Name: automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes
Uploaded: 2021-08-24T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH/NCI (R01CA207189, R21CA243701) a C.C. KMO.G. é um beneficiário do TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). O BioTek Cytation 5 é uma parte do Núcleo de Imagens de Células Prebys de Sanford Burnham, que recebe apoio financeiro do NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). As figuras 1-3 foram criadas utilizando-se o BioRender.

1. Preparação de materiais
<ol><li>Dissolver 70 kDa dextran rotulado com FITC ou tetrametilrhodamina (TMR) em PBS para obter uma solução de 20 mg/mL. Armazene as alíquotas a -20 °C.</li>
	<li>Dissolver o DAPI no ddH2O para obter uma solução de 1 mg/mL. Armazene as alíquotas a -20 °C. ATENÇÃO: O DAPI é um potencial cancerígeno e deve ser tratado com cuidado.</li>
	<li>No dia da fixação, prepare formaldeído fresco de grau ACS de 3,7% na PBS. ATENÇÃO: O formaldeído é um carcinógeno f...

<ol>
	<li>Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+different+cell+types:+similarities+and+differences.">Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences.</a> Membranes. 10 (8), 21 (2020).</li><li>Recouvreux, M. V., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+a+metabolic+adaptation+to+nutrient+stress+in+cancer.">Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Zhang, Y. J., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer:+a+complex+signaling+network.">Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network.</a> Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+deficiency+and+AMPK+activation+promote+nutrient+scavenging+and+anabolism+in+prostate+cancer+cells.">PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells.</a> Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Kamphorst, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+cancer+tumors+are+nutrient+poor+and+tumor+cells+actively+scavenge+extracellular+protein.">Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein.</a> Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).</li><li>Olivares, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-derived+proline+promotes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cell+survival+under+nutrient+limited+conditions.">Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Seguin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3,+a+druggable+vulnerability+for+KRAS-addicted+cancers.">Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).</li><li>Redelman-Sidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Wnt+pathway+drives+macropinocytosis+in+cancer.">The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer.</a> Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).</li><li>Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+canonical+pathway+activates+macropinocytosis+and+lysosomal+degradation+of+extracellular+proteins.">Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).</li><li>Schmees, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+the+PDGF+beta-receptor+promotes+fibroblast+transformation+by+H-RasG12V.">Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).</li><li>Recouvreux, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+regulates+Slug+to+promote+EMT+and+metastasis+in+pancreatic+cancer.">Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+escape+autophagy+inhibition+via+NRF2-induced+macropinocytosis.">Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis.</a> Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Mishra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+epigenetic+alterations+drive+metabolic+and+neuroendocrine+prostate+cancer+reprogramming.">Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinosome+quantitation+assay.">Macropinosome quantitation assay.</a> MethodsX. 1, 36-41 (2014).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li></ol>

A qualidade dos experimentos e a aquisição de dados dependem muito da qualidade dos reagentes, da otimização das configurações e da limpeza das tampas e das microplacões. Os resultados finais devem dar uma variação mínima entre as réplicas; no entanto, as variações biológicas ocorrem naturalmente ou podem ser causadas por uma série de fatores. A densidade celular pode fazer com que as células respondam mais ou menos aos indutores ou inibidores da macropinocitose. É, portanto, crucial aderir à confluênc...

