Name: automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes
Uploaded: 2021-08-24T15:00:00
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이 작품은 NIH/NCI 보조금(R01CA207189, R21CA243701)이 C.C KMO.G.에 지원하여 TRDRP 박사 후 펠로우십 어워드(T30FT0952)의 수상자입니다. BioTek Cytation 5는 NCI 암 센터 지원 보조금 (P30 CA030199)으로부터 재정 지원을받는 샌포드 번햄 프리비스 세포 이미징 코어의 일부입니다. 그림 1-3은 BioRender를 사용하여 만들어졌습니다.

1. 재료 의 준비
<ol><li>20 mg/mL 용액을 얻기 위해 PBS에서 FITC 또는 테트라메틸lr호다민(TMR)으로 표시된 70kDa dextran을 용해하십시오. 알리쿼트를 -20°C에 저장합니다.</li>
	<li>ddH2O에 DAPI를 용해하여 1 mg/mL 용액을 얻습니다. 알리쿼트를 -20°C에 저장합니다. 주의: DAPI는 잠재적인 발암물질이며 신중하게 처리되어야 합니다.</li>
	<li>고정 당일 PBS에서 3.7% ACS 등급 포름알데히드를 준비합니다. 주...

<ol>
	<li>Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+different+cell+types:+similarities+and+differences.">Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences.</a> Membranes. 10 (8), 21 (2020).</li><li>Recouvreux, M. V., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+a+metabolic+adaptation+to+nutrient+stress+in+cancer.">Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Zhang, Y. J., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer:+a+complex+signaling+network.">Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network.</a> Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+deficiency+and+AMPK+activation+promote+nutrient+scavenging+and+anabolism+in+prostate+cancer+cells.">PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells.</a> Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Kamphorst, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+cancer+tumors+are+nutrient+poor+and+tumor+cells+actively+scavenge+extracellular+protein.">Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein.</a> Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).</li><li>Olivares, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-derived+proline+promotes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cell+survival+under+nutrient+limited+conditions.">Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Seguin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3,+a+druggable+vulnerability+for+KRAS-addicted+cancers.">Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).</li><li>Redelman-Sidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Wnt+pathway+drives+macropinocytosis+in+cancer.">The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer.</a> Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).</li><li>Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+canonical+pathway+activates+macropinocytosis+and+lysosomal+degradation+of+extracellular+proteins.">Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).</li><li>Schmees, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+the+PDGF+beta-receptor+promotes+fibroblast+transformation+by+H-RasG12V.">Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).</li><li>Recouvreux, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+regulates+Slug+to+promote+EMT+and+metastasis+in+pancreatic+cancer.">Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+escape+autophagy+inhibition+via+NRF2-induced+macropinocytosis.">Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis.</a> Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Mishra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+epigenetic+alterations+drive+metabolic+and+neuroendocrine+prostate+cancer+reprogramming.">Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinosome+quantitation+assay.">Macropinosome quantitation assay.</a> MethodsX. 1, 36-41 (2014).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li></ol>

실험 및 데이터 수집의 품질은 시약의 품질, 설정 최적화 및 커버립 및 마이크로 플레이트의 청결에 따라 크게 달라집니다. 최종 결과는 복제 간에 최소한의 변형을 제공해야 합니다. 그러나 생물학적 변이는 자연적으로 발생하거나 여러 가지 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 세포 밀도는 세포가 거시세포증 유도제 또는 억제제에 다소 반응하도록 원인이 될 수 있다. 따라서 프로토콜에서 제안된...

