Name: construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

نشكر ماثيو بلوسر على النقاش والمشورة القيمة. وقد دعم هذا العمل مكتب البحوث البحرية (N00014-16-1-2382) والمؤسسة الوطنية للعلوم (PHY-1915017).

1. وضع العلامات البروتين
<ol><li>السماح NHS-رودامين، 5-HT1A شظايا الغشاء، واحد 7 K MWCO تدور عمود تحلية إلى التوازن في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>حل 1 ملغ من NHS-رودامين في 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO).</li>
	<li>إضافة 5 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم 1 M لزيادة درجة الحموضة من محلول 5-HT...

لقد حددنا خطوتين حاسمتين لنجاح البروتوكول العام: علاج البلازما وترسب الدهون. تنظيف البلازما ينجز شيئين: أولا، فإنه يزيل آثار المواد العضوية من سطح الزجاج. ثانيا، فإنه ينشط سطح الغطاء، مما يسمح لزيادة في wettability كما يزيد hydrophilicity سطح الزجاج62،63. لمس سطح coverlip تن?...

الأغشية الاصطناعية النموذجية هي أدوات قوية في التحقيق في الخصائص والوظائف الأساسية للأغشية الحيوية. الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) هي واحدة من أبرز المنصات لدراسة مجموعة متنوعة من خصائص غشاء البلازما ويمكن هندستها لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المختلفة1،2،3،4،5،6،7،8. ومن الثابت أن غشاء البلازما وتنظيمه يلعبان دورا رئيسيا في العديد من العمليات الخلوية، مثل نقل الإشارات، والالتصاق، وداء الغدد الصماء، والنقل9،10،11،12،13،14،15.
وقد تم تصنيع GUVs باستخدام أساليب مختلفة، بما في ذلك الترطيب لطيف16، تورم الهيدروجيل17، التشكيل الكهربائي18، تقنيات microfluidic19،20،21،22، jetting23، وتبادل المذيبات24،25،26. بسبب التحديات في التعامل مع بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) ، كانت منصات المختبر لمدرستها محدودة. تقدم GUVs منصة مبسطة لدراسة IMPs في بيئة تحاكي بيئتها الأصلية. على الرغم من وجود العديد من النهج لإعادة تشكيل البروتين في GUVs ، تنشأ تحديات من دمج البروتينات مع التوجه الصحيح والحفاظ على وظائف البروتين27.
تتطلب إعادة تشكيل البروتين الأكثر نجاحا في GUVs طريقة تبادل المنظفات؛ الذي ينطوي على solubilizing البروتينات من بيئتها الأصلية من المنظفات، تليها تنقية البروتين، ومن ثم استبدال جزيئات المنظفات مع الدهون من خلال أساليب مختلفة28. في حين أن المنظفات تعمل على تثبيت الهيكل الثالث ل IMPs أثناء التطهير ، فإن ميقات المنظفات هي بيئة غير طبيعية نسبيا لهذه البروتينات ، والتي يتم تثبيتها بشكل أفضل ، خاصة للدراسات الوظيفية ، في ثنائيات الطبقات الدهنية28،29،30. وعلاوة على ذلك، كان من الصعب دمج بروتينات ترانسممبران الوظيفية في طبقة الدهون باستخدام تقنيات تصنيع GUV التقليدية بسبب الحجم، وحساسية هذه البروتينات، وخطوات تبادل المنظفات الإضافية التي ستكون مطلوبة27،31،32،33. استخدام المذيبات العضوية لإزالة المنظفات يسبب تجميع البروتين وإزالة التورينج34. وقد تم تحسين طريقة بوساطة المنظفات واعدة، ومع ذلك، هناك حاجة إلى الحذر لخطوة إزالة المنظفات والتحسين قد تكون هناك حاجة لبروتينات محددة31،35. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحد الطرق التي تستخدم التشكيل الكهربائي من اختيار البروتين وقد لا تكون مناسبة لجميع التراكيب الدهنية وخاصة الدهون المشحونة31,36,37. تقنية أخرى تم استخدامها هي الانصهار الناجم عن الببتيد من الحويصلات الكبيرة unilamellar (LUVs) التي تحتوي على البروتين المطلوب مع GUVs ، على الرغم من أنه وجد أن تكون شاقة ويمكن أن تؤدي إلى إدراج جزيئات غريبة - الببتيدات fusogenic333،38،39. يمكن استخدام الحويصلات العملاقة لغشاء البلازما (GPMVs) ، المشتقة من الخلايا الحية ، للتغلب على بعض هذه القضايا ، ومع ذلك فهي تسمح بالحد الأدنى من التحكم في تكوين الدهون والبروتين الناتج14،40،41. لذلك ، فإن دمج IMPs في طبقة ثنائية الدهون من GUVs باستخدام طريقة تورم الآغروز المعدلة لدينا يقدم طريقة موثوقة لمواصلة فحص هذه البروتينات في بيئة الغشاء42،43،44،45.
الإشارات الخلوية والاتصالات ينطوي على عائلة من البروتينات المعروفة باسم مستقبلات البروتين G مقرونة (GPCRs); GPCRs هي من بين أكبر عائلة من البروتينات وترتبط مع تعديل المزاج والشهية وضغط الدم ووظيفة القلب والأوعية الدموية والتنفس والنوم بين العديد من الوظائف الفسيولوجية الأخرى46. في هذه الدراسة, استخدمنا مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) وهو عضو نموذجي في الأسرة GPCR. 5-HT1AR يمكن العثور عليها في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والأوعية الدموية. فإنه يؤثر على العديد من الوظائف مثل القلب والأوعية الدموية، الجهاز الهضمي، وظائف الغدد الصماء، فضلا عن المشاركة في تنظيم mood47. ينشأ حاجز كبير أمام أبحاث GPCR من بنيتها البرمائية المعقدة ، وتوفر GUVs منصة واعدة للتحقيق في الخصائص المختلفة ذات الاهتمام ، بدءا من وظائف البروتين ، والتفاعلات بين البروتين الدهني والبروتين ، والتفاعلات بين البروتين والبروتين. وقد استخدمت نهج مختلفة لدراسة التفاعلات بين البروتين الدهني مثل الرنين السطحي البلازمون (SPR)48,49، التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)50,51، تراكب الدهون البروتينية (PLO) المقايسة51,52,53,54، قياس الطيف الكتلي الأصلي55، قياس حراري المعايرة الحرارية (ITC)56,57، والليبوسوم الترسيب المقايسة58,59. وقد استخدم مختبرنا نهج GUV المبسط للتحقيق في تأثير التفاعلات بين البروتين الدهني على وظائف البروتين عن طريق تحفيز BODIPY-GTPοS ، الذي يرتبط مع وحدة Giα الفرعية في الحالة النشطة للمستقبلات. ويفك ربطها الفلوروفور الذي ينتج إشارة مضانة يمكن اكتشافها بمرور الوقت45. وعلاوة على ذلك، حققت دراسات مختلفة في التفاعلات بين البروتين الدهني ودور البروتينات في استشعار أو تثبيت انحناء الأغشية60,61، ويمكن أن يكون استخدام نهج GUV الممكن ميزة رئيسية.
يوضح هذا البروتوكول طريقة مباشرة لدمج GPCRs في غشاء GUVs باستخدام نظام agarose هيدروجيل معدل17,42. وعلاوة على ذلك، واستنادا إلى عملنا السابق، يمكن أن تكون طريقتنا مناسبة لIMPs التي يمكن أن تحمل التعرض على المدى القصير إلى 30-40 درجة مئوية. باختصار، ونحن نشر فيلم رقيقة من الآغاروز جنبا إلى جنب مع شظايا الغشاء التي تحتوي على GPCR من الفائدة. بعد هلام هذه الطبقة، ونحن إيداع محلول الدهون فوق agarose والسماح للمذيب لتتبخر. ثم تم تنفيذ الإماهة للنظام مع عازل مائي، مما أدى إلى تشكيل GUVs مع البروتين المدرجة في طبقة ثنائية الدهون.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

