Name: automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes
Uploaded: 2021-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes at JoVE.com

Bu çalışma NIH/NCI hibeleri (R01CA207189, R21CA243701) tarafından C.C. KMO.G.'ye TRDRP Doktora Sonrası Burs Ödülü (T30FT0952) ile desteklenmiştir. BioTek Cytation 5, NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi'nden (P30 CA030199) finansal destek alan Sanford Burnham Prebys Hücre Görüntüleme Çekirdeği'nin bir parçasıdır. Şekil 1-3 BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

1. Malzemelerin hazırlanması
<ol><li>20 mg/mL'lik bir çözelti elde etmek için PBS'de FITC veya tetrametilrhodamin (TMR) ile etiketlenmiş 70 kDa dektranı çözün. Aliquotları -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>1 mg/mL'lik bir çözelti elde etmek için DAPI'yı ddH2O'da çözün. Aliquotları -20 °C'de saklayın. DİkKAT: DAPI potansiyel bir kanserojendir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.</li>
	<li>Sabitleme gününde PBS'de taze %3,7 ACS sınıfı formaldehit hazırlayın. DİkKAT: Fo...

<ol>
	<li>Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+different+cell+types:+similarities+and+differences.">Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences.</a> Membranes. 10 (8), 21 (2020).</li><li>Recouvreux, M. V., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+a+metabolic+adaptation+to+nutrient+stress+in+cancer.">Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Zhang, Y. J., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer:+a+complex+signaling+network.">Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network.</a> Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+deficiency+and+AMPK+activation+promote+nutrient+scavenging+and+anabolism+in+prostate+cancer+cells.">PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells.</a> Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Kamphorst, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+cancer+tumors+are+nutrient+poor+and+tumor+cells+actively+scavenge+extracellular+protein.">Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein.</a> Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).</li><li>Olivares, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-derived+proline+promotes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cell+survival+under+nutrient+limited+conditions.">Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Seguin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3,+a+druggable+vulnerability+for+KRAS-addicted+cancers.">Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).</li><li>Redelman-Sidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Wnt+pathway+drives+macropinocytosis+in+cancer.">The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer.</a> Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).</li><li>Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+canonical+pathway+activates+macropinocytosis+and+lysosomal+degradation+of+extracellular+proteins.">Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).</li><li>Schmees, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+the+PDGF+beta-receptor+promotes+fibroblast+transformation+by+H-RasG12V.">Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).</li><li>Lee, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis.">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).</li><li>Recouvreux, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+regulates+Slug+to+promote+EMT+and+metastasis+in+pancreatic+cancer.">Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2/ARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness.">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+escape+autophagy+inhibition+via+NRF2-induced+macropinocytosis.">Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis.</a> Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Mishra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+epigenetic+alterations+drive+metabolic+and+neuroendocrine+prostate+cancer+reprogramming.">Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells.">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).</li><li>Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinosome+quantitation+assay.">Macropinosome quantitation assay.</a> MethodsX. 1, 36-41 (2014).</li><li>Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors.">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).</li><li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry.">High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).</li></ol>

Deneylerin ve veri toplamanın kalitesi, reaktiflerin kalitesine, ayarların optimizasyonuna ve kapakların ve mikro plakaların temizliğine bağlıdır. Nihai sonuçlar, çoğaltmalar arasında en az varyasyon vermelidir; bununla birlikte, biyolojik varyasyonlar doğal olarak ortaya çıkar veya başka bir şekilde bir dizi faktörden kaynaklanabilir. Hücre yoğunluğu, hücrelerin makropinositoz indükleyicilerine veya inhibitörlerine az çok yanıt vermesine neden olabilir. Bu nedenle, protokolde önerildiği gibi%...