macropinocytosis의 비 특이적 내세포 통로는 세포세포 액체와 그 성분의 대량 섭취를 통해 영양분, 단백질, 항원 및 병원균을 포함한 다양한 세포 외 구성 요소를 내면화 할 수 있습니다1. 수많은 세포 모형의 생물학을 위해 중요하더라도, 점점, macropinocytosis 통로는 종양 생물학에 있는 필수적인 역할을 하기 위하여 기술됩니다, 여기서, 대식세포 섭취를 통해, 종양 세포는 영양 고갈된 microenvironment2의 존재에서 생존하고 증식할 수 있습니다2,3. 알부민 및 세포 외 매트릭스및 괴사 세포 파편을 포함한 세포 외 거대 분자의 섭취는 거형 및 리소솜 및 리소성 융합 매개화물 이화 이화증4,5,6,7,8을 통해 아미노산, 설탕, 지질 및 뉴클레오티드를 생성하여 바이오매스 생산을위한 대체 영양소 소스를 제공합니다.
거시피노세포증의 유도 및 조절은 복잡하고 세포 상황에 따라 달라질 수 있습니다. 지금까지, 거형피노세포증의 몇몇 유도체가 확인되고 표피 성장인자(EGF), 혈소판 유래 성장인자(PDGF), galectin-3 및 Wnt3A9,10,11,12,13과 같은 리간드를 포함하고 있다. 또한, 종양 미세 환경을 모방하는 배양 조건은 통로의 활성화를 시작할 수 있다. 췌장 덕트 아데노암종 (PDAC) 종양은 특히 암세포와 암 관련 섬유아세포 (CAFs)를 모두 생존을 위한 매크로 피노세포증에 의존하는 아미노산 글루타민을 위해 영양 박탈입니다7,13,14,15. 더욱이, 저산소증 및 산화 스트레스와 같은 종양 응력은, 이 청소 통로를 활성화할 수 있습니다16. 거시화증을 유도할 수 있는 수많은 외외성 인플루언서 외에도, 다양한 세포내 통로가 거시성 형성을 제어한다. 종양 유발 Ras 매개 변환은 대식세포 기계를 시작하기에 충분하며, 다중 암 유형은 종양genic Ras 구동 구성 매크로 피노세포4,5,9,17를 나타낸다. 대안적으로, 야생형 Ras 활성화 및 Ras 독립적인 통로는 암세포및 CAFs10,11,15,18에서 macropinocytosis를 활성화하기 위하여 확인되었습니다. 억제제 처리와 결합하여 다양한 체외 모델을 사용하면 나트륨 수소 교환기, 소형 GTPase Rac1, 인포이티드 3키나제(PI3K), p21 활성화 키나아제(Pak), AMP 활성화 단백질 키나제(AMPK,15,15)를 포함하는 여러 매크로피노시토시스 변조기를 식별하게 되었습니다. . 그러나, 거시적인 세포토증을 조절하는 기술된 요인 및 조건의 무리를 감안할 때, 더 많은 변조기와 자극이 발견되지 않은 채로 남아 있다는 것을 생각할 수 있습니다. 새로운 변조기와 자극의 식별은 단일 실험에서 다양한 조건의 자동화된 평가에 의해 촉진될 수 있다. 이 방법론은 거형 형성에 관련되되거나 이 통로를 표적으로 하는 새로운 작은 분자 또는 생물학의 발견을 허용할 수 있습니다.
여기에서, 우리는 96 웰 마이크로 플레이트 형식 및 자동화된 화상 진찰 및 정량화19,20에 시험관 내암세포증의 정도를 결정하기 위한 우리의 이전에 확립된 프로토콜을 조정했습니다. 본 프로토콜은 형광 현미경 검사법을 기반으로 하며, 이는 시험관 내 및 생체 내에서 거피노세포증을 결정하는 분야에서 표준이 되었으며, 생체 내에서 4,5,6,7,9,9,10,12,12,15,15,17,18, 19,20,21,22. 매크로피노솜은 고분자 량 dextran(즉, 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23과 같은 대형 거대 분자를 내면화하는 능력을 통해 다른 내세포 경로와 구별될 수 있다. 따라서, 거시피노솜은 세포외 투여형 형광소-표지70 kDa dextran의 섭취를 통해 정의될 수 있다. 그 결과, 매크로피노시성 소포는 0.2-5 μm에 이르는 크기의 형광 문크타의 세포내 클러스터로 나타납니다. 이러한 말장난은 세포내의 대식세포증의 정도를 결정하기 위해 현미경으로 이미지화되고 이후에 정량화될 수 있다- '대식세포 지수'.
이 프로토콜에서, 표준 실험실 장비를 사용하여 96웰 마이크로 플레이트 및 커버립에 체외에서 부착 된 세포에서 대식체를 시각화하는 필수적인 단계가 설명된다 (그림 1). 또한, 셀 이미징 다중 모드 플레이트 판독기를 이용하여 매크로피노사이클 지수의 이미지 수집 및 정량화를 자동화하는 방향이 제공된다. 이 자동화는 이전에 설명한 프로토콜19,20에 비해 시간, 비용 및 노력을 줄여줍니다. 또한 의도하지 않게 편향된 이미징 수집 및 분석을 방지하여 재현성과 신뢰성을 향상시킵니다. 이 방법은 다른 세포 유형 또는 플레이트 판독기에 쉽게 적응하거나 크기, 숫자 및 위치와 같은 대체 매크로 피노솜 특징을 결정하는 데 활용할 수 있습니다. 본 명세서에 기재된 방법은 거시피노세포증을 유도하는 세포 배양 조건의 선별, 새로운 변조기의 식별 또는 알려진 억제제의 약물 농도의 최적화에 특히 적합하다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62828/62828fig01.jpg"> 그림 1: 고동체 세포의 '대식세포 지수'를 결정하는 자동화된 분석의 회로도. BioRender를 사용하여 생성되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62828/62828fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25053CI</td>
			<td>0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent reservoir</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>28-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>155503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter for standard tips</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>159024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories Inc</td>
			<td>4355226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia-free glass cleaner</td>
			<td>Sparkle</td>
			<td>FUN20500CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well high-content screening microplate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055300</td>
			<td>CellCarrier-96 Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>CYT5FW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.08741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - FITC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1822</td>
			<td>Lysine-fixable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - TMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21031CV</td>
			<td>Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 37%</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>RSOF0010-250A</td>
			<td>ACS Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardening fluorescence mounting media</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td>DAKO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Certified ACS Plus, 36.5%&#8211;38.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td>Premium plain glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10013</td>
			<td>8 channels, 0.5&#8211;10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10012&#160;</td>
			<td>12 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td>8 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Pechiney</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Kirkland Signature</td>
			<td>208733</td>
			<td>Stretch-Tite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone isolators</td>
			<td>Grace Bio Labs Inc</td>
			<td>664107</td>
			<td>13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide adapter</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>1220548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0340922C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes

Macropinocytosis는 세포가 대량 내세포증을 통해 단백질, 병원균 및 세포 파편과 같은 큰 세포외 화물을 내면화할 수 있는 비특이적 유체 상 섭취 경로입니다. 이 통로는 면역 반응과 암 세포 대사의 조절을 포함하여 다양한 세포 프로세스에서 필수적인 역할을 합니다. 생물학적 기능에 있는 이 중요성을 감안할 때, 세포 배양 조건을 검토하는 것은 이 통로의 레귤레이터를 확인하고 새로운 치료 접근의 발견에 이용될 조건을 최적화해서 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 연구는 부착 된 세포에서 매크로 피노키틱 인덱스의 신속한 정량화를 위한 표준 실험실 장비 및 세포 이미징 다중 모드 플레이트 리더를 사용하여 자동화 된 이미징 및 분석 기술을 설명합니다. 자동화된 방법은 고분자 형광 dextran의 섭취를 기반으로 하며 유리 커버립에 장착된 하나의 실험 또는 고정 샘플에서 여러 조건의 평가를 용이하게 하기 위해 96웰 마이크로플레이트에 적용할 수 있다. 이 방법은 재현성을 극대화하고 실험적 변화를 줄이는 동시에 시간 절약과 비용 효율적인 방식을 목표로 합니다.

전술한 프로토콜의 단계 및 조정이 그에 따라 따를 때, 최종 실험 결과는 연구된 세포 배양 조건 또는 억제제가 관심 있는 세포주에서 거체피노세포증을 유도하거나 감소시키는지에 대한 정보를 제공해야 한다. 이러한 발견의 타당성을 강화하기 위해 제어 조건을 포함하면 실험이 성공적으로 완료되었는지 여부를 결정할 수 있습니다. 매크로피노세포증 유도 컨트롤은 상대적인 수준의 대시노세?...

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Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

멀티웰 마이크로플레이트를 사용하는 자동화된 해석은 단일 실험에서 다양한 조건의 평가를 허용함으로써 경로 조절기관을 식별하는 데 유리한 접근 방식입니다. 여기에서는 잘 확립된 매크로피노솜 이미징 및 정량화 프로토콜을 96웰 마이크로플레이트 형식으로 조정했으며 멀티 모드 플레이트 판독기를 사용하여 자동화를 위한 포괄적인 개요를 제공합니다.