A via endocítica não específica da macropinocistose permite que as células internalizem uma variedade de componentes extracelulares, incluindo nutrientes, proteínas, antígenos e patógenos, através da absorção em massa de fluido extracelular e seus constituintes1. Embora importante para a biologia de numerosos tipos celulares, cada vez mais, a via macropinotose é descrita como um papel essencial na biologia tumoral, onde, através da absorção macropinócítica, as células tumorais são capazes de sobreviver e proliferar na presença de um microambiente empobrecido de nutrientes2,3. A absorção de macromoléculas extracelulares, incluindo albumina e matriz extracelular, e detritos de células necróticas, fornece uma fonte alternativa de nutrientes para a produção de biomassa, criando aminoácidos, açúcares, lipídios e nucleotídeos através de macropinoso e catabolismo de carga mediado por fusão4,5,6,7,8.
A indução e regulação da macropinocitose são complexas e podem variar dependendo do contexto celular. Até agora, vários indutores de macropinocistose foram identificados e incluem ligantes, como fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), galectina-3 e Wnt3A9,10,11,12,13. Além disso, condições de cultivo que imitam o microambiente tumoral podem desencadear a ativação da via. Os tumores de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) são privados de nutrientes, especialmente para a glutamina aminoácido, que faz com que tanto as células cancerígenas quanto os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) dependam da macropinocise para sobreviver7,13,14,15. Além disso, as tensões tumorais, como a hipóxia e o estresse oxidativo, podem ativar essa via de limpeza16. Além dos inúmeros influenciadores extrínsecos que podem induzir a macropinocisse, uma variedade de vias intracelulares controlam a formação macropinosa. A transformação oncogênica mediada por Ras é suficiente para iniciar o maquinário macropinocítico, e vários tipos de câncer exibem macropinocistose constitutiva oncogênica baseada em Ras4,5,9,17. Alternativamente, a ativação ras do tipo selvagem e vias independentes de Ras foram identificadas para ativar a macropinocistose em células cancerosas e CAFs10,11,15,18. O uso de vários modelos in vitro em combinação com tratamentos inibidores resultou na identificação de vários moduladores de macropinocise, que incluem trocadores de sódio-hidrogênio, o pequeno GTPase Rac1, fosfoinositida 3-quinase (PI3K), quinase ativada p21 (Pak) e proteína ativada amp(AMPK)4,13,15 . No entanto, dada a multiplicidade de fatores e condições descritos que regulam a macropinocistose, é concebível que muitos mais moduladores e estímulos permaneçam desconhecidos. A identificação de novos moduladores e estímulos pode ser facilitada pela avaliação automatizada de uma infinidade de condições em um único experimento. Essa metodologia pode lançar luz sobre os fatores envolvidos na formação de macropinossomos e pode permitir a descoberta de novas pequenas moléculas ou biológicas que visam esse caminho.
Aqui, adaptamos nosso protocolo previamente estabelecido para determinar a extensão da macropinocistose em células cancerosas in vitro para um formato de microplacão de 96 poços e imagem automatizada e quantificação19,20. Este protocolo é baseado na microscopia fluorescente, que se tornou um padrão no campo para determinar a macropinocise in vitro e in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. Macropinossomos podem ser distinguidos de outras vias endocíticas através de sua capacidade de internalizar grandes macromoléculas, como dextran de alto peso molecular (ou seja, 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Assim, macropinossomos podem ser definidos através da absorção de fluorforotos extracelularmente rotulados de 70 kDa dextran. Como resultado, as vesículas macropinocísticas se manifestam como aglomerados intracelulares de puncta fluorescente com tamanhos que variam de 0,2-5 μm. Esses punctas podem ser imagens microscopicamente e, posteriormente, quantificadas para determinar a extensão da macropinocise na célula - "o índice macropinocítico".
Neste protocolo, são descritas as etapas essenciais para visualizar macropinossomos em células aderentes in vitro em uma microplacão de 96 poços e são descritas manchas usando equipamentos de laboratório padrão (Figura 1)." Além disso, são fornecidas as instruções para automatizar a aquisição e quantificação da imagem do índice macropinocítico usando um leitor de placas multimodesas de imagem celular. Essa automação reduz o tempo, o custo e o esforço em comparação com nossos protocolos descritos anteriormente19,20. Além disso, evita a aquisição e análise de imagens sem querer tendenciosas e, assim, aumenta a reprodutibilidade e a confiabilidade. Este método pode ser facilmente adaptado a diferentes tipos de células ou leitores de placas ou ser utilizado para determinar características macropinosas alternativas, como tamanho, número e localização. O método aqui descrito é especialmente adequado para a triagem de condições de cultura celular que induzem a macropinocistose, a identificação de novos moduladores ou a otimização de concentrações de medicamentos de inibidores conhecidos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62828/62828fig01.jpg"> Figura 1: Esquema do ensaio automatizado para determinar o "índice macropinolítico" em células aderentes. Criado usando BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62828/62828fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25053CI</td>
			<td>0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent reservoir</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>28-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>155503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter for standard tips</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>159024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories Inc</td>
			<td>4355226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia-free glass cleaner</td>
			<td>Sparkle</td>
			<td>FUN20500CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well high-content screening microplate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055300</td>
			<td>CellCarrier-96 Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>CYT5FW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.08741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - FITC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1822</td>
			<td>Lysine-fixable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - TMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21031CV</td>
			<td>Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 37%</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>RSOF0010-250A</td>
			<td>ACS Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardening fluorescence mounting media</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td>DAKO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Certified ACS Plus, 36.5%&#8211;38.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td>Premium plain glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10013</td>
			<td>8 channels, 0.5&#8211;10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10012&#160;</td>
			<td>12 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td>8 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Pechiney</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Kirkland Signature</td>
			<td>208733</td>
			<td>Stretch-Tite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone isolators</td>
			<td>Grace Bio Labs Inc</td>
			<td>664107</td>
			<td>13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide adapter</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>1220548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0340922C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes

Macropinocistose é uma via de absorção não específica da fase de fluidos que permite que as células internalizem grandes cargas extracelulares, como proteínas, patógenos e detritos celulares, através da endocitose a granel. Esse caminho desempenha um papel essencial em uma variedade de processos celulares, incluindo a regulação de respostas imunes e metabolismo de células cancerosas. Dada essa importância na função biológica, examinar as condições da cultura celular pode fornecer informações valiosas identificando reguladores dessa via e otimizando condições a serem empregadas na descoberta de novas abordagens terapêuticas. O estudo descreve uma técnica automatizada de imagem e análise utilizando equipamentos de laboratório padrão e um leitor de placas multimodestração de imagem celular para a rápida quantificação do índice macropinocítico em células aderentes. O método automatizado baseia-se na absorção de dextran fluorescente de alto peso molecular e pode ser aplicado a microplacões de 96 poços para facilitar avaliações de múltiplas condições em um experimento ou amostras fixas montadas em tampas de vidro. Esta abordagem visa maximizar a reprodutibilidade e reduzir a variação experimental, ao mesmo tempo em que economiza tempo e econômica.

Quando as etapas e o ajuste do protocolo acima descrito são seguidos em conformidade, os resultados experimentais finais devem fornecer informações sobre se as condições de cultura celular estudadas ou inibidores induzem ou reduzem a macropinocistose na linha celular de interesse. Para fortalecer a validade desses achados, a inclusão das condições de controle permitirá a análise dos resultados para determinar se o experimento foi concluído com sucesso. Os controles de indução da macropinocitose fornecerão i...

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Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Ensaios automatizados usando microplatas multi-poços são abordagens vantajosas para identificar reguladores de vias, permitindo a avaliação de uma infinidade de condições em um único experimento. Aqui, adaptamos o bem estabelecido protocolo de imagem e quantificação de macropinoso para um formato de microplacão de 96 poços e fornecemos um contorno abrangente para automação usando um leitor de placas de vários modos.

Imagem e Análise Automatizada para a Quantificação de Macropinoss fluorescentes rotulados

