Name: construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Wij danken Matthew Blosser voor de waardevolle discussie en het advies. Dit werk werd ondersteund door het Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) en de National Science Foundation (PHY-1915017).

1. Eiwitetikettering
<ol><li>Laat NHS-Rhodamine, 5-HT1A membraanfragmenten en één 7 K MWCO spin ontzoutingskolom bij kamertemperatuur in evenwicht brengen.</li>
	<li>Los 1 mg NHS-rhodamine op in 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO).</li>
	<li>Voeg 5 μL natriumbicarbonaatoplossing van 1 M toe om de pH van de 5-HT1AR-oplossing te verhogen tot pH 8.</li>
	<li>Voeg 3,66 μL van de NHS-rhodamine-oplossing toe aan 50 μL van de 5-HT1AR-oplossing en pipetteer voorzichtig op en neer in een micro...

We hebben twee stappen geïdentificeerd die van cruciaal belang zijn voor het succes van het algemene protocol: plasmabehandeling en lipideafzetting. Plasmareiniging van de coverslips is essentieel om ervoor te zorgen dat er voldoende dekking en hechting van de agarose hydrogel op de glazen afdekplaat is. Plasmareiniging bereikt twee dingen: ten eerste verwijdert het sporen van organisch materiaal van het glasoppervlak; ten tweede activeert het het dekvloeroppervlak, waardoor de bevochtigbaarheid toeneemt naarmate de hyd...