Makropinositozun spesifik olmayan endositotik yolu, hücrelerin hücre dışı sıvı ve bileşenlerinin toplu alımı yoluyla besin maddeleri, proteinler, antijenler ve patojenler de dahil olmak üzere çeşitli hücre dışı bileşenleri içselleştirmelerini sağlar1. Çok sayıda hücre tipinin biyolojisi için önemli olsa da, giderek artan bir şekilde, makropinositoz yolunun, makropinositik alım yoluyla tümör hücrelerinin besin tükenmiş bir mikroçevrenin varlığında hayatta kalabildiği ve çoğalabildiği tümör biyolojisinde önemli bir rol oynadığı açıklanmaktadır2,3. Albümin ve hücre dışı matris ve nekrotik hücre kalıntıları da dahil olmak üzere hücre dışı makromoleküllerin alınması, makropinozom ve lizozom füzyon aracılı kargo katabolizması ile amino asitler, şekerler, lipitler ve nükleotidler oluşturarak biyokütle üretimi için alternatif bir besin kaynağı sağlar4,5,6,7,8.
Makropinositozun indüksiyonu ve regülasyonu karmaşıktır ve hücresel içeriğe bağlı olarak değişebilir. Şimdiye kadar, epidermal büyüme faktörü (EGF), trombosit türevi büyüme faktörü (PDGF), galektin-3 ve Wnt3A9,10,11,12,13 gibi çeşitli makropinositoz indükleyicileri tanımlanmıştır ve ligandları içerir. Ek olarak, tümör mikroçevrimini taklit eden kültleme koşulları yolun aktivasyonunu tetikleyebilir. Pankreas düktal adenokarsinom (PDAC) tümörleri, özellikle hem kanser hücrelerine hem de kanserle ilişkili fibroblastlara (CAL) sağkalım için makropinositoza güvenmesine neden olan amino asit glutamin için besinden yoksundur7,13,14,15. Ayrıca, hipoksi ve oksidatif stres gibi tümör stresleri bu atma yolunu aktive edebilir16. Makropinositozu indükleyebilecek çok sayıda dışsal influencer'a ek olarak, çeşitli hücre içi yollar makropinozom oluşumunu kontrol eder. Makropinosik makineleri başlatmak için onkojenik Ras aracılı dönüşüm yeterlidir ve birden fazla kanser türü onkojenik Ras güdümlü konsitültif makropinositoz4,5,9,17 gösterir. Alternatif olarak, kanser hücrelerinde ve CAL'lerde makropinositozu aktive etmek için vahşi tip Ras aktivasyonu ve Ras-bağımsız yollar tanımlanmıştır10,11,15,18. İnhibitör tedavileri ile birlikte çeşitli in vitro modellerin kullanılması, sodyum-hidrojen eşanjörleri, küçük GTPase Rac1, fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), p21-aktif kinaz (Pak) ve AMP-aktive protein kinaz (AMPK)4,13,15 içeren çeşitli makropinositoz modülatörlerinin tanımlanmasına neden olmuştur. . Bununla birlikte, makropinositozu düzenleyen tarif edilen faktörlerin ve koşulların çokluğu göz önüne alındığında, daha birçok modülatör ve uyaranın keşfedilmemiş kalması düşünülebilir. Yeni modülatörlerin ve uyaranların tanımlanması, tek bir deneyde çok sayıda koşulun otomatik olarak değerlendirilmesi ile kolaylaştırılabilir. Bu metodoloji makropinozom oluşumunda rol oynayan faktörlere ışık tutabilir ve bu yolu hedefleyen yeni küçük moleküllerin veya biyolojiklerin keşfine izin verebilir.
Burada, in vitro kanser hücrelerinde makropinositozun kapsamını belirlemek için daha önce belirlediğimiz protokolümüzü 96 kuyu mikro plaka formatına ve otomatik görüntüleme ve niceleme19,20'ye uyarladık. Bu protokol, makropinositoz in vitro ve in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18 belirlemek için sahada bir standart haline gelen floresan mikroskopiye dayanmaktadır. 19,20,21,22. Makropinozomlar, yüksek moleküler ağırlık dektranı (yani, 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23 gibi büyük makromolekülleri içselleştirme yetenekleri sayesinde diğer endosit yollarından ayırt edilebilir. Böylece, makropinozomlar hücre dışı olarak uygulanan florofor etiketli 70 kDa dektran alımı ile tanımlanabilir. Sonuç olarak, makropinositik vesiküller, 0,2-5 μm arasında değişen boyutlara sahip floresan puncta hücre içi kümeler olarak kendini gösterir. Bu puncta mikroskobik olarak görüntülenebilir ve daha sonra hücredeki makropinositozun kapsamını belirlemek için ölçülebilir - 'makropinositik indeks'.
Bu protokolde, 96 kuyulu bir mikro plaka ve kapaklar üzerinde 96 kuyulu bir mikro plaka ve kapaklar üzerinde yapışan hücre in vitrolarındaki makropinozomları standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak görselleştirmek için gerekli adımlar açıklanmıştır (Şekil 1). Buna ek olarak, bir hücre görüntüleme çok modlu plaka okuyucu kullanarak makropinositik indeksin görüntü alımını ve nicelliğini otomatikleştirmek için talimatlar sağlanır. Bu otomasyon, daha önce açıklanan protokollerimize kıyasla zaman, maliyet ve çabayı azaltır19,20. Buna ek olarak, istemeden önyargılı görüntüleme alımını ve analizini önler ve böylece tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği arttırır. Bu yöntem, farklı hücre türlerine veya plaka okuyucularına kolayca uyarlanabilir veya boyut, sayı ve konum gibi alternatif makropinozom özelliklerini belirlemek için kullanılabilir. Burada açıklanan yöntem özellikle makropinositozu indükleyen hücre kültürü koşullarının taranması, yeni modülatörlerin tanımlanması veya bilinen inhibitörlerin ilaç konsantrasyonlarının optimizasyonu için uygundur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62828/62828fig01.jpg"> Şekil 1: Yandaş hücrelerdeki 'makropinositik indeksi' belirlemek için otomatik tahlil şeması. BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62828/62828fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25053CI</td>
			<td>0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Reagent reservoir</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>28-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Beaker</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-cm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td>CELLSTAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>155503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel aspiration adapter for standard tips</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>159024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories Inc</td>
			<td>4355226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia-free glass cleaner</td>
			<td>Sparkle</td>
			<td>FUN20500CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well high-content screening microplate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055300</td>
			<td>CellCarrier-96 Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>CYT5FW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5.08741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - FITC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1822</td>
			<td>Lysine-fixable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70 kDa - TMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21031CV</td>
			<td>Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 37%</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>RSOF0010-250A</td>
			<td>ACS Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardening fluorescence mounting media</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td>DAKO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Certified ACS Plus, 36.5%&#8211;38.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td>Premium plain glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10013</td>
			<td>8 channels, 0.5&#8211;10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10012&#160;</td>
			<td>12 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td>8 channels, 20&#8211;200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Pechiney</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Kirkland Signature</td>
			<td>208733</td>
			<td>Stretch-Tite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone isolators</td>
			<td>Grace Bio Labs Inc</td>
			<td>664107</td>
			<td>13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide adapter</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>1220548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0340922C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated imaging and analysis for the quantification of fluorescently labeled macropinosomes