كانت التحقيقات القوية في المختبر لهيكل ووظيفة بروتينات الغشاء المتكاملة تحديا بسبب تعقيدات غشاء البلازما والعوامل العديدة التي تؤثر على سلوك البروتين في الخلايا الحية. الحويصلات العملاقة unilamellar (GUVs) هي نظام نموذج محاكاة حيوية وغير قادر للغاية في المختبر للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والغشاء والتحقيق في سلوك البروتين بطريقة دقيقة تعتمد على التحفيز. في هذا البروتوكول, نقدم طريقة غير مكلفة وفعالة لتصنيع GUVs مع مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) متكاملة بشكل ثابت في الغشاء. نحن تصنيع GUVs باستخدام طريقة تورم الهيدروجيل المعدلة; عن طريق إيداع فيلم الدهون على رأس خليط من الآغاروز و 5-HT1AR ومن ثم ترطيب النظام بأكمله، يمكن تشكيل الحويصلات مع موجهة بشكل صحيح والوظيفية 5-HT1AR دمجها في الغشاء. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه GUVs لفحص التفاعلات بين البروتين والأغشية وسلوك التعريب عن طريق المجهر. في نهاية المطاف ، يمكن لهذا البروتوكول تعزيز فهمنا لوظيفة بروتينات الأغشية المتكاملة ، مما يوفر رؤية فسيولوجية عميقة.

تم قياس تركيز البروتين، وتم حساب درجة وضع العلامات كنسبة الضرس بين الصبغة والبروتين لتكون 1:1. من خلال فحص GUVs باستخدام المجهر الكونف البؤري ، تمكنا من تأكيد نجاح تكوين وتكامل البروتين من الحويصلات. وصفت الدهون مع 0.4 مول٪ ATTO 488-DPPE، ووصفت البروتين بشكل مشترك عن طريق تعديل رودامين NHS-ester من الأمي...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

يستخدم هذا البروتوكول تورم الآجاروز كتقنية قوية وقابلة للتعميم لدمج بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) في الحويصلات الدهنية unilamellar العملاقة (GUVs) ، كما هو موضح هنا لإعادة تشكيل بروتين مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) ، وهي واحدة من فئات مستقبلات G ذات الأهمية الدوائية المقترنة بالبروتين.

بناء نموذج الأغشية الدهنية دمج G-البروتين إلى جانب المستقبلات (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

دراسة بروتينات الأغشية المتكاملة في بيئتها الأصلية كانت تحديا بسبب تعقيد غشاء البلازما. الحويصلات الدهنية unilamellar العملاقة، أو GUVs، هي واحدة من أبرز المنصات لدراسة خصائص الميمبران الحيوي، ويمكن هندستها لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المختلفة. يصف هذا البروتوكول طريقة لتصنيع البروتين أدرجت GUVs على أساس التأسيس التلقائي، بعد تورم الهيدروجيل. الطرق التقليدية لتصنيع GUVs ليست قابلة للتعميم لدمج بروتين الغشاء المتكامل. وغالبا ما تكون هذه الأساليب منخفضة الغلة ومعقدة منهجيا ومخصصة، ولا تنطبق على فئات واسعة من البروتينات. من ناحية أخرى، يمثل هذا البروتوكول طريقة مرنة وقوية وبسيطة لدمج بروتينات الأغشية المتكاملة الوظيفية في GUVs.We أنجز هذا من خلال إعداد سقالة هيدروجيل، تحتوي على البروتين، وإيداع طبقة رقيقة من الدهون فوقه. في المثال المعروض هنا ، أدرجنا مستقبلات G المقترنة بالبروتين ، أو GPCR ، في الإماهة GUVs.Upon للنظام بأكمله ، برعم GUVs من سطح الهيدروجيل مع الغشاء الذي يحتوي على GPCRs.Allow موجهة بشكل صحيح جميع الكواشف أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة. خلال هذا الوقت، تنظيف زلات الغطاء عن طريق وضعها في الميثانول و sonicating لمدة 30 دقيقة في 40

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Unit 1

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

منظمة حلزونية من الدم التخثر عامل الثامن على الدهون الأنابيب النانومترية

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

استخدام تسمية خالية أجهزة الاستشعار البصرية لكشف التحوير من قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات اقترن

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

البناء وتوصيف من طية تفاعلات الاحيائية الرواية الصوتية

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

إعداد الأغشية ضوء استجابة من قبل التطعيم سطح الجامع وعملية Postmodification

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

غشاء حيوي تلفيق من المذيبات بمساعدة الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

بناء وحدات صفائح هيدروجيل لتحجيم الكلي Micropatterned 3D الخلوية العمارة

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

المغنطيسى إلى جانب التصوير المحمولة وتحليل لتشخيص الأمراض

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

توليف الهلاميات المائية مع خصائص المضادة للحشف والأغشية لتنقية المياه

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

إنشاء وتركيب مقياس حيوي مفاعل حيوي متعدد الطحالب مع درجة الحرارة والضوء ودرجة الحموضة رصد اختبارات النمو الحركية

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...