형광 표기 매크로피노좀의 정량화를 위한 자동화된 이미징 및 분석

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Macropinocytosis는 암 대사를 포함하여 세포 과정의 각종을 위해 중요한 내세포 통로입니다. 이 프로토콜을 사용하면 체외에서 세포에서 거시성 세포증의 범위를 정량화할 수 있습니다. 자동화는 재현성, 생산성 을 극대화하고 실험적 변화를 줄이는 것을 목표로합니다.더욱이, 형광 현미경 검사는 실험적 품질을 결정하고 추가 매크로 피노좀 특성을 평가하기 위해 샘플을 육안으로 검사 할 수 있습니다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 체스카 마리 갈라파테, 내 실험실에서 연구 조수가 될 것입니다. 커버슬립 포맷이 있는 24웰 플레이트의 경우, 집게를 사용하여 에탄올 욕조에서 하나의 커버슬립을 잡습니다.커버슬립을 플레이트 내부 벽에 탭하여 과도한 에탄올을 제거하고 커버슬립을 우물 바닥에 평평하게 놓습니다. 에탄올이 증발한 후, 커버슬립을 DPBS로 두 번 씻은 다음 각 웰에 셀 서스펜션의 500 마이크로리터를 추가하여 커버슬립 위에 세포를 시드합니다. 세포 가 루피놀 라벨링 전날 60~80%에 도달할 때까지 이산화이산화탄소가 5%인 섭씨 37도 세포 인큐베이터에 세포를 배치합니다.거시적 라벨링 전날, 우물의 미디어를 500 마이크로리터의 사전 따뜻하게 된 혈청 없는 매체로 대체하고 세포를 인큐베이터에 16~24시간 동안 배치한다. 96웰 마이크로플레이트 포맷의 경우, 세포 현탁액을 25 밀리리터 시약 저장소로 옮기는 것으로 시작합니다. 그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여, 세포 현탁액의 종자 100 마이크로리터는 광학적으로 맑은 순환 올레핀 또는 유리 바닥으로 검은 색 96-웰 고함량 스크리닝 마이크로 플레이트의 각 웰에 한다.세포 합류가 매크로 피노솜 라벨링 전날 60~80%에 도달할 때까지 세포를 배양한다. 전날 에는 진공 펌프에 부착된 표준 팁에 대한 멀티채널 포부 어댑터를 사용하여 각 우물에서 미디어를 분리, 제거하고 폐기합니다. 또는 멀티채널 파이펫을 사용할 수 있습니다.시약 저장소와 멀티채널 파이펫을 사용하여 미리 따뜻해지는 세럼 이없는 매체 100마이크로리터를 각 웰에 부드럽게 추가한 다음 셀 인큐베이터에 세포를 16~24시간 동안 배치합니다. 커버슬립 포맷이 있는 24웰 플레이트의 경우, 우물내의 미디어를 200마이크로리터의 혈청 프리 미디어로 대체하여 불소로소포레로 분류된 고분자량 디엑스트라넨으로 교체하고 세포를 세포 인큐베이터에 30분 동안 배치한다. 인큐베이션 후, 미리 냉각된 세척병을 사용하여 미디어를 흡인하고 차갑게 PBS로 셀을 5회 부드럽게 씻어냅니다.세차 하는 동안 손으로 접시를 단단히 흔들어 커버립에 달라 지는 데스테인 골재를 단조로합니다. 다음으로, 3.7%의 포름알데히드3.7%의 마이크로리터를 추가하고 20분 동안 배양하여 세포를 수정한 다음 고정 용액을 흡인하고 PBS로 셀을 두 번 세척합니다. PBS에서 DAPI의 350 마이크로리터로 핵을 얼룩지게 합니다.20 분 후, DAPI 용액을 흡인하고 PBS 세 번으로 세포를 씻어. 현미경 슬라이드에 실리콘 분리기를 나란히 부착하여 이미징 자동화에 필요한 커버립의 간격과 재현 가능한 국소화를 얻습니다. 그런 다음 각 커버슬립에 대해, isolator의 열린 공간 내에서 현미경 슬라이드에 경화 형광 장착 매체의 방울을 추가합니다.집게를 사용하여 커버슬립을 선택하고 보풀이 없는 물티슈에 커버립의 측면을 부드럽게 눌러 과도한 PBS를 제거합니다. 다음으로, 커버슬립을 장착 매체의 드롭에 거꾸로 놓고 닫힌 포셉을 사용하여 커버슬립을 부드럽게 탭하여 장착 매체에서 거품을 제거합니다. 슬라이드를 어두운 환경에 저장하고 장착 용지가 실온에서 건조할 수 있도록 하며, 일반적으로 16~24시간이 소요됩니다.이미징하기 전에 현미경 슬라이드에서 개소기를 제거합니다. 슬라이드가 실온에 평형된 후 암모니아가 없는 유리 클리너로 젖은 면 팁 어플리케이터를 사용하여 커버립을 청소하십시오. 그 후, 70%에탄올로 젖은 깨끗한 면 팁 어플리케이터를 사용하여 커버슬립을 청소하고 건조하게 둡니다.96웰 마이크로플레이트 포맷의 경우, 이전에 입증된 우물을 심은 후, 불소엽소표지가 부착된 고분자량 디엑스트라를 첨가한 다음 세포 인큐베이터의 세포를 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 접시를 빈 5리터 비커로 수동으로 뒤집어 마이크로 플레이트에 있는 미디어를 폐기한 다음, 얼음 차가운 PBS로 채워진 두 리터 비커에 약간 각도로 접시를 천천히 잠급하여 셀과 마이크로 플레이트를 두 번 헹구고 거꾸로 접시에 거꾸로 놓고 PBS를 폐기합니다. 