Makropinositoz, hücrelerin toplu endositoz yoluyla proteinler, patojenler ve hücre kalıntıları gibi büyük hücre dışı kargoları içselleştirmesine izin veren spesifik olmayan bir sıvı fazlı alım yoludur. Bu yol, bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesi ve kanser hücresi metabolizması da dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerde önemli bir rol oynar. Biyolojik fonksiyondaki bu önem göz önüne alındığında, hücre kültürü koşullarının incelenmesi, bu yolun düzenleyicilerini belirleyerek ve yeni terapötik yaklaşımların keşfinde kullanılacak koşulları optimize ederek değerli bilgiler sağlayabilir. Çalışma, standart laboratuvar ekipmanı kullanılarak otomatik bir görüntüleme ve analiz tekniğini ve yapışık hücrelerdeki makropinositik indeksinin hızlı bir şekilde ölçülmesi için bir hücre görüntüleme çok modlu plaka okuyucusunu tanımlamaktadır. Otomatik yöntem, yüksek moleküler ağırlıklı floresan dektranın alımına dayanır ve cam kapaklara monte edilmiş bir deneyde veya sabit numunelerde birden fazla koşulun değerlendirilmesini kolaylaştırmak için 96 kuyulu mikro plakalara uygulanabilir. Bu yaklaşım, hem zaman kazandıran hem de uygun maliyetli olurken tekrarlanabilirliği en üst düzeye çıkarmayı ve deneysel varyasyonu azaltmayı amaçlamaktadır.

