Name: construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Vi takker Matthew Blosser for værdifuld diskussion og rådgivning. Dette arbejde blev støttet af Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) og National Science Foundation (PHY-1915017).

1. Proteinmærkning
<ol><li>Tillad NHS-Rhodamine, 5-HT1A membranfragmenter og en 7 K MWCO spin afsaltningskolonne at ekvilibrere ved stuetemperatur.</li>
	<li>1 mg NHS-rhodamin opløses i 100 μL dimethylsulfoxid (DMSO).</li>
	<li>Der tilsættes 5 μL 1 M natriumbicarbonatopløsning for at øge pH-5-HT1AR-opløsningen til pH 8.</li>
	<li>Der tilsættes 3,66 μL af NHS-rhodaminopløsningen til 50 μL af 5-HT1AR-opløsningen og pipetten forsigtigt op og ned i et mikrocentrifugerør. BE...

Vi har identificeret to trin, der er afgørende for succesen af den samlede protokol: plasmabehandling og lipidaflejring. Plasmarensning udretter to ting: For det første fjerner det spor af organisk materiale fra glasoverfladen; For det andet aktiverer den coverlip-overfladen, hvilket giver mulighed for en stigning i vådbarheden, da glasoverfladen hydrofilitet øges62,63. Berøring af dækslet overflade efter plasmarensning vil inaktivere og forurene den ultrar...