Synthetische modelmembranen zijn krachtige hulpmiddelen bij het onderzoeken van de fundamentele eigenschappen en functies van biomembranen. Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) zijn een van de meest prominente platforms om een verscheidenheid aan plasmamembraaneigenschappen te bestuderen en kunnen worden ontworpen om verschillende fysiologische omstandigheden na te bootsen1,2,3,4,5,6,7,8. Het is algemeen bekend dat het plasmamembraan en zijn organisatie een sleutelrol spelen in een groot aantal cellulaire processen, zoals signaaltransductie, adhesie, endocytose en transport9,10,11,12,13,14,15.
GUV's zijn vervaardigd met behulp van verschillende methoden, waaronder zachte hydratatie16, hydrogel zwelling17, elektroformatie18, microfluïdische technieken19,20,21,22, jetting23 en oplosmiddeluitwisseling24,25,26. Vanwege uitdagingen bij het omgaan met integrale membraaneiwitten (GMP's), zijn in vitro platforms om ze te bestuderen beperkt. GUV's bieden een vereenvoudigd platform voor het bestuderen van GMP's in een omgeving die hun oorspronkelijke omgeving nabootst. Hoewel er verschillende benaderingen zijn geweest voor eiwitreconstitutie in GUV's, ontstaan er uitdagingen door het opnemen van eiwitten met de juiste oriëntatie en het behoud van eiwitfunctionaliteit27.
De meest succesvolle eiwitreconstitutie in GUV's vereist de detergentenuitwisselingsmethode; waarbij de eiwitten uit hun oorspronkelijke omgeving worden opgelost door detergentia, gevolgd door eiwitzuivering en vervolgens de wasmiddelmoleculen via verschillende methoden worden vervangen door lipiden28. Terwijl detergentia dienen om de tertiaire structuur van GMP's tijdens de zuivering te stabiliseren, zijn wasmiddelmicellen een relatief onnatuurlijke omgeving voor deze eiwitten, die beter gestabiliseerd zijn, met name voor functionele studies, in lipide bilayers28,29,30. Bovendien was het opnemen van functionele transmembraaneiwitten in de lipide bilayer met behulp van traditionele GUV-fabricagetechnieken moeilijk vanwege de grootte, de delicatesse van deze eiwitten en de extra reinigingsmiddeluitwisselingsstappen die nodig zouden zijn27,31,32,33. Het gebruik van organisch oplosmiddel om reinigingsmiddelen te verwijderen veroorzaakt eiwitaggregatie en denaturering34. Een verbeterde detergent-gemedieerde methode is veelbelovend, maar voorzichtigheid is geboden voor de reinigingsmiddelverwijderingsstap en optimalisatie kan nodig zijn voor specifieke eiwitten31,35. Bovendien kunnen methoden die elektroformatie gebruiken de keuze van eiwitten beperken en mogelijk niet geschikt zijn voor alle lipidesamenstellingen, met name geladen lipiden31,36,37. Een andere techniek die is gebruikt, is peptide-geïnduceerde fusie van grote unilamellaire blaasjes (LUVs) die het gewenste eiwit met GUVs bevatten, hoewel het bewerkelijk bleek te zijn en kan leiden tot het inbrengen van vreemde moleculen - de fusogene peptiden33,38,39. Gigantische plasmamembraanblaasjes (GPMV's), die zijn afgeleid van levende cellen, kunnen worden gebruikt om sommige van deze problemen te overwinnen, maar ze maken minimale controle mogelijk over de resulterende lipide- en eiwitsamenstelling14,40,41. Daarom biedt de integratie van GMP's in de bilipide laag van GUVs met behulp van onze gemodificeerde agarose-zwellingsmethode een betrouwbare methode om deze eiwitten in de membraanomgeving verder te onderzoeken42,43,44,45.
Cellulaire signalering en communicatie omvat een familie van eiwitten die bekend staat als G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's); GPCR's behoren tot de grootste familie van eiwitten en worden geassocieerd met het moduleren van stemming, eetlust, bloeddruk, cardiovasculaire functie, ademhaling en slaap onder vele andere fysiologische functies46. In deze studie gebruikten we de menselijke serotonine 1A-receptor (5-HT1AR), een prototypisch lid van de GPCR-familie. 5-HT1AR kan worden gevonden in het centrale zenuwstelsel (CZS) en bloedvaten; het beïnvloedt tal van functies zoals cardiovasculaire, gastro-intestinale, endocriene functies, evenals deelname aan de regulatie van mood47. Een grote barrière voor GPCR-onderzoek komt voort uit hun complexe amfifiele structuur en GUVs bieden een veelbelovend platform voor het onderzoek naar verschillende interessante eigenschappen, variërend van eiwitfunctionaliteit, lipide-eiwitinteracties en eiwit-eiwitinteracties. Verschillende benaderingen zijn gebruikt om lipide-eiwitinteracties te bestuderen, zoals oppervlakteplasmonresonantie (SPR)48,49, nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (NMR)50,51, eiwitlipidenoverlay (PLO) assay51,52,53,54, inheemse massaspectrometrie55, isotherme titratiecalorimetrie (ITC)56,57 en liposoom sedimentatietest58,59. Ons laboratorium heeft de vereenvoudigde GUV-benadering gebruikt om het effect van lipide-eiwitinteracties op de eiwitfunctionaliteit te onderzoeken door BODIPY-GTPγS in te kapselen, dat bindt met de Giα-subeenheid in de actieve toestand van de receptor. Hun binding maakt de fluorofoor los en produceert een fluorescentiesignaal dat in de loop van de tijd kan worden gedetecteerd45. Bovendien onderzochten verschillende studies lipide-eiwitinteracties en de rol van eiwitten bij het detecteren of stabiliseren van membraankromming60,61, en het gebruik van een haalbare GUV-aanpak zou een belangrijk voordeel kunnen zijn.
Dit protocol demonstreert een eenvoudige methode om GPCR's op te nemen in het membraan van GUVs met behulp van een gemodificeerd agarose hydrogel-systeem17,42. Bovendien zou onze methode, op basis van ons eerdere werk, geschikt kunnen zijn voor GMP's die kortdurende blootstelling aan 30-40 °C kunnen verdragen. Kortom, we verspreiden een dunne film van agarose in combinatie met membraanfragmenten die de GPCR van belang bevatten. Na het doseren van deze laag zetten we een lipideoplossing af bovenop de agarose en laten we het oplosmiddel verdampen. Rehydratatie van het systeem werd vervolgens uitgevoerd met een waterige buffer, wat resulteerde in de vorming van GUVs met eiwit opgenomen in de lipide bilayer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

