Name: construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

אנו מודים למת'יו בלוסר על דיון ועצות יקרות ערך. עבודה זו נתמכה על ידי המשרד למחקר ימי (N00014-16-1-2382) והקרן הלאומית למדע (PHY-1915017).

1. תיוג חלבונים
<ol><li>אפשר NHS-רודמין, שברי ממברנה 5-HT1A , ועמוד התפלה אחד 7 K MWCO ספין להתפלש בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש להמיס 1 מ"ג NHS-רודמין ב-100 מיקרו-לן של דימתיל סולפוקסיד (DMSO).</li>
	<li>הוסף 5 μL של פתרון 1 M נתרן ביקרבונט כדי להגדיל את ה- pH של פתרון 5-HT1AR ל- pH 8.</li>
	<li>הוסף 3.66 μL של פתרון NHS-רודמין ל ...

זיהינו שני שלבים קריטיים להצלחת הפרוטוקול הכולל: טיפול בפלזמה ותצהיר שומנים. ניקוי פלזמה של כיסויים חיוני כדי להבטיח שיש כיסוי נאות והידבקות של הידרוג'ל אגרוז לכיסוי הזכוכית. ניקוי פלזמה משיג שני דברים: ראשית, הוא מסיר עקבות של חומר אורגני מפני השטח של הזכוכית; שנית, הוא מפעיל את משטח הכיסו...