마지막 PBS 헹구후, 25 밀리리터 시약 저수지와 멀티 채널 파이펫을 사용하여 PBS에 3.7 %의 포름알데히드의 100 마이크로 리터를 각각 잘 추가하여 세포를 고정합니다.실온에서 20분 간 인큐베이션한 후 고정 용액을 제거하고 잠수 및 플릭 기술을 사용하여 PBS로 셀을 세척합니다. 두 번째 PBS 세척 후, 잘 PBS에서 DAPI의 100 마이크로 리터로 핵을 얼룩. 20 분 후, 이전에 입증 된 것처럼 얼음 차가운 PBS로 세 번 세포를 헹구는다.마이크로 플레이트를 거꾸로 보풀이 없는 와이프에 눌러 잔여 PBS를 제거합니다. 그런 다음 25 밀리리터 시약 저장소와 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각각 100 마이크로 리터의 신선한 PBS를 각 우물에 추가합니다. 이미징하기 전에 플레이트가 실온에 평형화한 다음, 보풀이 없는 물티슈로 세포 배양판을 건조하게 닦아주세요.또는 최대 1주일 동안 빛으로부터 덮인 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오. 자동화된 매크로피노솜 이미징의 경우 자동화 프로토콜을 만들어 dextran 플루오로포어 및 DAPI의 파장 채널에서 40배 공기 목표를 사용하여 이미지를 획득합니다. 다음으로, 과다 노출을 피하기 위해 최고 수준의 대시피노시토시스를 가질 것으로 예상되는 샘플을 사용하여 노출 설정을 최적화하여 신호의 포화와 강도 데이터의 손실을 초래할 수 있습니다.샘플을 쉽고 일관되게 찾아 고품질 이미지를 생성하는 포커스 설정을 사용합니다. 각 웰 또는 커버슬립에서 여러 이미지를 획득하여 샘플 가변성을 고려하고 시료를 정확하게 표현합니다. 거시적 색소 색인을 결정하기 위해, 자주 롤링 볼 함수라고 하는 적절한 기능을 적용하여 DAPI 및 해당 dextran 이미지의 배경을 뺍니다.DAPI 및 dextran 신호에 빼기 효과가 최소화되지 않도록 설정을 조정합니다. 다음으로, 디엑스트라신호가 높은 필드를 사용하여, 자주 임계값 함수라고 불리는 강도 신호 설정을 결정하고 핵을 선택한 다음, 매크로피노좀만 선택하는 데 필요한 최소 강도 신호 설정을 결정한다. dextran 이미지의 경우 생성된 매크로피노솜 선택 내에서 총 형광을 계산하거나 선택을 사용하여 dextran에 대한 총 면적 양성을 결정합니다.DAPI 이미지의 경우, 선택 영역을 사용하여 이미지내의 핵 수를 결정하여 존재하는 세포의 수를 반영한다. 그런 다음 총 dextran 형광 또는 영역을 DAPI에 의해 결정된 세포의 수로 나누어 거시적 색소 색 지수를 결정합니다. AsPC-1 PDAK 세포에서, Dextran을 추가하기 전에 5 분 동안 밀리리터 당 100 나노 그램에 EGF를 추가하면 거체 피노키토시스를 활성화합니다.더욱이, 대식세포증의 자가크림 EGF 활성화는 글루타민 박탈에 의해 유도될 수 있다 16 받는 방24 시간. MIA PaCa-2 세포는 75 마이크로몰라 EIPA또는 10 마이크로몰러 EHop-016을 가진 2 시간 처리로 30 분 처리에 의해 억제되는 구성적인 macropinocytosis를 보여줍니다. 투여량 반응 실험에서, 거시피노세포 지수는 EHop-016 및 EIPA의 높은 약물 농도에서 점차 감소하여 구성적인 Rac1 의존형 매크로피노시토시스의 존재를 확인하였다.이 절차를 조정하여 알부민과 같은 다른 형광 태그화물의 매크로피노세포증을 평가할 수 있습니다. 또한, 알부민의 매크로피노키틱 섭취가 세포 생존성 분석방법을 수행하여 세포 적합성에 기여하는지 평가하는 것이 좋습니다. 이 기술은 암과 기질 세포에 있는 대식세포 양공급의 식별에 중심이 되고 자동화는 우리의 상태 시험 능력을 크게 증가시켰습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

작은 하트의 세미 - 자동 광학 도면 분석

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

연구

생물학

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 Mesenchymal 줄기 세포로 표시

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

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고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

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