Robuust in vitro onderzoek naar de structuur en functie van integrale membraaneiwitten is een uitdaging geweest vanwege de complexiteit van het plasmamembraan en de vele factoren die het eiwitgedrag in levende cellen beïnvloeden. Giant unilamellar blaasjes (GUVs) zijn een biomimetisch en zeer afstembaar in vitro modelsysteem voor het onderzoeken van eiwit-membraaninteracties en het onderzoeken van eiwitgedrag op een precieze, stimulusafhankelijke manier. In dit protocol presenteren we een goedkope en effectieve methode voor het fabriceren van GUVs met de menselijke serotonine 1A-receptor (5-HT1AR) stabiel geïntegreerd in het membraan. We fabriceren GUVs met behulp van een gemodificeerde hydrogel-zwellingsmethode; door een lipidefilm af te zetten bovenop een mengsel van agarose en 5-HT1AR en vervolgens het hele systeem te hydrateren, kunnen blaasjes worden gevormd met goed georiënteerde en functionele 5-HT1AR opgenomen in het membraan. Deze GUVs kunnen vervolgens worden gebruikt om eiwit-membraaninteracties en lokalisatiegedrag via microscopie te onderzoeken. Uiteindelijk kan dit protocol ons begrip van de functionaliteit van integrale membraaneiwitten bevorderen, wat diepgaande fysiologische inzichten oplevert.

De concentratie van eiwit werd gemeten en de mate van etikettering werd berekend als de molaire verhouding tussen de kleurstof en het eiwit op 1:1. Door de GUVs te onderzoeken met behulp van confocale microscopie, konden we een succesvolle vorming en eiwitintegratie van de blaasjes bevestigen. De lipiden werden gelabeld met 0,4 mol% ATTO 488-DPPE en het eiwit werd covalent gelabeld via rhodamine NHS-estermodificatie van primaire amines. Figuur 2a en figuur 2b to...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

Dit protocol maakt gebruik van agarose zwelling als een krachtige en generaliseerbare techniek voor het opnemen van integrale membraaneiwitten (GMP's) in gigantische unilamellaire lipide blaasjes (GUVs), zoals hier beschreven voor de reconstructie van het menselijke 1A serotoninereceptoreiwit (5-HT1AR), een van de klassen van farmacologisch belangrijke G-eiwit-gekoppelde receptoren.

Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

Het bestuderen van integrale membraaneiwitten in hun oorspronkelijke omgeving was een uitdaging vanwege de complexiteit van het plasmamembraan. Gigantische unilamellaire lipide blaasjes, of GUVs, zijn een van de meest prominente platforms om biomembraaneigenschappen te bestuderen en ze kunnen worden ontworpen om verschillende fysiologische omstandigheden na te bootsen. Dit protocol beschrijft een methode om eiwit-geïncorporeerde GUVs te fabriceren op basis van spontane integratie, na hydrogelzwelling. Traditionele methoden om GUVs te fabriceren zijn niet generaliseerbaar voor integrale membraaneiwitincorporatie. Deze methoden zijn vaak laag rendement, methodologisch complex en ad hoc, niet van toepassing op brede klassen van eiwitten. Aan de andere kant vertegenwoordigt dit protocol een flexibele, robuuste en eenvoudige methode om functionele integrale membraaneiwitten op te nemen in GUVs.We hebben dit bereikt door een hydrogelsteiger te bereiden, die het eiwit bevat en er een dunne laag lipide bovenop afzet. In het hier gepresenteerde voorbeeld hebben we G-eiwitgekoppelde receptor, of GPCR, opgenomen in de GUVs.Bij rehydratatie van het hele systeem, GUVs knop van het oppervlak van de hydrogel met het membraan dat goed georiënteerde GPCR's bevat.Laat alle reagentia op kamertemperatuur komen. Reinig gedurende deze tijd de afdeksels door ze in methanol te plaatsen en gedurende 30 minuten bij 40

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Unit 1

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Spiraalvormige Organisatie van Blood stollingsfactor VIII op Lipid nanobuisjes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Bouw en karakterisatie van een nieuw Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Voorbereiding van de Light-responsieve membranen door een gecombineerde oppervlakte-enting en Postmodification Proces

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembraan Fabrication door de Solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetische levitatie In combinatie met Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Synthese van Hydrogels met Antifouling eigenschappen membranen voor waterzuivering

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

Constructie en opstelling van een Benchschaal Alg Photosynthetic Bioreactor met Temperatuur, Licht en pH Monitoring voor Kinetische Groeitesten

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...