ממברנות מודל סינתטי הם כלים רבי עוצמה בחקירה של המאפיינים הבסיסיים ואת הפונקציות של biomembranes. שלטי ענק חד-צדדי (GUVs) הם אחת הפלטפורמות הבולטות ביותר לחקר מגוון תכונות קרום פלזמה וניתן להנדסן כדי לחקות מצבים פיזיולוגיים שונים1,2,3,4,5,6,7,8. הוא מבוסס היטב כי קרום הפלזמה והארגון שלה לשחק תפקיד מפתח בהמון של תהליכים תאיים, כגון העברת אותות, הידבקות, אנדוציטוזיס, ותחבורה9,10,11,12,13,14,15.
GUVs כבר מפוברק בשיטות שונות, כולל הידרציה עדינה16, נפיחות הידרוג'ל17, electroformation18, טכניקות מיקרופלואידיות19,20,21,22, jetting23, וחילופי ממס24,25,26. בשל אתגרים בטיפול בחלבוני ממברנה אינטגרליים (IMPs), פלטפורמות במבחנה לחקור אותם הוגבלו. GUVs מציגים פלטפורמה פשוטה לחקר IMPs בסביבה המחקה את הסביבה המקורית שלהם. למרות שהיו מספר גישות לחזרת חלבונים ב- GUVs, אתגרים נובעים משלב חלבונים עם הכיוון הנכון ושמירה על פונקציונליות חלבון27.
שחזור החלבון המוצלח ביותר ב- GUVs דורש את שיטת החלפת חומרי הניקוי; אשר כרוך solubilizing החלבונים מהסביבה הטבעית שלהם על ידי דטרגנטים, ואחריו טיהור חלבון, ולאחר מכן החלפת מולקולות דטרגנט עם שומנים באמצעות שיטות שונות28. בעוד חומרי ניקוי משמשים לייצוב המבנה שלישוני של IMPs במהלך הטיהור, micelles דטרגנט הם סביבה לא טבעית יחסית עבור חלבונים אלה, אשר מיוצבים טוב יותר, במיוחד עבור מחקרים פונקציונליים, ב bilayers השומנים28,29,30. יתר על כן, שילוב חלבוני טרנסממברן פונקציונליים לתוך bilayer השומנים באמצעות טכניקות ייצור GUV מסורתיות היה קשה בשל הגודל, העדינות של חלבונים אלה, ואת צעדי החלפת דטרגנט נוספים כי יהיה צורך27,31,32,33. השימוש בממס אורגני להסרת חומרי ניקוי גורם לצבירה של חלבונים ודנטורינג34. שיטה משופרת בתיווך דטרגנט מבטיחה, עם זאת, יש צורך בזהירות עבור שלב הסרת חומרי ניקוי ואופטימיזציה עשויה להיות נחוצה עבור חלבונים ספציפיים31,35. בנוסף, שיטות המשתמשות electroformation יכול להגביל את הבחירה של חלבון ולא יכול להיות מתאים לכל הרכבי השומנים טעונים במיוחד שומנים טעונים31,36,37. טכניקה נוספת בה נעשה שימוש היא היתוך המושרה בפפטיד של שלשלות חד-צדדיות גדולות (LUVs) המכילות את החלבון הרצוי עם רכבי שטח, אם כי נמצא כי הוא מייגע ויכול להוביל להכנסת מולקולות זרות - הפפטידים הפוסובגניים33,38,39. שלל קרום פלזמה ענק (GPMVs), אשר נגזרים תאים חיים, ניתן להשתמש כדי להתגבר על חלק מבעיות אלה, אולם הם מאפשרים שליטה מינימלית של השומנים וחלבון התוצאה14,40,41. לכן, שילוב של IMPs בשכבה הדו-ליפידית של GUVs באמצעות שיטת הנפיחות האגרוז המותאמת שלנו מציג שיטה אמינה לבחון עוד יותר חלבונים אלה בסביבת הממברנה42,43,44,45.
איתות ותקשורת תאית כוללת משפחה של חלבונים המכונה קולטנים מצמידי חלבון G (GPCRs); GPCRs הם בין המשפחה הגדולה ביותר של חלבונים והם קשורים עם מצב רוח מווסת, תיאבון, לחץ דם, תפקוד לב וכלי דם, נשימה, ושינה בין פונקציות פיזיולוגיות רבות אחרות46. במחקר זה, השתמשנו קולטן סרוטונין אנושי 1A (5-HT1AR) שהוא חבר טיפוסי של משפחת GPCR. 5-HT1AR ניתן למצוא במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית) וכלי הדם; זה משפיע על פונקציות רבות כגון קרדיווסקולרי, העיכול, תפקודים אנדוקריניים, כמו גם השתתפות ברגולציה של mood47. מחסום גדול למחקר GPCR נובע מהמבנה האמפיפילי המורכב שלהם, ו- GUVs מציגים פלטפורמה מבטיחה לחקירה של תכונות שונות של עניין, החל מפונקציונליות חלבון, אינטראקציות בין חלבון שומנים לחלבון ואינטראקציות חלבון-חלבון. גישות שונות נוצלו לחקר אינטראקציות בין חלבון שומנים לשומנים כגון תהודה פלסמון פני השטח (SPR)48,49, ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR)50,51, שכבת-על שומנים חלבונית (אש"ף) 51,52,53,54, ספקטרומטריית מסת מקומית55, קלורימטריה איזותרמית (ITC)56,57, וליפוזום מטען מטען 58,59. המעבדה שלנו השתמשה בגישת ה- GUV הפשוטה כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות חלבון שומנים על פונקציונליות החלבון על ידי תקציר BODIPY-GTPγS, אשר נקשר עם Giα subunit במצב הפעיל של הקולטן. הכריכה שלהם מרוקנת את הפלורופור ומייצרת אות פלואורסצנטי שניתן לזהות לאורך זמן45. יתר על כן, מחקרים שונים חקרו אינטראקציות חלבון השומנים ואת התפקיד של חלבונים חישה או ייצוב עקמומיות ממברנה60,61, וניצול גישת GUV אפשרי יכול להיות יתרון מרכזי.
פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה לשלב GPCRs לתוך הממברנה של GUVs באמצעות מערכת הידרוג'ל אגרוז שונה17,42. יתר על כן, בהתבסס על העבודה הקודמת שלנו, השיטה שלנו יכולה להיות מתאימה IMPs שיכול לשאת חשיפה לטווח קצר 30-40 °C (50 °F). בקצרה, אנו מפיצים סרט דק של אגרוז בשילוב עם שברי ממברנה המכילים את GPCR של עניין. לאחר ג'לציה של שכבה זו, אנו מפקידים תמיסת שומנים על גבי agarose ולאפשר ממס להתאדות. התייבשות של המערכת בוצעה אז עם חוצץ מימי, וכתוצאה מכך היווצרות של GUVs עם חלבון משולב bilayer השומנים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

