גבי כיסוי על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של השעיית התא לכל באר. מניחים את התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני עד שמפגש התאים מגיע ל -60 עד 80% ביום שלפני תיוג מקרופינום.יום לפני תיוג מקרופאינום, החלף את המדיה בבארות עם 500 מיקרוליטרים של מדיה ללא סרום שחוממה מראש והנח את התאים באינקובטור למשך 16 עד 24 שעות. עבור פורמט 96-well microplate, להתחיל על ידי העברת ההשעיה התא למאגר ריאגנט 25 מיליליטר. לאחר מכן באמצעות פיפטה רב ערוצית, זרעו 100 מיקרוליטרים של השעיית התא לכל באר של מיקרו-פלטת הקרנה שחורה בעלת תוכן גבוה של 96 באר עם אולפין מחזורי או תחתית זכוכית ברורה אופטית.לדגור על התאים עד מפגש התאים מגיע 60 עד 80% ביום שלפני תיוג מקרופינום. יום לפני תיוג מקרופינום, הסר והשלך את המדיה מכל באר באמצעות מתאם שאיפה רב ערוצי לקבלת טיפים סטנדרטיים המחוברים למשאבת ואקום. לחלופין, ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית.באמצעות מאגר ריאגנט ופיפטה רב-ערוצית, הוסיפו בעדינות 100 מיקרוליטרים של מדיה נטולת סרום שחוממה מראש לכל באר, ולאחר מכן הניחו את התאים באינקובטור התא למשך 16 עד 24 שעות. עבור צלחת 24-well עם פורמט כיסוי, להחליף את המדיה בבארות עם 200 microliters של מדיה ללא סרום עם פלואורופור שכותרתו dextran משקל מולקולרי גבוה ומניחים את התאים באינקובטור התא במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שאפו את המדיה ושטפו בעדינות אך במהירות את התאים חמש פעמים עם PBS קר כקרח באמצעות בקבוק שטיפה מקורר מראש.לחצו בחוזקה את הצלחת ביד במהלך הכביסה כדי לסייע בהסרת אגרגטים דקסטרניים שנדבקים לכיסויים. לאחר מכן, לתקן את התאים על ידי הוספת 350 microliters של 3.7% פורמלדהיד ודגרה במשך 20 דקות, ולאחר מכן לשאוף את פתרון הקיבעון לשטוף את התאים עם PBS פעמיים. מכתימים את הגרעינים ב-350 מיקרוליטרים של DAPI ב-PBS.לאחר 20 דקות, לשאוף את פתרון DAPI ולשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. הדבק מבודדי סיליקון זה לצד זה בשקופית מיקרוסקופ כדי לקבל מרווח זוגי ולוקליזציה הניתנת לשחזור של נקודות הכיסוי הנדרשות לאוטומציית הדמיה. לאחר מכן, עבור כל כיסוי, הוסף טיפה של מדיה הרכבה פלואורסצנטית התקשות על שקופית המיקרוסקופ בתוך המרחב הפתוח של המבודד.הרימו כיסוי באמצעות מלקחיים והסירו PBS עודף על ידי הקשה עדינה על הצד של כיסויים על מגבון ללא מוך. לאחר מכן, הניחו את כיסוי הכיסוי הפוך על טיפת המדיה המתלהקת והקש בעדינות על כיסוי הכיסוי באמצעות מלקחיים סגורים כדי להסיר בועות ממדיית ההרכבה. אחסן את השקופיות בסביבה חשוכה ואפשר למדיה המותקנת להתייבש בטמפרטורת החדר, שבדרך כלל אורכת 16 עד 24 שעות.לפני הדמיה, הסר את המבודדים משוקופית המיקרוסקופ. לאחר שהשקופיות השתוו לטמפרטורת החדר, נקו את כיסויי הכיסוי באמצעות אפליקטור כותנה עם קצה כותנה רטוב עם מנקה זכוכית ללא אמוניה. לאחר מכן, השתמש אפליקטור כותנה נקייה עם קצה כותנה רטוב עם 70% אתנול כדי לנקות את כיסוי ולהשאיר אותו יבש.עבור פורמט 96-well microplate, לאחר שאיפת הבארות כפי שהוכח בעבר, להוסיף 40 microliters של מדיה ללא סרום עם פלואורופור שכותרתו משקל מולקולרי גבוה dextran לבארות, ולאחר מכן לדגור על התאים באינקובטור התא במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, השליכו את המדיה במיקרופלט על ידי הבהוב ידני של הצלחת הפוך לכוס ריקה של חמישה ליטרים, ואז שטפו את התאים ואת המיקרו-לוחית פעמיים על ידי טבילה איטית של הצלחת אנכית בזווית קלה לתוך שני ליטרים מלאה PBS קר כקרח ולאחר מכן השלכת PBS במיקרופלטה על ידי הבהוב הצלחת הפוכה לכוס חמישה ליטר. לאחר שטיפת PBS האחרונה, לתקן את התאים על ידי הוספת 100 microliters של 3.7% פורמלדהיד ב- PBS לכל באר באמצעות מאגר ריאגנט 25 מיליליטר ופיפטה רב ערוצית.לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, הסר את פתרון הקיבעון ושטוף את התאים עם PBS באמצעות טכניקת הטבילה וההבהוב. לאחר שטיפת PBS השנייה, הכתימו את הגרעינים ב-100 מיקרוליטרים של DAPI ב-PBS לבאר. לאחר 20 דקות, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח כפי שהוכח בעבר.הסר כל שאריות PBS על ידי הקשה על המיקרו לוחית הפוכה על מגבון ללא מוך. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS טריים לכל באר באמצעות מאגר ריאגנט של 25 מיליליטר ופיפטה רב-ערוצית. לפני ההדמיה, תן לצלחת להשתוות לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לנגב את צלחת תרבית התא יבש עם לנגב ללא מוך.לחלופין, לאחסן את הצלחת מכוסה הרחק אור בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע אחד. להדמיית מקרופינום אוטומטית, צור פרוטוקול אוטומציה כדי לרכוש את התמונות עם מטרה אווירית פי 40 בערוץ אורך הגל של הפלואורופור וה- DAPI של dextran. לאחר מכן, מטב את הגדרות החשיפה באמצעות מדגם הצפוי להיות ברמה הגבוהה ביותר של macropinocytosis כדי למנוע חשיפה יתר, אשר עלול לגרום לרוויה של האות ואובדן נתוני עוצמה.השתמש בהגדרות מיקוד המאתרות את המדגם בקלות ובעקביות כדי להפיק תמונות באיכות גבוהה. השג תמונות מרובות על פני כל באר או כיסוי כדי להסביר את השונות המדגם ולקבל ייצוג מדויק של המדגם. כדי לקבוע את האינדקס המקרו-פינוציטי, הפחת את הרקע עבור ה- DAPI ותמונת dextran המתאימה על-ידי החלת הפונקציה המתאימה, הנקראת לעתים קרובות פונקציית הכדור המתגלגל.התאם את ההגדרות כך שרעשי הרקע ימוזערו עם אפקט חיסור מינימלי עד ללא השפעת חיסור על ה- DAPI והאות dextran. לאחר מכן, באמצעות שדה עם אות dextran גבוה, לקבוע את הגדרות אות העוצמה, המכונה לעתים קרובות את פונקציית הסף, כדי לבחור את הגרעינים, ולאחר מכן לקבוע את הגדרת אות העוצמה המינימלית הנדרשת כדי לבחור רק את macropinosomes. עבור תמונת dextran, חשב את הפלואורסצנטיות הכוללת בתוך בחירת המקרופאינום שנוצרה או השתמש בבחירה כדי לקבוע את האזור החיובי הכולל עבור dextran.בתמונת DAPI, השתמשו בבחירה כדי לקבוע את מספר הגרעינים בתמונה כדי לשקף את מספר התאים הקיימים. לאחר מכן קבע את האינדקס המקרו-פינוציטי על-ידי חלוקת הפלואורסצנטיות או האזור הכוללים של דקסטרן לפי מספר התאים שנקבעו על-ידי DAPI. בתאי AsPC-1 PDAK, הוספת EGF ב 100 ננוגרם למיליליטר במשך חמש דקות לפני הוספת dextran מפעילה macropinocytosis.יתר על כן, הפעלה אוטוקרינית EGF של macropinocytosis יכול להיות מושרה על ידי חסך גלוטמין במשך 16 עד 24 שעות. תאי MIA PaCa-2 מראים macropinocytosis המרכיב אשר מעוכב על ידי טיפול של 30 דקות עם 75 מיקרומולרי EIPA או טיפול של שעתיים עם 10 micromolar EHop-016. בניסוי תגובת מינון, מדד macropinocytic ירד בהדרגה בריכוזים גבוהים יותר של תרופות של EHop-016 ו EIPA, ובכך לאשר את קיומו של מקרופינוציטוזיס תלוי Rac1 המרכיב.באפשרותך להתאים הליך זה כדי להעריך מקרופינוציטוזה של מטענים מתויגים פלואורסצנטיים אחרים כגון אלבומין. בנוסף, מומלץ להעריך אם ספיגה מקרו-פינוציטית של אלבומין תורמת לכושר התא על ידי ביצוע בדיקות הכדאיות של התא. טכניקה זו הייתה מרכזית לזיהוי של אספקת חומרים מזינים מקרופינוציטים בסרטן ותאי סטרומה והאוטומציה הגדילה מאוד את יכולת בדיקות המצב שלנו.

Research

JoVE Journal

Biology

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

חצי אוטומטיות Heartbeat ניתוח אופטי של לבבות קטנים

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

השרשה של Ferumoxides תווית אדם בתאי גזע mesenchymal ב פגמים סחוס

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

השימוש של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

ויזואליזציה, כימות פוטנציאל בידול Adipogenic תא Mesenchymal עם סמן ספציפי שושלת היוחסין

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...