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

A macropinocitose é um caminho endocítico que é importante para uma variedade de processos celulares, incluindo o metabolismo do câncer. Este protocolo permite quantificar a extensão da macropinocitose em células in vitro. A automação visa maximizar a reprodutibilidade, a produtividade e reduzir a variação experimental.Além disso, a microscopia fluorescente permite inspecionar visualmente a amostra para determinar a qualidade experimental e avaliar características macropinosas adicionais. Demonstrando o procedimento comigo estará Cheska Marie Galapate, uma assistente de pesquisa do meu laboratório. Para a placa de 24 poços com formato de deslizamento de cobertura, use fórceps para segurar uma única tampa do banho de etanol.Bata na tampa na parede interna da placa para remover o excesso de etanol e coloque o deslizamento de tampas na parte inferior do poço. Depois que o etanol evaporar, lave a tampa duas vezes com DPBS e, em seguida, semee as células em cima da tampa, adicionando 500 microliters da suspensão celular a cada poço. Coloque as células em uma incubadora celular Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono até que a confluência celular atinja de 60 a 80% no dia anterior à rotulagem macropinosome.Um dia antes da rotulagem macropinosa, substitua a mídia nos poços por 500 microliters de mídia pré-aquecida sem soro e coloque as células na incubadora por 16 a 24 horas. Para o formato de microplacão de 96 poços, comece transferindo a suspensão celular para um reservatório de reagente de 25 mililitros. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, semente 100 microliters da suspensão celular para cada poço de uma microplaca de triagem de 96-bem-falantes com um olefina cíclico opticamente claro ou fundo de vidro.Incubar as células até que a confluência celular atinja de 60 a 80% no dia anterior à rotulagem macropinosa. Um dia antes da rotulagem macropinosa, remova e descarte a mídia de cada poço usando um adaptador de aspiração multicanal para pontas padrão anexadas a uma bomba de vácuo. Alternativamente, uma pipeta multicanal pode ser usada.Usando um reservatório de reagente e pipeta multicanal, adicione suavemente 100 microliters de mídia pré-aquecida sem soro a cada poço e, em seguida, coloque as células na incubadora celular por 16 a 24 horas. Para a placa de 24 poços com formato de deslizamento de cobertura, substitua a mídia nos poços por 200 microliters de mídia livre de soro com dextran de alto peso molecular com rótulo fluorforeiros e coloque as células na incubadora celular por 30 minutos. Após a incubação, aspire a mídia e lave suavemente as células cinco vezes com PBS gelado usando uma garrafa de lavagem pré-resfriada.Agite firmemente a placa à mão durante as lavagens para ajudar na desalojação dos agregados do Dextran que ficam presos às tampas. Em seguida, fixar as células adicionando 350 microlitadores de 3,7% de formaldeído e incubando por 20 minutos, em seguida, aspire a solução de fixação e lave as células com PBS duas vezes. Manche os núcleos com 350 microlitres de DAPI em PBS.Após 20 minutos, aspire a solução DAPI e lave as células com PBS três vezes. Adere aos isoladores de silicone lado a lado em um slide de microscópio para obter mesmo espaçamento e localização reprodutível das tampas necessárias para automação de imagens. Em seguida, para cada deslizamento de cobertura, adicione uma gota de mídia de montagem de fluorescência de endurecimento no slide do microscópio dentro do espaço aberto do isolador.Pegue uma mancha de cobertura usando fórceps e remova o excesso de PBS tocando suavemente o lado das tampas em uma limpeza sem fiapos. Em seguida, coloque o deslizamento de cobertura de cabeça para baixo na queda da mídia de montagem e toque suavemente no deslizamento de cobertura usando fórceps fechados para remover bolhas da mídia de montagem. Armazene os slides em um ambiente escuro e permita que a mídia de montagem seque à temperatura ambiente, normalmente levando de 16 a 24 horas.Antes de fotografar, remova os isoladores do slide do microscópio. Depois que os slides tiverem sido equilibrados à temperatura ambiente, limpe as tampas usando um aplicador de ponta de algodão molhado com limpador de vidro sem amônia. Posteriormente, use um aplicador de ponta de algodão limpo molhado com 70% de etanol para limpar o deslizamento de tampas e deixá-lo seco.Para o formato de microplaca de 96 poços, depois de aspirar os poços como demonstrado anteriormente, adicione 