חקירות במבחנה איתנה של המבנה והתפקוד של חלבוני ממברנה אינטגרליים היוו אתגר בשל המורכבות של קרום הפלזמה והגורמים הרבים המשפיעים על התנהגות החלבון בתאים חיים. שלטי ענק חד-צדדי (GUVs) הם מערכת מודל מימטיקה וטופילית מאוד במבחנה לחקירת אינטראקציות בין קרום חלבון וחיקור התנהגות חלבונים באופן מדויק ותלוי גירוי. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה זולה ויעילה לייצור GUVs עם קולטן סרוטונין 1A האנושי (5-HT1AR) משולב ביציבות בממברנה. אנו מייצרים ג'וונים בשיטת נפיחות הידרוג'ל מותאמת; על ידי הפקדת סרט שומנים על גבי תערובת של agarose ו 5-HT1AR ולאחר מכן לחות המערכת כולה, שלל ניתן ליצור עם כוון כראוי ופונקציונלי 5-HT1AR משולב לתוך הממברנה. לאחר מכן ניתן להשתמש ב- GUVs אלה כדי לבחון אינטראקציות בין קרום חלבון והתנהגות לוקליזציה באמצעות מיקרוסקופיה. בסופו של דבר, פרוטוקול זה יכול לקדם את הבנתנו את הפונקציונליות של חלבוני ממברנה אינטגרליים, ומספק תובנה פיזיולוגית עמוקה.

ריכוז החלבון נמדד, ומידת התיוג חושבה כיחס הטוחנת בין הצבע לחלבון להיות 1:1. על ידי בחינת ה- GUVs באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, הצלחנו לאשר היווצרות מוצלחת ושילוב חלבונים של שלשלות. השומנים סומנו עם 0.4 מול% ATTO 488-DPPE, והחלבון תויג באופן קוולנטי באמצעות שינוי רודמין NHS-אסתר של אמינים ראשוניים. <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

פרוטוקול זה משתמש נפיחות agarose כטכניקה רבת עוצמה להכללה לשילוב חלבונים ממברנה אינטגרלית (IMPs) לתוך שלפוחיות שומנים חד-צדדיות ענקיות (GUVs), כפי שתואר כאן עבור שחזור של חלבון קולטן סרוטונין האדם 1A (5-HT1AR), אחד מסוגי קולטני חלבון G חשובים מבחינה פרמקולוגית.

בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

חקר חלבוני ממברנה אינטגרליים בסביבתם הטבעית היה אתגר בשל המורכבות של קרום הפלזמה. שלל שומנים חד-צדדי ענק, או GUVs, הם אחת הפלטפורמות הבולטות ביותר לחקר תכונות biomembrane והם יכולים להיות מהונדסים לחקות תנאים פיזיולוגיים שונים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לפברק חלבונים משולבים GUVs המבוססת על שילוב ספונטני, לאחר נפיחות הידרוג'ל. שיטות מסורתיות לייצור GUVs אינן ניתנות להכללה עבור שילוב חלבון ממברנה אינטגרלי. שיטות אלה הן לעתים קרובות תפוקה נמוכה, מורכב מתודולוגית אד הוק, לא חל על סוגים רחבים של חלבונים. מצד שני, פרוטוקול זה מייצג שיטה גמישה, חזקה ופשוטה לשלב חלבוני ממברנה אינטגרליים פונקציונליים ב- GUVs.השגנו זאת על ידי הכנת פיגום הידרוג'ל, המכיל את החלבון, והפקדת שכבה דקה של שומנים עליו. בדוגמה המוצגת כאן, שילבנו קולטן G בשילוב חלבון, או GPCR, ב- GUVs.Upon rehydration של המערכת כולה, GUVs ניצנים מפני השטח של ההידרוג'ל עם הממברנה המכילה GPCRs מכוונת כראוי.אפשר לכל הריאגנטים להגיע לטמפרטורת החדר. במהלך תקופה זו, לנקות את כיסוי מחליק על ידי הצבת אותם מתנול sonicating במשך 30 דקות ב 40

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Unit 1

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

שימוש בBiosensors האופטי ללא תווית לזיהוי מודולציה של תעלות אשלגן על ידי קולטנים מצמידים G-חלבון

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

בנייה ואפיון של Bioreactor פולד רומן וקאלי

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

הכנה של ממברנות אור תגובה על ידי הארכת משטח משולבת ותהליך Postmodification

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

ריחוף מגנטי יחד עם הדמיה ניידת וניתוח עבור אבחון מחלות

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

סינתזה של הידרוג עם מאפייני Antifouling ופלטות לטיהור מים

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

בנייה והתקנה של אלגורית מידה של אלגוריה ביאוריאקטור פוטוסינתטי עם טמפרטורה, אור, וניטור pH עבור בדיקות צמיחה קינטית

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...