Syntetiske modelmembraner er kraftfulde værktøjer i undersøgelsen af biomembranernes grundlæggende egenskaber og funktioner. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er en af de mest fremtrædende platforme til at studere en række plasmamembranegenskaber og kan konstrueres til at efterligne forskellige fysiologiske forhold1,2,3,4,5,6,7,8. Det er veletableret, at plasmamembranen og dens organisation spiller en central rolle i en lang række cellulære processer, såsom signaltransduktion, vedhæftning, endokytose og transport9,10,11,12,13,14,15.
GUVs er blevet fremstillet ved hjælp af forskellige metoder, herunder blid hydrering16, hydrogel hævelse17, elektroformation18, mikrofluidiske teknikker19,20,21,22, jetting23, og opløsningsmiddel udveksling24,25,26. På grund af udfordringer med håndtering af integrerede membranproteiner (IMP) har in vitro-platforme til at studere dem været begrænsede. GUV'er præsenterer en forenklet platform til at studere IMP i et miljø, der efterligner deres oprindelige miljø. Selv om der har været flere tilgange til proteinkonstitution i GUV'er, opstår der udfordringer ved at inkorporere proteiner med den korrekte orientering og opretholde proteinfunktionalitet27.
Den mest vellykkede proteinkonkonstitution i GUV'er kræver vaskemiddeludvekslingsmetoden; som indebærer at opløse proteinerne fra deres oprindelige miljø ved rengøringsmidler, efterfulgt af proteinrensning, og derefter erstatte vaskemiddelmolekylerne med lipider gennem forskellige metoder28. Mens vaskemidler tjener til at stabilisere den tertiære struktur af IMP under rensning, vaskemiddel micelles er et relativt unaturligt miljø for disse proteiner, som er bedre stabiliseret, især for funktionelle undersøgelser, i lipid bilayers28,29,30. Desuden har det været vanskeligt at inkorporere funktionelle transmembranproteiner i lipid-bilayeren ved hjælp af traditionelle GUV-fremstillingsteknikker på grund af størrelsen, delikatessen af disse proteiner og de ekstra vaskemiddeludvekslingstrin, der ville være nødvendige27,31,32,33. Brugen af organisk opløsningsmiddel til at fjerne rengøringsmidler forårsager protein aggregering og denaturering34. En forbedret vaskemiddelmedieret metode har været lovende, men forsigtighed er nødvendig for vaskemiddel fjernelse trin og optimering kan være nødvendig for specifikke proteiner31,35. Derudover, metoder, der udnytter elektroformation kunne begrænse valget af protein og kan ikke være egnet til alle lipid kompositioner særligt ladede lipider31,36,37. En anden teknik, der er blevet brugt, er peptid-induceret fusion af store unilamellar vesikler (LUVs), der indeholder det ønskede protein med GUVs, selv om det viste sig at være besværligt og kan føre til indsættelse af udenlandske molekyler-fusogenic peptider33,38,39. Giant plasmamembran vesikler (GPMVs), som er afledt af levende celler, kan bruges til at overvinde nogle af disse spørgsmål, men de giver minimal kontrol af den resulterende lipid og protein sammensætning14,40,41. Derfor udgør integrationen af IMP i bilipidlaget af GUV'er ved hjælp af vores modificerede agarose hævelsesmetode en pålidelig metode til yderligere at undersøge disse proteiner i membranmiljøet42,43,44,45.
Cellulær signalering og kommunikation involverer en familie af proteiner kendt som G protein-koblede receptorer (GPCRs); GPCR er blandt de største familie af proteiner og er forbundet med modulerende humør, appetit, blodtryk, hjerte-kar-funktion, åndedræt, og søvn blandt mange andre fysiologiske funktioner46. I denne undersøgelse, Vi brugte human serotonin 1A receptor (5-HT1AR), som er et prototypisk medlem af GPCR familien. 5-HT1AR kan findes i centralnervesystemet (CNS) og blodkar; det påvirker mange funktioner såsom hjerte-kar-, gastrointestinale, endokrine funktioner, samt deltager i reguleringen af mood47. En stor barriere for GPCR forskning stammer fra deres komplekse amfifile struktur, og GUVs præsentere en lovende platform for undersøgelsen af forskellige egenskaber af interesse, lige fra protein funktionalitet, lipid-protein interaktioner, og protein-protein interaktioner. Forskellige tilgange er blevet brugt til at studere lipid-protein interaktioner såsom overflade plasmon resonans (SPR)48,49, nuklear magnetisk resonans spektroskopi (NMR)50,51, protein lipid overlay (PLO) assay51,52,53,54, native massespektrometri55, isotermisk titrering calorimetri (ITC) 56,57, og liposom sedimenteringsanalyse58,59. Vores laboratorium har brugt den forenklede GUV-tilgang til at undersøge effekten af lipid-protein interaktioner på proteinfunktionalitet ved at indkapsle BODIPY-GTPγS, som binder sig til Giα-underenheden i receptorens aktive tilstand. Deres bindende løsner fluorophoren, der producerer et fluorescenssignal, der kunne detekteres over tid45. Desuden undersøgte forskellige undersøgelser Lipid-protein interaktioner og proteiners rolle i at mærke eller stabilisere membrankrumningen60,61, og ved hjælp af en mulig GUV-tilgang kunne det være en vigtig fordel.
Denne protokol viser en enkel metode til at indarbejde GPCR'er i membranen af GUV'er ved hjælp af et modificeret agarose hydrogelsystem17,42. Desuden kan vores metode på baggrund af vores tidligere arbejde være velegnet til IMP, der kan bære kortvarig eksponering for 30-40 °C. Kort, vi sprede en tynd film af agarose kombineret med membran fragmenter, der indeholder GPCR af interesse. Efter gelering af dette lag deponerer vi en lipidopløsning oven på agarose og tillader opløsningsmidlet at fordampe. Rehydrering af systemet blev derefter udført med en vandig buffer, hvilket resulterede i dannelsen af GUVs med protein indarbejdet i lipid bilayer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