Yukarıda açıklanan protokolün adımları ve ayarlamaları buna göre takip edildiğinde, nihai deneysel sonuçlar, çalışılan hücre kültürü koşullarının veya inhibitörlerinin hücre hattında makropinositozu teşvik edip etmediği veya azaltıp azaltmadığı hakkında bilgi vermelidir. Bu bulguların geçerliliğini güçlendirmek için, kontrol koşullarının dahil edilmesi, deneyin başarıyla tamamlanıp tamamlanmadığını belirlemek için sonuçların incelenmesine izin verecektir. Makropinositoz i...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes at JoVE.com

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Çok kuyulu mikro plakalar kullanan otomatik tahliller, tek bir deneyde çok sayıda koşulun değerlendirilmesine izin vererek yol düzenleyicilerini tanımlamak için avantajlı yaklaşımlardır. Burada, köklü makropinozom görüntüleme ve niceleme protokolünü 96 kuyulu bir mikro plaka formatına uyarladık ve çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak otomasyon için kapsamlı bir anahat sağladık.

Floresan Etiketli Makropinozomların Nicelleştirilmesi için Otomatik Görüntüleme ve Analiz

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Makropinositoz, kanser metabolizması da dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçler için önemli olan endositotik bir yoldur. Bu protokol, in vitro hücrelerde makropinositozun kapsamını ölçmenizi sağlar. Otomasyon, tekrarlanabilirliği, üretkenliği en üst düzeye çıkarmayı ve deneysel varyasyonu azaltmayı amaçlamaktadır.Ayrıca, floresan mikroskopi, deneysel kaliteyi belirlemek ve ek makropinozom özelliklerini değerlendirmek için numuneyi görsel olarak incelemenizi sağlar. Prosedürü benimle birlikte gösteren cheska Marie Galapate, laboratuvarımdan bir araştırma asistanı. Kapak kılıfı formatındaki 24 kuyu plakası için, etanol banyosundan tek bir kapak sapını kavramak için forseps kullanın.Fazla etanol çıkarmak için kapak kılıfını plakanın iç duvarına dokunun ve kapak kapağını kuyunun dibine düz yerleştirin. Etanol buharlaştıktan sonra, kapak kapağını DPBS ile iki kez yıkayın, ardından her kuyuya 500 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyerek kapak kapağının üzerine tohum sürün. Makropinozom etiketlemesinden önceki gün hücre konflüensi % 60 ila% 80'e ulaşana kadar hücreleri% 5 karbondioksitli 37 santigrat derecelik bir hücre inkübatörüne yerleştirin.Makropinozom etiketlemeden bir gün önce, kuyulardaki ortamı önceden ısıtılmış 500 mikrolitre serumsuz ortamla değiştirin ve hücreleri 16 ila 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin. 96 kuyulu mikro plaka formatı için, hücre süspansiyonu 25 mililitrelik bir reaktif rezervuarına aktararak başlayın. Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, optik olarak net siklik olefin veya cam tabanlı siyah 96 kuyulu yüksek içerikli bir tarama mikro plakasının her kuyusuna hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini tohumlar.Makropinozom etiketlemesinden önceki gün hücre konfluensi %60 ila %80'e ulaşana kadar hücreleri kuluçkaya yatırın. Makropinozom etiketlemeden bir gün önce, vakum pompasına bağlı standart uçlar için çok kanallı aspirasyon adaptörü kullanarak ortamı her kuyudan çıkarın ve atın. Alternatif olarak, çok kanallı bir pipet kullanılabilir.Bir reaktif rezervuarı ve çok kanallı pipet kullanarak, her kuyuya 100 mikrolitre önceden ısıtılmış serumsuz ortam ekleyin, ardından hücreleri 16 ila 24 saat boyunca hücre inkübatörüne yerleştirin. Kapaklı