40 microliters de mídia livre de soro com dextran de alto peso molecular rotulado para os poços, em seguida, incubar as células na incubadora celular por 30 minutos. Após a incubação, descarte a mídia na microplaca, movendo manualmente a placa de cabeça para baixo em um béquer vazio de cinco litros, depois enxágue as células e a microplaca duas vezes submergindo lentamente a placa verticalmente em um leve ângulo em um béquer de dois litros cheio de PBS frio e, posteriormente, descartando o PBS na microplaca, movendo a placa de cabeça para baixo no béquer de cinco litros. Após a última lavagem do PBS, fixe as células adicionando 100 microlitrais de 3,7% de formaldeído em PBS a cada poço usando um reservatório de reagente de 25 mililitros e uma pipeta multicanal.Após uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente, remova a solução de fixação e lave as células com PBS usando a técnica de submersão e movimento. Após a segunda lavagem pbs, colorindo os núcleos com 100 microliters de DAPI em PBS por poço. Após 20 minutos, enxágue as células três vezes com PBS gelado, como demonstrado anteriormente.Remova qualquer PBS residual tocando a microplacão de cabeça para baixo em uma limpeza sem fiapos. Em seguida, adicione 100 microliters de PBS frescos a cada poço usando um reservatório de reagente de 25 mililitros e pipeta multicanal. Antes da imagem, deixe a placa equilibrar à temperatura ambiente, em seguida, limpe a placa de cultura celular seca com um lenço sem fiapos.Alternativamente, armazene a placa coberta de luz a quatro graus Celsius por até uma semana. Para imagens macropinosas automatizadas, crie um protocolo de automação para adquirir as imagens com um objetivo de ar 40X no canal de comprimento de onda do dextran fluorophore e DAPI. Em seguida, otimize as configurações de exposição usando uma amostra prevista para ter o mais alto nível de macropinotose para evitar a exposição excessiva, o que pode resultar em saturação do sinal e perda de dados de intensidade.Use configurações de foco que localizem a amostra de forma facilmente e consistente para produzir imagens de alta qualidade. Adquira várias imagens em cada poço ou se encobre para explicar a variabilidade da amostra e obter uma representação precisa da amostra. Para determinar o índice macropinocítico, subtraia o fundo para o DAPI e a imagem correspondente do dextran aplicando a função apropriada, frequentemente chamada de função bola rolando.Ajuste as configurações para que o ruído de fundo seja minimizado com efeito mínimo a sem subtração no sinal DAPI e dextran. Em seguida, usando um campo com sinal de dextran alto, determine as configurações de sinal de intensidade, frequentemente chamadas de função limiar, para selecionar os núcleos e, em seguida, determinar a configuração de sinal de intensidade mínima necessária para selecionar apenas os macropinossomos. Para a imagem do Dextran, calcule a fluorescência total dentro da seleção macropinosa criada ou utilize a seleção para determinar a área total positiva para o dextran.Para a imagem DAPI, use a seleção para determinar o número de núcleos na imagem para refletir o número de células presentes. Em seguida, determine o índice macropinolítico dividindo a fluorescência ou área total do dextran pelo número de células determinadas pelo DAPI. Nas células AsPC-1 PDAK, adicionar EGF a 100 nanogramas por mililitro por cinco minutos antes de adicionar o dextran ativa a macropinocise.Além disso, a ativação autocrina EGF da macropinocitose pode ser induzida pela privação de glutamina por 16 a 24 horas. As células MIA PaCa-2 apresentam macropinocise constitutiva que é inibida por um tratamento de 30 minutos com 75 IEPA micromolar ou um tratamento de duas horas com 10 micromolar EHop-016. Em um experimento de resposta a doses, o índice macropinóctico diminuiu gradualmente em concentrações mais altas de medicamentos de EHop-016 e EIPA, confirmando assim a existência de macropinocise dependente de Rac1 constitutiva.Você pode adaptar este procedimento para avaliar a macropinocise de outras cargas fluorescentes marcadas, como albumina. Além disso, recomenda-se avaliar se a absorção macropinóctica da albumina contribui para o condicionamento celular realizando ensaios de viabilidade celular. Essa técnica tem sido central para a identificação do fornecimento de nutrientes macropinocíticos em células cancerosas e estromais e a automação aumentou muito nossa capacidade de teste de condição.

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