Robuste in vitro-undersøgelser af strukturen og funktionen af integrerede membranproteiner har været en udfordring på grund af plasmamembranens kompleksitet og de mange faktorer, der påvirker proteinadfærden i levende celler. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er et biomimetisk og meget tunable in vitro-modelsystem til undersøgelse af protein-membraninteraktioner og sondering af proteinadfærd på en præcis, stimulusafhængig måde. I denne protokol præsenterer vi en billig og effektiv metode til fremstilling af GUVs med den menneskelige serotonin 1A receptor (5-HT1AR) stabilt integreret i membranen. Vi fremstiller GUVs ved hjælp af en modificeret hydrogel hævelse metode; ved at deponere en lipidfilm oven på en blanding af agarose og 5-HT1AR og derefter fugte hele systemet, kan vesikler dannes med korrekt orienteret og funktionel 5-HT1AR indarbejdet i membranen. Disse GUV'er kan derefter bruges til at undersøge protein-membran interaktioner og lokalisering adfærd via mikroskopi. I sidste ende kan denne protokol fremme vores forståelse af funktionaliteten af integrerede membranproteiner, hvilket giver dyb fysiologisk indsigt.

Koncentrationen af protein blev målt, og mærkningsgraden blev beregnet som molarforholdet mellem farvestoffet og proteinet til 1:1. Ved at undersøge GUV'erne ved hjælp af konfokal mikroskopi var vi i stand til at bekræfte vellykket dannelse og proteinintegration af vesiklerne. Lipiderne blev mærket med 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, og proteinet blev kovalent mærket via rhodamin NHS-ester modifikation af primære aminer. Figur 2a og figur 2b viser en proteininst...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

Denne protokol udnytter agarose hævelse som en kraftfuld og generaliserbar teknik til at indarbejde integrerede membranproteiner (IMP) i gigantiske unilamellar lipid vesikler (GUVs), som beskrevet her for rekonstitution af human 1A serotonin receptor protein (5-HT1AR), en af klasserne af farmakologisk vigtige G protein-koblede receptorer.

Konstruktion af Model Lipid Membraner indarbejde G-protein koblede receptorer (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

At studere integrerede membranproteiner i deres oprindelige miljø har været en udfordring på grund af plasmamembranens kompleksitet. Giant unilamellar lipid vesikler, eller GUVs, er en af de mest fremtrædende platforme til at studere biomembrane egenskaber, og de kan manipuleres til at efterligne forskellige fysiologiske forhold. Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af protein indarbejdet GUVs baseret på spontan inkorporering, efter hydrogel hævelse. Traditionelle metoder til fremstilling af GUV'er kan ikke generalisers for integreret membranproteininkorporering. Disse metoder er ofte lavt udbytte, metodisk komplekse og ad hoc, ikke gælder for brede klasser af proteiner. På den anden side repræsenterer denne protokol en fleksibel, robust og enkel metode til at indarbejde funktionelle integrerede membranproteiner i GUVs.Vi opnåede dette ved at forberede et hydrogel stillads, der indeholder proteinet, og deponere et tyndt lag lipid oven på det. I det eksempel, der præsenteres her, vi indarbejdet G protein-koblet receptor, eller GPCR, i GUVs.Upon rehydrering af hele systemet, GUVs bud ud af overfladen af hydrogel med membranen indeholder korrekt orienteret GPCRs.Tillad alle reagenser til at komme til stuetemperatur. I løbet af denne tid skal dækslet glide ved at placere dem i methanol og sonikering i 30 minutter ved 40

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Unit 1

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Tandhjulsgear Organization of Blood koagulationsfaktor VIII på Lipid Nanorør

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Brug af Label-fri Optiske Biosensors Detect Modulation af kalium kanaler af G-protein koblede receptorer

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Konstruktion og karakterisering af en roman Vocal Fold bioreaktor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Udarbejdelse af Light-responsive Membraner med et samlet overfladeareal Pode og Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication med opløsningsmidlet-assisteret lipiddobbeltlag (Salb) Metode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Konstruktion af Modular Hydrogel Leverandørbrugsanvisning på mikromønstrede Macro-skaleret 3D Cellular Arkitektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetisk Levitation Sammen med Portable Imaging og Analyse for sygdomsdiagnostik

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Syntese af Hydrogeler med antitilsmudsningsegenskaber som membraner til vandrensning

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

Konstruktion og opsætning af en Bench-skala Algal Photosynthetic Bioreactor med temperatur, lys og pH-overvågning for kinetiske væksttest

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...