formatlı 24 kuyu plakası için kuyulardaki ortamı 200 mikrolitre serumsuz ortamla florofor etiketli yüksek moleküler ağırlıklı dektran ile değiştirin ve hücreleri 30 dakika boyunca hücre inkübatörüne yerleştirin. Kuluçkadan sonra, ortamı aspire edin ve önceden soğutulmuş bir yıkama şişesi kullanarak hücreleri buz gibi soğuk PBS ile beş kez hafifçe ama hızlı bir şekilde yıkayın.Kapak örtülerine yapışan dektran agregalarının yerinden çıkmalarına yardımcı olmak için yıkamalar sırasında plakayı elle sıkıca çalkalayın. Daha sonra, % 3.7 formaldehit 350 mikrolitre ekleyerek ve 20 dakika kuluçkaya yatırarak hücreleri sabitleyin, ardından fiksasyon çözeltisini epire edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. PBS'de çekirdekleri 350 mikrolitre DAPI ile lekele.20 dakika sonra, DAPI çözeltisini aspire edin ve hücreleri PBS üç kez yıkayın. Görüntüleme otomasyonu için gereken kapak örtülerinin aralıklarını ve tekrarlanabilir lokalizasyonunu elde etmek için silikon izolatörleri mikroskop kaydırağı üzerine yan yana yerleştirin. Ardından, her kapak için, izolatörnün açık alanı içindeki mikroskop kaydırasına bir damla sertleştirici floresan montaj ortamı ekleyin.Tiftiksiz bir mendilin üzerindeki kapak uçlarının yanına hafifçe dokunarak, tokmak kullanarak bir kapak kapağı alın ve fazla PBS'yi çıkarın. Ardından, kapak kapağını montaj medyasının damlasına baş aşağı yerleştirin ve kabarcıkları montaj medyasından çıkarmak için kapalı kanat uçlarını kullanarak kapak kapağına hafifçe dokunun. Slaytları karanlık bir ortamda saklayın ve montaj ortamının oda sıcaklığında kurumasını bekleyin, genellikle 16 ila 24 saat sürer.Görüntülemeden önce, izolatörleri mikroskop slaydından çıkarın. Slaytlar oda sıcaklığına dengelendikten sonra, amonyak içermeyen cam temizleyici ile ıslatılmış pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak kapakları temizleyin. Daha sonra, kapak kapağını temizlemek ve kuru bırakmak için% 70 etanol ile ıslatılmış temiz bir pamuk uçlu aplikatör kullanın.96 kuyu mikro plaka formatı için, kuyuları daha önce gösterildiği gibi aspire ettikten sonra, kuyulara florofor etiketli yüksek moleküler ağırlık dektranı ile 40 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin, ardından hücre inkübatöründeki hücreleri 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, plakayı manuel olarak beş litrelik boş bir beş litrelik bir kabın içine baş aşağı kaydırarak mikro plakadaki ortamı atın, ardından plakayı hafif bir açıyla hafifçe batırarak hücreleri ve mikro plakayı iki kez durulayın ve daha sonra plakayı beş litrelik beherin içine baş aşağı kaydırarak PBS'yi mikro plakaya atın. Son PBS durulamadan sonra, 25 mililitrelik reaktif rezervuarı ve çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya PBS'de% 3,7 formaldehit 100 mikrolitre ekleyerek hücreleri sabitlayın.Oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyondan sonra, sabitleme çözeltisini çıkarın ve batırma ve kaydırma tekniğini kullanarak hücreleri PBS ile yıkayın. İkinci PBS yıkamadan sonra, çekirdeği kuyu başına PBS'de 100 mikrolitre DAPI ile lekelenin. 20 dakika sonra, hücreleri daha önce gösterildiği gibi buz gibi PBS ile üç kez durulayın.Mikro plakayı baş aşağı tiftiksiz bir mendile dokunarak kalan PBS'leri çıkarın. Ardından 25 mililitrelik reaktif rezervuarı ve çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 100 mikrolitre taze PBS ekleyin. Görüntülemeden önce, plakanın oda sıcaklığına eşdeğer olmasını bekleyin, ardından hücre kültürü plakasını tüy bırakmayan bir mendille kurulayın.Alternatif olarak, ışıktan uzak kaplanmış plakayı bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Otomatik makropinozom görüntüleme için, dektran floroforunun dalga boyu kanalında 40X hava hedefi olan görüntüleri elde etmek için bir otomasyon protokolü oluşturun. Ardından, aşırı pozlamayı önlemek için en yüksek makropinositoz seviyesine sahip olduğu tahmin edilen bir örnek kullanarak pozlama ayarlarını optimize edin, bu da sinyalin doygunluğuna ve yoğunluk verilerinin kaybına neden olabilir.Yüksek kaliteli görüntüler üretmek için örneği kolayca ve tutarlı bir şekilde konumlandıran odak ayarlarını kullanın. Örnek değişkenliğini hesaba katmak ve numunenin doğru bir gösterimini elde etmek için her kuyuda veya kapak kapağında birden fazla görüntü elde edin. Makropinositik dizini belirlemek için, sık sık yuvarlanan top işlevi olarak adlandırılan uygun işlevi uygulayarak DAPI ve karşılık gelen dektran görüntüsünün arka planını çıkarın.Dapi ve dextran sinyali üzerinde çıkarma etkisi olmadan arka plan gürültüsünün en aza indirilmesi için ayarları yapın. Ardından, yüksek dektran sinyaline sahip bir alan kullanarak, çekirdeği seçmek için sık sık eşik işlevi olarak adlandırılan yoğunluk sinyali ayarlarını belirleyin, ardından yalnızca makropinozomları seçmek için gereken minimum yoğunluk sinyali ayarını belirleyin. Dektran görüntüsü için, oluşturulan makropinozom seçimi içindeki toplam floresan hesaplamayı hesaplayın veya dektran için pozitif olan toplam alanı belirlemek için seçimi kullanın.DAPI görüntüsü için, mevcut hücre sayısını yansıtmak üzere görüntüdeki çekirdek sayısını belirlemek için seçimi kullanın. Daha sonra toplam dektran floresanını veya alanını DAPI tarafından belirlenen hücre sayısına bölerek makropinositik indeksi belirleyin. AsPC-1 PDAK hücrelerinde, dektranı eklemeden önce beş dakika boyunca mililitre başına 100 nanogramda EGF eklemek makropinositozu aktive eder.Ayrıca, makropinositozun otokrin EGF aktivasyonu 16 ila 24 saat boyunca glutamin yoksunluğu ile indüklenebilir. MIA PaCa-2 hücreleri, 75 mikromoler EIPA ile 30 dakikalık bir tedavi veya 10 mikromoler EHop-016 ile iki saatlik bir tedavi ile inhibe edilen konsitutive makropinositoz göstermektedir. Bir doz yanıt deneyinde, makropinositik indeks EHop-016 ve EIPA'nın daha yüksek ilaç konsantrasyonlarında kademeli olarak azaldı ve böylece constitutive Rac1-dependent macropinocytosis'in varlığını doğruladı.Bu prosedürü albümin gibi floresan etiketli diğer kargoların makropinositozlarını değerlendirmek için uyarlayabilirsiniz. Ayrıca albümin makropinositik alımının hücre canlılığı tahlilleri yapılarak hücre zindeliğine katkıda bulunup bulunmadığının değerlendirilmesi önerilir. Bu teknik, kanser ve stromal hücrelerde makropinositik besin kaynağının tanımlanmasında merkezi olmuştur ve otomasyon durum test kapasitemizi büyük ölçüde artırmıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Küçük Kalpler Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analizi

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Ferumoxides implantasyonu Kıkırdak Kusur İnsan Mezenkimal Kök Hücreler Etiketli

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Görselleştirme ve miktar Mezenkimal hücre Adipojenik farklılaşma potansiyeli bir Lineage belirli Marker ile

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...